Sviluppo di una striscia reattiva Immunocromatografico oro colloidale-based per il rilevamento di Cetacei mioglobina

L'obiettivo generale di questa striscia di test immunocromatografica a oro colloidale è differenziare la mioglobina dei cetacei da quella delle foche e di altri animali. Questo metodo può fornire un'analisi rapida e in loco della carne di cetaceo, contribuendo a limitarne il commercio e il consumo illegali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un risultato positivo può essere osservato direttamente entro cinque-dieci minuti dopo l'omogeneizzazione di 0,3 grammi di muscolo, con un'elevata specificità e sensibilità.

Pertanto, questo metodo può fornire un rilevamento rapido della carne di cetacei sul campo. Può essere applicato anche ad altri tipi di carne, come quella equina o suina. Per progettare peptidi sintetici da utilizzare nella produzione di anticorpi monoclonali reattivi verso la mioglobina dei cetacei, vengono analizzate le sequenze di aminoacidi delle regioni antigeniche reattive della mioglobina di diversi animali.

Iniziare recuperando da GenBank le sequenze di amminoacidi della mioglobina di tonno, pollo, struzzo, mammiferi domestici, foca e 18 specie di cetacei. Successivamente, allineare le sequenze utilizzando il software appropriato. Avviare Alignment Explorer selezionando Align Edit/Build Alignment sulla barra di avvio.

Selezionare Crea nuovo allineamento e fare clic su OK. Apparirà una finestra di dialogo che chiede se si sta creando un allineamento di sequenze di DNA o di proteine. Fare clic sul pulsante denominato Proteina, selezionare Dati Apri Recupera sequenze da file e selezionare il file di sequenza. Selezionare il comando di menu Modifica Seleziona tutto per selezionare tutti i siti di ogni sequenza nel set di dati al fine di creare un allineamento multiplo di sequenze.

Selezionare Allineamento Allinea tramite ClustalW dal menu principale. Selezionare BLOSUM come matrice di pesi per le proteine, quindi fare clic sul pulsante OK. Il terzo passaggio consiste nell'analizzare l'allineamento delle sequenze.

Puntare l'attenzione su cinque siti reattivi antigenici e individuare il frammento conservato tra i cetacei. Un asterisco simboleggia il consenso nell'allineamento e indica una posizione con un singolo residuo completamente conservato. Sono stati trovati due frammenti conservati nei cetacei.

I frammenti di sequenza candidati vengono quindi sintetizzati e utilizzati per produrre anticorpi monoclonali. Iniziare questa procedura determinando il pH ottimale per la soluzione di oro colloidale, definito come il pH minimo che mantiene la miscela di anticorpo monoclonale e soluzione di oro colloidale di colore rosso per due ore. Aggiungere 0,15 microgrammi di anticorpo monoclonale purificato di rilevamento a 100 microlitri di soluzione di oro colloidale con valori di pH compresi tra cinque e nove.

Per scopi dimostrativi, vengono testati un pH pari a sei e un pH pari a otto. Il pH pari a otto è stato considerato il valore ottimale in base a questo passaggio di ottimizzazione. Successivamente, determinare la concentrazione ottimale dell'anticorpo monoclonale aggiungendo diverse quantità di anticorpo monoclonale purificato di rilevamento a 100 microlitri di soluzione colloide d'oro a pH otto.

La concentrazione ottimale, che in questo studio è di sei microgrammi per millilitro, manterrà il colore della miscela rosso senza alcun precipitato nero. Sulla base dei risultati ottenuti nei passaggi di ottimizzazione, aggiungere goccia a goccia 60 microgrammi di anticorpo monoclonale purificato di rilevamento a 10 mL di soluzione colloïdale di oro. Emulsionare delicatamente la miscela a temperatura ambiente per dieci minuti.

Aggiungere due millilitri di una soluzione di BSA al 5% in PBS alla miscela ed emulsionare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti per ridurre le interferenze di fondo. Centrifugare la miscela a 10.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il soprannatante contenente l'anticorpo non coniugato e sospendere il pellet risultante in 4 mL di PBS-T contenente BSA all'1% e Tween-20 allo 0,1%.

Ripetere la centrifugazione e la sospensione una o due volte. Sospendere i precipitati finali in 1 mL di PBS-T e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Qui è mostrata una rappresentazione grafica della progettazione della striscia immunitaria.

Le dimensioni del cartone, dei tamponi e della membrana di nitrocellulosa sono indicate nel testo del protocollo. Per prolungare la durata di conservazione, le strisce immunitarie devono essere preparate e assemblate in condizioni ambientali di laboratorio a bassa umidità. Utilizzare una micropipetta per aggiungere la soluzione dell'anticorpo monoclonale marcato con oro colloidale sul tampone coniugato fino a saturarlo, quindi asciugare il tampone a 37 gradi Celsius per un'ora prima dell'assemblaggio.

Una volta che il tampone coniugato è asciutto, utilizzare del nastro adesivo doppio per incollare prima la membrana in nitrocellulosa sul cartoncino. Utilizzando una stampante per strisce immunologiche, distribuire l'anticorpo monoclonale specifico per l'antigene nel punto di test e l'anti-topo IGG rapido nel punto di controllo, rispettivamente, sulla membrana in nitrocellulosa. Mantenere una distanza superiore a cinque millimetri tra le due zone.

Quindi incollare il pad del coniugato su un lato della membrana in nitrocellulosa e il pad assorbente sull'altro lato, sovrapponendo i pad su ciascun lato di circa due millimetri. Posizionare il pad del campione sopra il pad del coniugato di due millimetri e incollarlo sul cartoncino. Utilizzare un taglierino per creare strisce larghe sei millimetri.

Confezionare le strisce in un sacchetto di alluminio con disidratante e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Per preparare un campione per il test di cross-reattività, aggiungere 1 mL di PBS contenente 0,1% di BSA a 0,03 grammi di muscolo crudo ed utilizzare un bastoncino di bambù o una sonda per macinare per omogeneizzare il campione.

Tenere la striscia immunitaria dall'estremità opposta rispetto all'area del test ed immergere la parte del tampone del campione nel campione per cinque-dieci minuti. Osservare il risultato direttamente. Testare vari campioni muscolari in triplice replicato.

La linea del test T è progettata per mostrare un segnale positivo quando entrambi gli anticorpi monoclonali rilevano la mioglobina dei cetacei. Poiché la mioglobina di animali non cetacei può essere rilevata solo da uno di questi due anticorpi monoclonali, la linea del test mostra un risultato negativo quando vengono analizzati campioni muscolari di altri animali. La linea di controllo C dovrebbe mostrare sempre un risultato positivo perché l'anticorpo anti-topo IGG rapido si lega all'anticorpo di rilevamento marcato con oro colloidale.

Un risultato negativo nella linea di controllo indica una scarsa qualità dei materiali presenti sulla striscia. L'analisi del sangue mediante Western blot utilizzando i supernatanti di ibridoma mostra che l'anticorpo monoclonale CGF5H9 rileva cetacei e altri mammiferi come una singola banda colorata a un peso molecolare previsto di circa 17 kDa. La balenottera comune mostra una banda relativamente più debole rispetto alle bande degli altri cetacei.

Le bande sono assenti per tonno, foca e pollo. Nel caso del maiale si osserva invece una banda di circa 50 kDa. Risultati identici si ottengono mediante analisi del sangue a puntino.

Sebbene l'analisi del sangue di origine occidentale mediante l'anticorpo monoclonale CSF1H13 mostri diverse bande aspecifiche per il maiale e il tonno, l'anticorpo CSF1H13 è altamente specifico poiché reagisce esclusivamente con i cetacei. Inoltre, la foca presenta una banda al peso molecolare previsto di circa 17 kDa. Risultati identici si ottengono mediante l'analisi del sangue con il metodo del dot blot.

I risultati dell'ELISA indiretto su estratti muscolari di diverse specie, utilizzando CGF5H9 purificato, mostrano segnali positivi per bovino, capra, cane, coniglio e cetacei, un segnale positivo debole per il suino e segnali negativi per tonno, pollo e foca. CSF1H13 mostra un'elevata affinità verso i cetacei e le foche. Entrambi gli anticorpi monoclonali possono reagire fortemente con tutte e quattro le specie di cetacei, appartenenti a famiglie diverse, indicando la loro ampia reattività verso specie di cetacei diversificate.

La specificità della striscia immunitaria al colloide d'oro è dimostrata da questi risultati rappresentativi. L'uso di campioni muscolari non provenienti da cetacei produce una sola banda sulla linea di controllo. Tuttavia, quando vengono utilizzati campioni muscolari di cetacei, le bande del segnale sono presenti sia sulla linea di test che su quella di controllo.

Una volta acquisita padronanza, la preparazione di anticorpi marcati e la costruzione di strisce può essere completata in quattro ore, se eseguita correttamente. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di progettare attentamente il peptide. Utilizzare diversi metodi per la selezione di anticorpi monoclonali adatti.

Utilizzare un colloide d'oro di alta qualità per preparare anticorpi marcati. Dopo aver seguito queste procedure, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi del DNA basata sulla PCR, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'identità della specie di cetaceo e sulla sua origine. L'anticorpo monoclonale CSF1H13, che è potente e mostra affinità esclusivamente nei confronti dei mammiferi marini, può essere impiegato in diversi formati di ELISA, offrendo numerose opportunità aggiuntive per lo studio degli aspetti biologici, fisiologici e chimici della mioglobina nei mammiferi marini.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare anticorpi monoclonali specifici e successivamente applicarli su un test rapido in striscia.