Sviluppo di una striscia reattiva Immunocromatografico oro colloidale-based per il rilevamento di Cetacei mioglobina

L'obiettivo generale di questa striscia reattiva immunocromatografica all'oro colloidale è quello di differenziare la mioglobina dei cetacei da quella delle foche e di altri animali. Questo metodo può fornire uno screening rapido e in loco della carne di cetaceo, limitandone così il commercio e il consumo illegali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un risultato di successo può essere osservato direttamente in cinque-dieci minuti dopo l'omogeneizzazione di 03 grammi di muscolo, con eccezionale specificità e sensibilità.

Quindi questo metodo può fornire un rapido rilevamento della carne di cetacei sul campo. Può essere applicato anche ad altre carni come la carne di cavallo o di maiale. Per progettare peptidi sintetici per l'allevamento di anticorpi monoclonali con reattività verso la mioglobina dei cetacei, vengono analizzate le sequenze aminoacidiche delle regioni reattive antigeniche della mioglobina di vari animali.

Inizia recuperando da GenBank le sequenze aminoacidiche della mioglobina da tonno, pollo, struzzo, mammiferi domestici, foche e 18 specie di cetacei. Quindi, allinea le sequenze utilizzando il software appropriato. Avvia Esplora allineamento selezionando Allinea Modifica/Crea allineamento sulla barra di avvio.

Selezionare Crea nuovo tracciato e fare clic su OK. Apparirà una finestra di dialogo che chiede: stai costruendo un allineamento di sequenze di DNA o proteine? Fare clic sul pulsante Proteina, selezionare Apertura dati Recupera sequenze da file e selezionare il file di sequenza. Selezionare il comando di menu Modifica Seleziona tutto per selezionare tutti i siti per ogni sequenza nel set di dati per la creazione di un allineamento di sequenze multiple.

Seleziona Allineamento Allinea di ClustalW dal menu principale. Selezionare BLOSUM come matrice del peso delle proteine, quindi fare clic sul pulsante OK. Il terzo passo consiste nell'analizzare l'allineamento della sequenza.

Concentrati su cinque siti reattivi antigenici e trova il frammento conservato tra i cetacei. Un asterisco simboleggia il consenso nell'allineamento e indica una posizione che ha un singolo residuo completamente conservato. Sono stati trovati due frammenti conservati nei cetacei.

I frammenti di sequenza candidati vengono quindi sintetizzati e utilizzati per allevare anticorpi monoclonali. Iniziare questa procedura determinando il pH ottimale per la soluzione di oro colloidale, definito come il pH minimo che mantiene la miscela di anticorpi monoclonali e soluzione di oro colloidale di colore rosso per due ore. Aggiungere 0,15 microgrammi di anticorpo monoclonale rivelatore purificato a 100 microlitri di soluzione di oro colloidale con valori di pH variabili da cinque a nove.

Ai fini di questa dimostrazione, vengono testati il pH sei e il pH otto. Il pH otto è stato considerato il pH ottimale da questa fase di ottimizzazione. Successivamente, determinare la concentrazione ottimale dell'anticorpo monoclonale aggiungendo varie quantità di anticorpo monoclonale rilevante purificato a 100 microlitri di soluzione di oro colloidale a pH otto.

La concentrazione ottimale, che in questo studio è di sei microgrammi per millilitro, manterrà il colore della miscela rosso senza precipitato nero. Sulla base dei risultati delle fasi di ottimizzazione, aggiungere 60 microgrammi di anticorpo monoclonale di rilevamento purificato goccia per goccia a 10 ml di soluzione di oro colloidale. Emulsionare delicatamente il composto a temperatura ambiente per dieci minuti.

Aggiungere due millilitri di una soluzione al 5% di BSA in PBS alla miscela ed emulsionare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti per ridurre l'interferenza di fondo. Centrifugare la miscela a 10.000 volte g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante con l'anticorpo non coniugato e sospendere il pellet risultante in 4 ml di PBS-T contenente l'1% di BSA e lo 0,1% di Tween-20.

Ripetere la centrifugazione e la sospensione una o due volte. Sospendere i precipitati finali in 1 ml di PBS-T e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Qui viene mostrato un grafico del design della striscia immunitaria.

Le dimensioni del cartone, dei tamponi e della membrana in nitrocellulosa sono elencate nel testo del protocollo. Per prolungare la durata di conservazione, le strisce immunitarie devono essere preparate e assemblate in un ambiente di laboratorio a bassa umidità. Utilizzare una micropipetta per aggiungere la soluzione di anticorpi monoclonali colloidali marcati con oro al tampone coniugato per saturarlo, quindi asciugare il tampone a 37 gradi Celsius per un'ora prima di assemblarlo.

Una volta che il tampone coniugato è asciutto, utilizzare del nastro biadesivo per incollare prima la membrana di nitrocellulosa sul cartone. Utilizzando una stampante immunostrip, distribuire l'anticorpo monoclonale specifico che cattura l'antigene e l'IGG rapido anti-topo rispettivamente sulla zona del test e sulla zona di controllo, sulla membrana di nitrocellulosa. Mantenere una distanza superiore a cinque millimetri tra le due zone.

Quindi incollare il tampone coniugato su un lato della membrana di nitrocellulosa e il tampone assorbente sull'altro lato, sovrapponendo i tamponi su ciascun lato di circa due millimetri. Posiziona il tampone del campione sopra il tampone coniugato di due millimetri e incollalo sul cartone. Usa un tagliacarte per creare strisce larghe sei millimetri.

Imballare le strisce in un sacchetto di alluminio con essiccante e conservare a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per preparare un campione per il test di cross-reattività, aggiungere 1 ml di PBS contenente lo 0,1% di BSA a 0,03 grammi di muscolo grezzo. E usa un bastoncino di bambù o un'asta di macinazione per omogeneizzare il campione.

Tenere la striscia immunitaria per l'estremità opposta all'area del test e immergere la parte del tampone del campione nel campione per cinque-dieci minuti. Osservare direttamente il risultato. Testare vari campioni muscolari in triplicato.

La linea del test T è progettata per mostrare un segnale positivo quando entrambi gli anticorpi monoclonali rilevano la mioglobina dei cetacei. Poiché la mioglobina di animali non cetacei può essere rilevata solo da uno di questi due anticorpi monoclonali, la linea del test mostra un risultato negativo quando vengono testati campioni muscolari di altri animali. La linea di controllo C dovrebbe sempre mostrare un risultato positivo perché le IGG anti-topo rapide legano l'anticorpo di rilevamento marcato con oro colloidale.

Un risultato non riuscito nella linea di controllo indica che la qualità dei materiali sulla striscia è scarsa. L'analisi del sangue occidentale con surnatanti di ibridomi mostra che l'anticorpo monoclonale CGF5H9 rileva i cetacei e altri mammiferi come una singola banda colorata a un peso molecolare previsto di circa 17 kDa. La balenottera minore mostra una banda relativamente più debole rispetto a quella degli altri cetacei.

Le fasce sono assenti per tonno, foca e pollo. Mentre per il maiale si osserva una banda di circa 50kDa. Risultati identici si ottengono con l'analisi del sangue a punti.

Sebbene l'analisi del sangue occidentale con l'anticorpo monoclonale CSF1H13 mostri più bande aspecifiche per suini e tonni, CSF1H13 è altamente specifica perché reagisce solo con i cetacei. E la foca ha una banda ad un peso molecolare previsto di circa 17kDa. Risultati identici si ottengono con l'analisi del sangue a punti.

I risultati dell'ELISA indiretto di estratti muscolari di diverse specie utilizzando CGF5H9 purificato dimostrano segnali positivi per mucca, capra, cane, coniglio e cetacei, un debole segnale positivo per il maiale e segnali negativi per tonno, pollo e foca. CSF1H13 mostra un'elevata affinità con i cetacei e le foche. Entrambi gli anticorpi monoclonali possono reagire fortemente con tutte e quattro le specie di cetacei che appartengono a famiglie diverse, indicando la loro ampia reattività a diverse specie di cetacei.

La specificità della striscia d'oro colloidale immune è dimostrata da questi risultati rappresentativi. L'uso di campioni di muscolo non cetaceo si traduce in una sola banda sulla linea di controllo. Tuttavia, quando vengono utilizzati campioni di muscolo cetaceo, le bande di segnale sono presenti sia sulla linea di test che sulla linea di controllo.

Una volta padroneggiata, la preparazione degli anticorpi marcati e questa costruzione di strisce può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di progettare attentamente il peptide. Utilizzare diversi metodi per lo screening di anticorpi monoclonali adatti.

E usa un'alta qualità di oro colloidale per preparare anticorpi marcati. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi del DNA basata sulla PCR per rispondere a ulteriori domande, come la specie di cetacei e da dove provengono. L'anticorpo monoclonale CSF1H13 che è forte e mostra un'affinità verso i soli mammiferi marini può essere impiegato in vari formati di ELISA che offrono molte altre opportunità per studiare gli aspetti biologici, fisiologici e chimici della mioglobina nei mammiferi marini.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare anticorpi monoclonali specifici e successivamente applicarli su una striscia reattiva rapida.