Name: Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua) 6 -tagged proteina ricombinante Shadoo Espresso come corpi di inclusione in E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Impara a purificare la proteina ricombinante Shadoo espressa come corpi di inclusione in E. coli e a ripiegarla in fibrille amiloidi. Questo metodo cromatografico rapido e conveniente facilita lo studio dei meccanismi molecolari dei disturbi conformazionali delle proteine.

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Gli autori ringraziano Natalie Doude e David Westerway (Università di Alberta) per averci fornito Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) per la costruzione dei plasmidi, Michel Brémont (INRA) per averci fornito i batteri BL21Sol; Christine Longin (INRA) per l'assistenza GST e Edith Pajot-Augy (INRA) per i commenti e la correzione di bozze.

1. Generazione di plasmidi e Shadoo Expression Nota: Il gene che codifica la proteina murino Shadoo (Shadoo 25-122), è stato subclonato nel vettore di espressione pET-28 11. Questo clone è stata trasformata in E. coli SoluBL21 ceppo batterico, per esprimere la proteina Shadoo con un tag hexahistidine N-terminale, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), come spiegato in precedenza 11. Il plasmide può essere richiesto da parte degli autori. Il peso molecolare di Shadoo calcolata dalla sua sequenza aminoacidica è 12,243.2 Da. Nota: Eseguire tutte le manipolazioni con i batteri sotto una cappa a flusso laminare o in prossimità di Bunsen fiamma. <ol><li> Trasforma batteri SoluBL21 competenti con la PET-28-Il suo 6 -Shadoo plasmide, utilizzando un protocollo shock termico standard. Per questo mix 1 a 5 ml di plasmide (tipicamente 10 a 100 pgng) in 50 ml di batteri in un tubo. Eseguire lo shock termico a 42 ° C per 45 sec. </li><li> Cultura batteri trasformati a 37 ° C fino a 600 di 0,5-0,7 in Luria Bertani-mezzo supplementato con 40 mg / ml kanamicina (Figura 1B). </li><li> Indurre Shadoo espressione O / N con l&#39;aggiunta di 240 mg / ml isopropilico-β-D-thiogalactopyranoside, ITPG, alla cultura. Batteri Cultura sotto agitazione a 150 rpm a 37 ° C. Nota: In genere, la coltura batterica raggiunge A 600 3 O / N. Nota: Trasformato batteri possono essere conservati a -80 ° C per la futura produzione di proteine. Per questo, aggiungere 10% -50% (v / v) di glicerolo sterile in aliquote coltura batterica e congelarli a -80 ° C. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di Shadoo espressione costrutto, batteri trasformazione e l&#39;induzione dell&#39;espressione Shadoo (come descritto al punto 1). </strong&gt; (A) Il costrutto di espressione per Shadoo codifica un tag hexahistidine fusa all&#39;N-terminale della proteina, Nt. Lo schema mostra che le proteine ​​Shadoo contiene ripetizioni base arginina / glicina (cilindro verde), un dominio idrofobico (HD), e un singolo sito N-glicosilazione (CHO), seguiti da un C-terminale (Ct). (B) pET-28-Il suo 6 -Shadoo plasmide si trasforma in batteri SoluBL21 da shock termico per 45 secondi a 42 ° C. Batteri trasformati sono placcati su agar selettivo contenente 40 mg / ml kanamicina. Una singola colonia dalla piastra è usata per inoculare una coltura in una beuta agitatore 1000-3000 ml. L&#39;espressione della proteina ricombinante è indotta con 1 mM IPTG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Purificazione di Shadoo proteine ​​da bassa pressione cromatografia liquida (LPLC) <ol><li> Lisi cellulare e inconclusione corpi preparazione <ol><li> Raccogliere la sospensione batterica e le trasferisce in tubi centrifugazione (Figura 2). </li><li> Spin a 2.500 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante per decantazione e risospendere pellet in 15 ml di tampone (50 mM Tris, EDTA 10 mM, pH 8 con anti-proteasi cocktail) per ogni pastiglia derivata da 500 ml di coltura cellulare. Nota: precipitato risospeso possono essere congelati e conservati a -20 ° C per diversi giorni. Congelamento facilita cellule batteriche lisi. </li><li> Controllare la sovra-espressione della proteina ricombinante utilizzando batteri greggio pellet mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie. <ol><li> Per questo, centrifuga 1 ml di coltura batterica a pellet cellule. Aggiungere 100 microlitri soluzione Laemmli denaturazione (277,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% w / v glicerolo, 0,02% blu di bromofenolo) a pellet e riscaldare a 100 ° C per 5 min. </li><li> Carico 10 ml di campione ad un gel di acrilammide 12%, eseguire SDS-PAGE e visuAlize proteine ​​separate da Coomassie colorazione. </li></ol></li><li> Aggiungere Triton X-100 a concentrazione finale 0,5% al ​​pellet risospeso completamente dalla 2.1.2). </li><li> Incubare la sospensione in bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min. </li><li> Sonicare la sospensione per 5 minuti a 6-12 micron ampiezza picco-picco in acqua ghiacciata per lisare le cellule batteriche. </li><li> Trasferimento sonicata sospensione nella pulite provette da 50 ml di centrifugazione. </li><li> Tubi centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante per decantazione e aggiungere 5 ml di tampone di legame (20 mM tampone Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea, imidazolo 5 mM) per provetta. </li><li> Tubi immettono sul rotante volante O / N di proteine ​​da corpi di inclusione risospendere completamente. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di purificazione di inclusioneorgani (come descritto al punto 2.1). trasformate batteri esprimenti Shadoo vengono raccolte per centrifugazione e risospese in tampone di lisi. La sospensione viene incubata a 37 ° C per 30 minuti, e quindi sonicato per rompere meccanicamente cellule batteriche. Sonicazione è fatto su ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione. Celle rotte sono raccolte per centrifugazione e risospese in un tampone contenente 8 M di urea per solubilizzare proteine ​​da corpi inclusi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </li><li> Cromatografia Ni 2+ -affinity Nota: Cromatografia viene eseguita utilizzando un sistema FPLC Ni 2+ -charged, 5 ml Sepharose colonna chelante (Figura 3A). Tutte le soluzioni vengono caricati sulla colonna con una portata di 1 ml / min. <ol><li> Iniettare 10 ml di 0,2 M Niso soluzione 4 acqua nella colonna Sepharose per caricarlacon ioni Ni 2+. </li><li> Equilibrare la colonna caricata con Ni 2+ ioni iniettando 30-50 ml di tampone di legame contenente una bassa concentrazione di imidazolo (20 mM tampone Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea, imidazolo 5 mM). </li><li> Caricare le proteine ​​urea-solubilizzato con un sistema di iniezione 50 ml. </li><li> Recupero della frazione flow-through lavando a fondo la colonna con 10 ml bassa imidazolo tampone di legame (20 tampone mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea, 5 Imidazole mM) al fine di rimuovere un massimo di proteine ​​non legate dalla colonna. </li><li> Lavare la colonna con 50-100 ml di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 80 mM imidazolo) per eluire le proteine ​​non specificamente legato alla colonna. </li><li> Applicare 15 min gradiente lineare di 80-800 mM imidazolo in tampone contenente 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea. Raccogliere 1 ml frazioni durante l&#39;applicazione del gradiente. Nota: proteine ​​His-tag vengono eluiti ingegnoha pendenza di tampone contenente imidazolo-(utilizzata come concorrente). </li><li> Prendete una un&#39;aliquota 8 microlitri di ogni frazione e aggiungere 4 ml soluzione denaturazione 4x Laemmli (vedi 2.1.3.1). Soluzioni di calore a 100 ° C per 5 min. </li><li> Carico 10 ml di dimensioni proteine ​​marcatore e 10 ml di ogni campione al gel di acrilammide al 12%, eseguire SDS-PAGE e visualizzare le proteine ​​separate da Coomassie colorazione. Nota: Il peso molecolare di Shadoo calcolato formano la sua sequenza di aminoacidi è 12,243.2 Da. </li><li> Piscina tutte le frazioni contenenti Shadoo. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig3.jpg" /> Figura 3. procedura di purificazione (come descritto nei punti 2.2-2.4). (A) Ni 2+ ioni possono essere coordinati da residui di istidina, che permette la purificazione selettiva di proteine ​​polyhistidine-tag. Imidazolo è usato per eluire la proteina, attraversola sua capacità di coordinare con il 2+ -ion Ni e spostare la proteina legato. (B) Proteine ​​di varia raggio idrodinamico che sono stati presenti a Ni 2+ -column sono separati su una colonna esclusione dimensioni. Le proteine ​​vengono eluite dal più grande al quelle più piccole. (C) Prima dell&#39;uso, frazioni contenenti Shadoo sono raggruppati e dissalate per rimuovere l&#39;urea, imidazolo e sali. Saggi di controllo qualità includono SDS-PAGE / Coomassie colorazione, Western blotting. Purificata Shadoo può essere liofilizzato. Liofilizzato Shadoo è stabile per mesi se conservato a -20 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </li><li> Cromatografia di esclusione Nota: Una seconda fase di purificazione consiste nella cromatografia di esclusione dimensionale che separa proteine ​​Shadoo dalle altre proteine ​​co-eluite durante la prima fase di purificazione(Figura 3B). <ol><li> Equilibrare Superdex colonna 120 ml di volume totale letto iniettando 250 ml di tampone 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea alla portata di 1,5 ml / min. </li><li> Carica frazioni pool contenenti Shadoo dalla 2.2.9 alla colonna equilibrata. Raccogliere 1 ml frazioni dopo il volume vuoto della colonna 40 ml al flusso costante del buffer sopra. </li><li> Prelevare un&#39;aliquota 10 microlitri di ogni frazione ed effettuare un&#39;analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie come descritto sopra per scoprire quale frazioni contengono Shadoo. </li><li> Piscina frazioni contenenti Shadoo. </li></ol></li><li> Dissalazione Nota: Procedura Desalting rimuove sali, imidazolo e l&#39;urea per ottenere proteine ​​Shadoo ricombinante in un buffer adatto per ulteriori studi biofisici e biochimici (Figura 3C). Lo stesso risultato può essere ottenuto campioni dialisi contro tampone. <ol><li> Equilibrare una colonna dissalazione di 53 ml con 150 ml10 mM di tampone di acetato di ammonio, pH 5, a velocità di flusso di 5 ml / min. </li><li> Carico pool frazioni Shadoo sulla colonna. Dopo iniezione del tampone acetato di ammonio raccogliere manualmente frazioni che mostrano un aumento del segnale a 280 nm in uscita del rivelatore UV. </li><li> Liofilizzare il Shadoo dissalato e conservarlo a -20 ° C. </li><li> Sciogliere Shadoo liofilizzata in un buffer adeguata, ad esempio 10 mM di tampone sodio acetato, pH 5, prima dell&#39;uso. Nota: Il tag polyhistidine può essere rimosso con enterokinase. </li></ol></li></ol> 3. In Vitro Assemblaggio di Shadoo in amiloide fibrille a pH fisiologico Nota: I aggregati proteici Shadoo e spontaneamente forme fibrille a pH ≥ 7 11. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig4.jpg" /> Figura 4. Schema di Shadoo ripiegamento di fibrille amiloidi (come descriLetto al punto 3). purificato Shadoo converte spontaneamente di fibrille amiloidi quando disciolto in tampone a pH ≥ 7. In una soluzione acida, Shadoo converte in fibrille amiloidi su incubazione con 1 M Gdn-HCl agitando. Test di controllo di qualità sono la microscopia elettronica e ThT colorazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Diluire Shadoo ad una concentrazione finale di 2 mM in tampone 20 mM Tris-HCl, pH 7.4. Misurare la concentrazione misurando la densità ottica della soluzione a 280 nm ed utilizzando il coefficiente di estinzione dedotta dalla composizione aminoacidica Shadoo di 20.970. </li><li> Incubare 500 microlitri della soluzione in un tubo di plastica conica a 4 ° C per due settimane, per consentire la conversione spontanea proteine ​​per strutture amiloidi (Figura 4). </li><li> Aggiungere appena preparato thioflavin T (ThT) per una conce finalentration di 10 mM di un&#39;aliquota di 100 microlitri della soluzione Shadoo. Incubare la soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente. Misurare emissione di fluorescenza da 460 a 520 nm con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 435 nm per verificare la presenza di strutture amiloidi 17. </li></ol> 4. In Vitro Assemblaggio di Shadoo di amiloide fibrille a pH acido <ol><li> Diluire Shadoo in 1 M GdnHCl, tampone 20 mM Na-acetato, pH 5 per una concentrazione finale di 2 mM. </li><li> Incubare 500 ml di questa soluzione in un tubo conico con agitazione continua a 37 ° C, per 3-7 giorni. </li><li> Controllare la presenza di fibrille amiloidi aggiungendo ThT ad un&#39;aliquota della soluzione, come in 3.3. </li><li> Dializzare sospensione ottenuta contro 10 mM tampone Na-acetato, pH 5,0, per purificare Shadoo fibrille amiloidi. </li><li> Conservare fibrille purificati a +4 ° C. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig5.jpg"/&gt; Figura 5. Risultati rappresentativi. Frazioni proteiche eluite da Ni 2 + -charged colonna chelante (A) e della colonna esclusione dimensione (B) sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE e colorazione Coomassie. Identificazione di Shadoo purificato è stata valutata utilizzando SPRN anticorpo anti-Shadoo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un protocollo semplice ed efficace sia per l&#39;espressione e la purificazione di una grande quantità di topo ricombinante proteina Shadoo è presentato. Il metodo descritto consente solubilizzazione successo e purificazione (His 6) -tagged proteina Shadoo ricombinante. È importante, come indicato nel titolo, che quando espresso in un batterio E. procariotico coli Shadoo accumula nei corpi di inclusione. Prima Shadoo purificazione, i batteri devono essere lisate per sonicazione in un tampone...

Prion malattie neurodegenerative, tra cui l&#39;encefalopatia spongiforme bovina nel bestiame, la scrapie ovina, malattia di Creutzfeldt-Jakob negli esseri umani, sono fatali e incurabile. Le malattie da prioni sono caratterizzate da cambiamenti conformazionali di proteina prionica cellulare principalmente composti da alfa-eliche, in cross-β-sheet arricchito amiloide conformer 1,2. Cross-beta-strutture contengono densamente imballati e beta-sheets cristallini come altamente ordinati stabilizzati con legami idrogeno 3,4. Amiloidi da prioni grado di autoreplicarsi causa delle beta-filoni sul bordo crescente che forniscono un modello per il reclutamento e la conversione di un&#39;unità proteina monomerica. Secondo l&#39;ipotesi &quot;unica proteina&quot;, conformero amiloide della proteina prionica è l&#39;unico agente infettivo. Tuttavia, alcune altre biomolecole sono state proposte per essere essenziali per disturbi prioni. Ad esempio, le membrane cellulari si pensa di essere un luogo in cui conversiin si svolge e alcuni lipidi caricati negativamente hanno dimostrato di migliorare il processo di conversione 5,6. Inoltre, alcune proteine ​​possono anche essere coinvolti in patologie da prioni. In particolare, ci sono altri due membri della famiglia proteina prionica: Doppel e Shadoo 7,8. Doppel ha una struttura relativamente rigida stabilizzata con ponti di-solfuro e non riesce ad auto-polimerizzarli e aggregata per fibrille amiloidi 9. In contrasto, simile alla proteina prionica, Shadoo può adottare una struttura β-sheet arricchito e di auto-associate in strutture fibrille amiloidi. È stato dimostrato che Shadoo può fibrillazione in condizioni native o dal legame membrane con carica negativa 10,11. Conversione di Shadoo in fibre amiloidi simili può essere associato a patologie. Infatti, i meccanismi con cui le strutture amiloidi simili causano la malattia sono poco conosciuti. Shadoo porta un dominio idrofobico (HD) e una serie di tandem Arg / Gly ripete simile to la parte N-terminale della proteina prionica (Figura 1A). Poiché la parte N-terminale della proteina prionica, Shadoo è altamente caricato positivamente e sembra essere una proteina nativa strutturati 11,12. Shadoo sembra essere funzionalmente correlati a disturbi da prioni dal momento che può legarsi direttamente proteina prionica. Inoltre, la sua espressione è regolata giù durante prioni patologia 13,14. Tuttavia, il ruolo di Shadoo in malattie da prioni non è ancora stabilita. Abbiamo sviluppato un plasmide che porta la sequenza codificante del gene murino Shadoo. Il plasmide è stato usato per trasformare E. coli per la produzione di N-terminale suo 6 proteina di fusione Shadoo. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio ed è comunemente usato nei nostri progetti in corso 6,15,16. Una questione importante per l&#39;espressione del Shadoo è la scelta del E. coli. Mentre BL21 competente ceppo batterico è comunemente utilizzato per l&#39;espressione di pro ricombinanteproteine ​​Shadoo è stato espresso con successo e purificato solo dal ceppo batterico trasformato SoluBL21. SoluBL21 competente E. coli è una migliore mutante di ceppo ospite BL21 sviluppato per la produzione di proteine ​​la cui espressione nel BL21 genitore non dava prodotto solubile rilevabile. Espressione ad alto livello di Shadoo in SoluBL21 E. coli porta all&#39;accumulo della proteina in corpi di inclusione. Come caratteristica generale, quando una proteina non nativo è altamente espresso in E. coli, questa proteina si accumula nei corpi di inclusione insolubili. Shadoo probabilmente aggrega attraverso interazioni non covalenti idrofobiche o ionici (o una combinazione di entrambi) strutture dinamiche altamente arricchito formata dalla proteina ripiegata a vari gradi. Di conseguenza, la purificazione comprende almeno due fasi: (i) una separazione selettiva della proteina da altre biomolecole in un mezzo denaturazione, e (ii) un rinaturazione della proteina purificata mediante piegatura in vitrotecniche. La separazione selettiva di Shadoo è stato ottenuto in una soluzione tampone contenente urea 8M (o in alternativa 6M guanidina-HCl). La rimozione di urea e rinaturazione della proteina può essere fatto mediante diversi protocolli: (i) rinaturazione in una soluzione a pH acido per ottenere una proteina non strutturata Shadoo monomerica, o (ii) rinaturazione in una soluzione di pH ≥ 7 per ottenere Shadoo polimerizzato in fibre amiloidi stabili con caratteristici motivi cross-β-sheet.

<table><tbody><tr><td>AKTA FPLC&nbsp;</td><td>GE, Amersham</td><td># 1363</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0920-05</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep26/10 Colonna di desalinizzazione</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>SoluBL21 Competente E. coli</td><td>Genlantis</td><td>C700200</td><td></td></tr><tr><td>pET-28b+</td><td>Novogen</td><td>69865-3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Brodo medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biofotometar</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td></td></tr><tr><td>Trito X-100</td><td>Life Technologies</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>NiSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich RES3098T</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compresse di Cocktail di Inibitori della Proteasi</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gdn-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>marcatore di dimensione della proteina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>26620</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged proteina ricombinante shadoo espresso come corpi di inclusione in<em&gt; e. coli</em

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Il sistema di espressione coli Escherichia è uno strumento potente per la produzione di proteine ​​eucariotiche ricombinanti. Lo usiamo per produrre Shadoo, una proteina appartenente alla famiglia prione. Un metodo cromatografico per la purificazione di (suo) 6 -tagged Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione è descritto. I corpi di inclusione vengono solubilizzati in 8 M urea e legati ad un 2+ colonna -charged Ni eseguire cromatografia di affinità ionico. Proteine ​​legate sono eluite da un gradiente di imidazolo. Le frazioni contenenti proteine ​​Shadoo mediante cromatografia di esclusione dimensionale per ottenere una proteina altamente purificata. Nella fase finale è purificato Shadoo dissalati per eliminare i sali, urea e imidazolo. Proteina ricombinante Shadoo è un reagente importante per gli studi biofisici e biochimici di disturbi conformazione della proteina che si verificano nelle malattie da prioni. Molti rapporti hanno dimostrato che le malattie neurodegenerative da prioni provengono dalla deposizione di pugnalatale, ordinò fibrille amiloidi. Protocolli di esempio descrivono come alla fibrillazione Shadoo in fibrille amiloidi in acido e neutro / pHs di base sono presentati. I metodi su come produrre e fibrillazione Shadoo può facilitare la ricerca in laboratori che lavorano su malattie da prioni, in quanto consente per la produzione di grandi quantità di proteine ​​in maniera rapida e basso costo.

Circa 5-10 mg di proteine ​​Shadoo purificato viene ottenuto per litro di coltura batterica. Una purificazione a due fasi è necessario per ottenere Shadoo ricombinante di elevata purezza. Il primo passo è effettuata mediante cromatografia di affinità con un Ni 2 + colonna -charged che conserva i suoi-proteine ​​taggati. Frazioni eluite sono sottoposti a SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Brilliant Blue (Figura 5A). Le frazioni contenenti proteine ​​Shadoo sono raggruppati e ulteriormente pu...

Viene descritto un metodo cromatografico in due fasi per la purificazione della proteina Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione in Escherichia coli, nonché un protocollo per fibrillare Shadoo purificato in strutture amiloidi.

Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged proteina ricombinante Shadoo Espresso come corpi di inclusione in<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

L'obiettivo generale di questa procedura è purificare una proteina shadu ricombinante espressa come corpi di inclusione in Esia coli e ripiegare la proteina in fibrille amiloidi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei meccanismi molecolari dei disturbi conformazionali delle proteine, come quelli che si verificano nelle malattie pre. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la produzione di grandi quantità di proteina in modo rapido e a basso costo. Per trasformare batteri competenti solu BBL 21 con il plasmide PET 28, his sei SHADU, mescolare da 10 a 100 picogrammi di plasmide oppure da uno a cinque microlitri in 50 microlitri di batteri in un tubo.Incubare le cellule a 42 gradi Celsius per 45 secondi. Aggiungere mezzo LB integrato con 40 milligrammi per millilitro di canamicina e batteri, quindi coltivare. Coltivare i batteri trasformati a 37 gradi Celsius fino a quando non raggiungono un'assorbanza compresa tra 0,5 e 0,7 a 600 nanometri, quindi indurre l'espressione del transgene aggiungendo 240 microgrammi per millilitro di IPTG e continuare la coltura.I batteri a 37 gradi Celsius e 150 giri al minuto durante la notte. Per purificare la proteina, trasferire la sospensione batterica in provette da centrifuga e centrifugare a 2.500 ×g e 4 gradi Celsius per 20 minuti. Utilizzare 15 millilitri di tris 50 millimolare, 10 millimolare di EDTA a pH 8 e cocktail di proteasi per risospendere.Ogni pellet ottenuto da 500 millilitri di coltura cellulare. Dopo aver verificato la sovraespressione, secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere Triton X-100 ai pellet risospesi a una concentrazione finale dello 0,5%. Quindi incubare la sospensione in un bagno termico a 37 gradi Celsius. Successivamente, sottoporre la sospensione a sonica in acqua ghiacciata da sei a 12 micron.Ampiezza del picco massima per cinque minuti per frammentare le cellule batteriche. Trasferire quindi la sospensione sottoposta a sonica in provette da centrifuga pulite da 50 millilitri. Centrifugare le provette a 15.000 ×g e 4 gradi Celsius per 15 minuti.Decantare per rimuovere il sopranatante S e aggiungere cinque millilitri di tampone di legame per ogni provetta. Posizionare le provette sulla ruota rotante durante la notte per risospendere completamente le proteine dai corpi di inclusione. Per eseguire la cromatografia al nichel.Introdurre 10 millilitri di soluzione acquosa 0,2 molare di solfato di nichel nella colonna spheros per caricarla con ioni nichel. Equilibrare la colonna introducendo da 30 a 50 millilitri di tampone di legame con basso contenuto di ole. Successivamente, utilizzare un loop di iniezione per caricare le proteine solubilizzate con urea.Successivamente, lavare accuratamente la colonna con 10 millilitri di tampone di lavaggio a basso legame per rimuovere le proteine non legate. Quindi utilizzare da 50 a 100 millilitri di tampone di lavaggio per lavare la colonna ed eluire le proteine legate in modo non specifico. Per eluire la proteina con il tag istidina.Applicare un gradiente lineare di 15 millilitri di ole da 80 a 800 millimolari nel buffer di legame a una velocità di flusso di un millilitro al minuto. Raccogliere frazioni da un millilitro, aliquotare otto microlitri da ciascuna frazione in provette separate e aggiungere quattro microlitri di soluzione denaturante 4X. Successivamente, mantenere le provette a 100 gradi Celsius per cinque minuti.Eseguire la corsia STS facendo migrare 10 microlitri di marcatore e campioni su un gel di poliacrilammide al 12% e colorare con blu di kumasi. Il peso molecolare calcolato dell'ombra è di 12243,2 Dalton per pool. Equilibrare tutte le frazioni contenenti ombra per la cromatografia di esclusione dimensionale su una colonna SUEx con un volume totale della matrice di 120 millilitri, iniettando 250 millilitri di tampone tris, HCl 20 millimolari a pH 7,4 contenente 0,5 molarità di cloruro di sodio e otto molarità di urea, a una velocità di flusso di 1,5 millilitri al minuto.Caricare le frazioni di shadu raggruppate sulla colonna e, dopo aver eluito un volume vuoto della colonna di 40 millilitri, raccogliere frazioni da un millilitro della proteina. Dopo aver verificato le frazioni contenenti shadu, raggruppare nuovamente la proteina per desalinizzare il campione.Utilizzare 150 millilitri di acetato di ammonio 10 millimolare a pH 5 per equilibrare una colonna di desalinizzazione da 53 millilitri a una portata di 5 millilitri al minuto. Caricare la miscela sulla colonna di desalinizzazione utilizzando un rivelatore UV a 280 nanometri. Iniziare a raccogliere le frazioni che mostrano un aumento del segnale del rivelatore UV per assemblare shadow in amyloid fis.A pH fisiologico, utilizzare 20 micromoli di tris pH 7,4 per diluire l'ombra e misurare con uno spettrofotometro a 280 nanometri impiegando il coefficiente di estinzione dedotto dalla composizione in aminoacidi, pari a 20.970. Calcolare la concentrazione, trasferire 500 microlitri della soluzione in un tubo conico di plastica e incubare a quattro gradi Celsius per un paio di settimane per consentire la conversione spontanea della proteina in strutture amiloidi.Dopo l'incubazione, aggiungere tioflavina T o THT appena preparata a 100 microlitri di soluzione shadu. Quindi incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti. Misurare l'emissione fluorescente da 460 a 520 nanometri utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 435 nanometri per verificare la presenza di strutture amiloidi nell'assemblaggio di shadu in fibrille amiloidi a pH acidi.Diluire shadu in cloridrato di guanidina 1 M, acetato di sodio 20 mM, pH 5 fino a una concentrazione finale di 2 µM, trasferire 500 µL in un tubo conico e incubare con agitazione continua a 37 °C per tre a sette giorni. Verificare la presenza di fibrille amiloidi aggiungendo THT al campione e misurando la fluorescenza come appena illustrato. Infine, dializzare la sospensione contro un tampone di acetato di sodio 10 mM, pH 5,0 per purificare le fibrille amiloidi. Qui sono mostrate frazioni contenenti la proteina shadu con tag His6 raccolte mediante cromatografia di affinità e sottoposte a SDS-PAGE.In questa figura, le frazioni contenenti shadu sono state raggruppate e purificate mediante cromatografia a esclusione molecolare. Il peso molecolare di shadu è di 12 chilodalton. La presenza di shadu è stata inoltre verificata mediante blot di Western utilizzando un anticorpo specifico anti-shadu, SPRN, che si lega a un epitopo sensibile compreso tra gli amminoacidi 76 e 105 della regione C-terminale della proteina.In questo grafico, il ripiegamento della shadu in fibrille amiloidi è verificato mediante colorazione con THT. L'intensità aumenta in risposta alla conversione della shadu in strutture amiloidi. La microscopia elettronica con colorazione negativa verifica inoltre il ripiegamento della shadu in fibrille amiloidi seguendo questa procedura.Altri metodi, come quelli basati su microsferette magnetiche al nichel, possono essere eseguiti al fine di sostituire la colonna a affinità per il nichel dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biofisica e della biochimica proteica per esplorare in vitro diverse proteine coinvolte in vari ProPath.

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Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di...

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Le proteine possono adottare una struttura nativa o ripiegarsi erroneamente in amiloide insolubile. Le condizioni che favoriscono la via del ripiegamento errato portano alla formazione di diversi tipi di fibrille amiloidi. I metodi qui descritti consentono una rapida conversione di proteine native in amiloide in vitro.

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β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

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Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

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Impara a purificare la proteina ricombinante Shadoo espressa come corpi di inclusione in E. coli e a ripiegarla in fibrille amiloidi. Questo metodo cromatografico rapido e conveniente facilita lo studio dei meccanismi molecolari dei disturbi conformazionali delle proteine.

Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua) 6 -tagged proteina ricombinante Shadoo Espresso come corpi di inclusione in E. coli (Video) | JoVE Journal

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