Name: Un metodo semplice per Automated fase solida estrazione di campioni di acqua per lanalisi immunologiche di piccole inquinanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri un metodo automatizzato per l'estrazione in fase solida di campioni d'acqua per l'analisi di inquinanti organici tramite immunoassay. Questa tecnica riduce costi e tempi rispetto ai metodi tradizionali.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Settimo Programma Quadro dell'Unione Europea FP7/2007-2013 nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 265721. Gli autori ringraziano l'Istituto RIKILT per la Sicurezza Alimentare (NL) per il loro sostegno in questo progetto.

Nota: Il protocollo seguente descrive la SPE effettuato su 100 ml del campione d&#39;acqua con C18 sorbente e eluizione con 50% v / v di metanolo. Il campione arricchito viene diluita a raggiungere il 10% v / v di metanolo prima analisi con un enzima linked immunosorbent assay (ELISA) Kit. 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare i campioni di acqua <ol><li> Prima di qualsiasi altro passo, filtrare ogni campione di 100 ml di acqua con filtri a 0,2 micron di dimensione dei pori. </li><li> Additiva con concentrazione desiderata diluendo il volume appropriato di soluzione di riferimento in un volume di acqua. Ad esempio, preparare 100 ml di campione con 100 ng / L di E2 diluendo 3,3 ml di soluzione di riferimento E2 ad una concentrazione di 300 mg / L. Diluire questa soluzione dieci volte per ottenere un campione a spillo con 10 ng / L E2. Diluire quest&#39;ultima altri dieci volte per ottenere un campione di 100 ml con 1 ng / L E2. </li><li> Collocare il campione filtrato (non modificato o spillo) in una bottiglia di vetro con GFilo L45. Utilizzare l&#39;esempio lo stesso giorno. Prendere una piccola frazione da analizzare con il test ELISA per stimare concentrazione iniziale. </li></ol></li><li> Preparare 300 ml di eluente diluendo in metanolo (di-) acqua deionizzata al 50% v / v in un tubo stretto. </li></ol> 2. Preparazione della colonna SPE <ol><li> Preparare a 20 mg / ml sospensione di particelle adsorbenti ottadecil-silice aggiungendo primi 1.600 ml di metanolo e poi 400 ml di acqua demineralizzata a 40 mg di sorbente in fase inversa. Strettamente chiudere il coperchio e agitare con un vortice. </li><li> Installazione della membrana inferiore della colonna <ol><li> Seleziona una membrana di nylon con dimensione dei pori 11 micron e metterlo su un doppio strato di tessuto anti-polvere. Con un diametro del punzone 3 mm, tagliare due piccole parti nella membrana. </li><li> Afferrare una delle piccole membrane con TV a fascia pinza filtra e posizionarlo su un lato della colonna. </li><li> Avvitare il connettore a fondo piatto con il tubo e stringere. La membrana è now nel luogo e l&#39;assorbente può essere aggiunto in modo sicuro. Disegnare una freccia sul corpo della colonna di puntamento verso la fine dove è stata posta la membrana. </li></ol></li><li> Preparazione della colonna assorbente imballato <ol><li> Fissare la colonna a supporto con la freccia rivolta verso il basso. La colonna deve essere impostato più verticale possibile. </li><li> Attaccare un vuoto 10 ml siringa monouso all&#39;estremità del tubo della colonna, utilizzando i connettori Luer-Lock. </li><li> Preparare un micro-pipetta con una punta di 20-200 microlitri, impostare il volume di 100 l. Questo formato puntale viene adattata alle dimensioni della colonna sorbente essere preparati. La procedura sarebbe più difficile con punte per pipette più grandi, come quelli usati con 1 ml pipette. </li><li> Agitare la sospensione sorbente con un vortice, e rapidamente pipettare 100 microlitri al centro della colonna. Mentre l&#39;iniezione, aspirare delicatamente tutta la soluzione pipettato trogolo membrana utilizzando la siringa con l&#39;altra mano. A questo stl&#39;età, la soluzione di riempimento della siringa deve essere libera da particelle, e un letto particella può eventualmente essere osservata nella colonna. </li><li> Ripetere questa operazione altre 2 volte agitando la sospensione di scorta tra tutti fasi di pipettamento per garantire la sospensione omogenea delle particelle nella soluzione. La colonna risultante contiene 6 mg di assorbente. </li><li> Quando i 300 ml di sospensione sono stati caricati ed essiccato aspirando con la siringa, tenere la siringa in posizione e posizionare la seconda membrana di nylon sulla parte superiore usando le pinze con l&#39;altra mano. </li><li> Avvitare il secondo connettore con il tubo e smaltire la siringa. La colonna SPE è pronto all&#39;uso. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione del sistema <ol><li> Serrare colonna SPE il dispositivo utilizzando i connettori Luer-Lock. La freccia deve puntare nella stessa direzione come quella mostrata sul dispositivo. </li><li> Collegare la bottiglia contenente il campione al dispositivo avvitando ilprevisto tappo di sicurezza GL45 su di esso. </li><li> Carico 200 ml di eluente nel serbatoio &#39;Eluente&#39;. </li><li> Carico 800 ml di di-acqua nel serbatoio &#39;diluizione&#39;. </li><li> Posizionare una bottiglia all&#39;uscita rifiuti per raccogliere l&#39;acqua elaborati durante fase di estrazione. Il formato non è importante, ma il volume deve essere sufficientemente grande per quanto riguarda il volume del campione. </li><li> Mettere una piccola fiala all&#39;uscita sensore con capacità minima volume di 1,5 ml. Un volume massimo di 1 ml sarà troppo piccolo come le bolle si formano in questo sbocco al momento del ritiro eluente arricchito e tampone di diluizione. </li><li> Verificare il regolatore di pressione è in posizione chiusa ruotando manualmente, reverse-orario fino ulteriore movimento non è possibile. </li></ol> 4. SPE con il Prototype <ol><li> Accendere il prototipo premendo il pulsante sul retro. </li><li> Preparare l&#39;interfaccia utente e selezionando il programma <ol><li> Aprire l&#39;interfaccia utente. Selezionarela porta di comunicazione del computer a cui il dispositivo è collegato dalla lista, e fare clic sul pulsante &#39;Avanti&#39;. </li><li> Immettere i valori per 580 pset e 30 per dpset. La pompa regolerà per mantenere la pressione nel sistema di pressione e serbatoi a 580 ± 30 mbar durante l&#39;esecuzione. </li><li> Selezionare la modalità automatica. </li><li> Nell&#39;angolo modalità automatica, caricare il file di programma nel &#39;percorso del file di configurazione&#39; scatola. </li></ol></li><li> Regolazione del regolatore di pressione <ol><li> Avviare la pompa. </li><li> Attivare manualmente il regolatore di pressione fino a quando il valore letto per preg è inferiore ma vicino a 320 mbar. </li><li> Fermare la pompa. </li></ol></li><li> Avvio della procedura di SPE <ol><li> Premere &#39;start&#39; nell&#39;angolo modalità automatica. La pompa si accenderà e le fasi di estrazione, eluizione e diluizione seguirà automaticamente l&#39;un l&#39;altro. L&#39;intera procedura per un campione di 100 ml viene eseguita in 50 min. </li><li>Verificare il valore di preg. Deve essere compreso nell&#39;intervallo 320 - 350 mbar durante la fase di estrazione per garantire una portata ottimale. </li><li> Chiudere la piccola fiala e conservare a 4-5 ° C al buio fino al momento dell&#39;analisi. Effettuare analisi nella seguente 30 ore per impedire la degradazione dell&#39;analita. </li><li> Smaltire l&#39;acqua trattata. </li></ol></li><li> Pulizia del sistema Nota: Al termine di ogni procedura di estrazione del sistema deve essere pulito per evitare la contaminazione incrociata. <ol><li> Preparare una soluzione di 10 ml di metanolo 70% v / v in una bottiglia di vetro GL 45. </li><li> Scollegare colonna SPE e collegare il tubo di connettori. </li><li> In modalità automatica, selezionare il file &#39;pulizia&#39; e avviarlo con impostazioni di pressione stessi. </li></ol></li></ol> 5. Individuazione di Estradiolo Concentrazione con ELISA <ol><li> Preparare i campioni di calibrazione con concentrazioni come indicato nel protocollo fornito con il kit ELISA utilizzato. Preparare uno calibrazione impostato con la stessa matrice del campione, e un set di calibrazione con metanolo 10% v / v. </li><li> Dispensare la quantità necessaria di campione nei pozzetti sulla piastra, secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare campioni di calibrazione, campioni di acqua non modificati e spillo che sono stati filtrati, ma non trattati con SPE, e arricchito i campioni in metanolo 10% v / v. Utilizzare 3 pozzetti per campione per ridurre l&#39;errore associato con il test. </li><li> Seguire le indicazioni del protocollo fornito con il kit per l&#39;aggiunta dei reagenti, tempo di incubazione, lavaggio e ulteriore reazione con l&#39;enzima. </li><li> Leggere il segnale ottico in ogni pozzetto secondo le istruzioni del produttore corredo con uno strumento lettore di piastre e raccogliere i dati. </li><li> Utilizzare il software dello strumento lettore di piastre per adattarsi alle curve di calibrazione e determinare la concentrazione di E2 nel campione iniziale con stessa matrice, e nei campioni arricchiti con metanolo 10% v / v. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

È stato proposto un nuovo metodo per la preparazione dei campioni di acqua seguita da analisi mediante immunodosaggio. Lo strumento permette di eseguire l&#39;estrazione in fase solida in modo automatizzato e facile da usare. La filtrazione del campione di acqua prima della sua iniezione nel sistema è critica. Eventuali particelle ancora presenti nella soluzione potrebbe potenzialmente causare l&#39;intasamento della rete fluidica e ostacolare colonna SPE. Un altro passo importante è la prep...

La preparazione del campione è un passo importante in ogni processo di analisi. In particolare, la rimozione degli effetti matrice, diminuzione delle interferenze e arricchimento dell&#39;analita sono necessari per ottenere risultati precisi e raggiungere limiti di rilevabilità. Sistema endocrino composti (IE) sono di particolare interesse per la loro azione su organismi viventi, anche quando presenti a livelli molto bassi per l&#39;ambiente. L&#39;ormone naturale 17β-estradiolo è presente sul inquinamento delle acque dell&#39;UE selezione e soggetto ad essere aggiunto alla lista delle sostanze prioritarie disciplinati dalla direttiva quadro sulle acque europee. Estrazione in fase solida (SPE) è comunemente applicato per l&#39;analisi di piccole inquinanti in acqua, sia chimica 1-5 (cromatografia, spettrometria di massa) e immunologici 6-9 metodi di rilevamento. Quest&#39;ultimo ha guadagnato interesse nel campo del monitoraggio ambientale, come saggi immunologici sono disponibili in un&#39;ampia varietà di formati, sono specifici per la taanalita rget, e raggiungere limiti di rilevabilità. 6, 7, 10, 11 Vari Enzyme Linked immunoassorbimento (ELISA) sono commercialmente disponibili e consentono di analizzare più campioni contemporaneamente su una piastra multi-pozzo. La procedura consiste in fasi successive di reazione che possono prendere un paio d&#39;ore. Il prodotto finale di reazione può essere rilevato otticamente per determinare la concentrazione della molecola bersaglio sulla base di una curva di calibrazione. Procedure SPE Classical includono sorbente pre-condizionamento, dell&#39;estrazione del campione, lavaggio, eluizione e concentrazione per evaporazione dell&#39;eluente. Il solvente utilizzato per la diluizione di questo estratto è scelto in funzione del metodo di rilevamento. Per i metodi immunologici, la quantità di solvente organico influenze fortemente la sensibilità del metodo. 12 Oltre al recupero e le prestazioni pre-concentrazione, il metodo deve anche essere semplice ed economicamente conveniente. Automazione dei SEGUIRE IL PROCEDIMENTOe aiuta a ridurre gli errori umani legati. Nel nostro lavoro precedente 13 abbiamo introdotto il nostro prototipo per SPE automatizzata, e il nostro metodo è stato applicato all&#39;analisi della ormone naturale 17β-estradiolo in campioni di acqua di mare. Con la presente il video che vorremmo evidenziare i vantaggi tecnici del nostro metodo rispetto alle tradizionali off-line e on-line SPE, e la sua particolare compatibilità con rilevamento da immuno-reazioni. Descriviamo il protocollo applicato ai campioni di acqua per la rilevazione di 17β-estradiolo. SPE viene eseguita con octadecil-silice (C18) Fase sorbente e eluizione viene eseguita con metanolo diluito.

<table><tbody><tr><td>Membrana filtrante 0,2 &mu; m dimensione dei pori</td><td>Merck Millipore</td><td>GNWP04700</td><td>Per la filtrazione del campione</td></tr><tr><td>Membrana in nylon 11 &mu; m dimensione dei pori</td><td>Merck Millipore</td><td>NY1104700</td><td>per colonna SPE</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia monouso 5 mm</td><td>Budget medico</td><td>39302439</td><td></td></tr><tr><td>Nucleodur C18 ec&nbsp;</td><td>Macherey Nagel</td><td>713550.01</td><td>50 &mu; m diametro delle particelle</td></tr><tr><td>Acqua di mare sintetica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SSWS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17beta-estradiolo standard</td><td>Enzo Life Science</td><td></td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>17beta-estradiolo Kit ELISA</td><td>Enzo Life Science</td><td>ADI-900-008</td><td>96 pozzetti, intervallo 30 - 3.000 ng/L</td></tr></tbody></table>

un metodo semplice per automated fase solida estrazione di campioni di acqua per l&#39;analisi immunologiche di piccole inquinanti

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Si propone un nuovo metodo per l&#39;estrazione in fase solida (SPE) di campioni di acqua ambientale. Il prototipo sviluppato è conveniente e facile da usare, e consente di eseguire un rapido, automatizzato e semplice SPE. La soluzione pre-concentrata è compatibile con l&#39;analisi mediante immunodosaggio, con un basso contenuto di solvente organico. Un metodo è descritto per l&#39;estrazione e pre-concentrazione di ormone naturale 17β-estradiolo in 100 ml campioni di acqua. Fase inversa SPE viene eseguita con sorbente ottadecil-silice e eluizione avviene con 200 ml di metanolo al 50% v / v. Eluente viene diluito con l&#39;aggiunta di acqua per abbassare la quantità di metanolo. Dopo aver preparato manualmente colonna SPE, la procedura generale viene eseguita automaticamente entro 1 ora. Al termine del processo, la concentrazione di estradiolo è misurato utilizzando un commerciale immuno-adsorbente assay enzimatico (ELISA). 100 volte pre-concentrazione si ottiene e il contenuto di metanolo in solo il 10% v / v. Recuperi completi della molecolavengono raggiunti con 1 ng / L spillo campioni deionizzata e sintetici acqua di mare.

Riproducibilità dell&#39;imballaggio sorbente è stata valutata con l&#39;essiccazione e la ponderazione del sorbente pipettato in flaconcini di vetro ed il risultato è mostrato in Figura 1. Riproducibilità del tempo di iniezione è stato testato per 100 ml di campioni, come mostrato nella Figura 2. Concentrazione iniziale e pre concentrato spillo campioni sono stati determinati utilizzando un kit ELISA commerciale per 17β...

Viene presentato un protocollo per l'estrazione e la pre-concentrazione di estradiolo da campioni d'acqua utilizzando un sistema automatizzato e miniaturizzato.

Un metodo semplice per Automated fase solida estrazione di campioni di acqua per l&#39;analisi immunologiche di piccole inquinanti

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

L'obiettivo generale di questo metodo di preparazione del campione è quello di preconcentrare in modo semplice, economico e automatizzato inquinanti organici di piccole dimensioni da campioni d'acqua. Questo metodo può sostituire i processi standard di SPE nello studio della contaminazione di campioni d'ac游戏副本Inoltre, le prestazioni del processo di arricchimento soddisfano i requisiti per l'analisi degli immunodosaggi sia in termini di basso contenuto di solvente che di efficienza di preconcentrazione. Per prima cosa, filtrare 100 millimetri di campione d'acqua utilizzando un filtro con dimensione dei pori di zero virgola due micrometri. Collocare il campione filtrato in un flacone di vetro con filettatura GL 45.Preparare 300 microlitri di eluente diluendo metanolo in acqua deionizzata al 50 percento in volume in un tubo stretto. Successivamente, preparare una sospensione di 20 milligrammi per millilitro di particelle di silice ottadeciliche aggiungendo 1.600 microlitri di metanolo seguiti da 400 microlitri di acqua deionizzata a 40 milligrammi di sorbente in fase inversa in un vial di vetro. Chiudere bene il coperchio e agitare con un miscelatore vortex.Posizionare una membrana di nylon con dimensione dei pori di 11 micrometri su un doppio strato di tessuto antipolvere. Tagliare due piccole parti nella membrana utilizzando un perforatore da tre millimetri di diametro. Successivamente, prendere una delle piccole membrane con pinze per filtri a estremità piatta e posizionarla su un lato della colonna.Successivamente, avvitare il connettore con fondo piatto al tubo e serrare. Quindi, disegnare una freccia sul corpo della colonna, puntando verso l'estremit&agrave; in cui &egrave; stata posizionata la membrana. A questo punto, fissare la colonna sul supporto con la freccia rivolta verso il basso.Collegare una siringa monouso da 10 millilitri vuota all'estremit&agrave; del tubo della colonna utilizzando i connettori di blocco inferiori. Agitare la sospensione del sorbente con il miscelatore vortex e pipettare rapidamente 100 microlitri al centro della colonna. Durante l'iniezione, aspirare delicatamente la soluzione pipettata attraverso la membrana utilizzando la siringa con l'altra mano.La preparazione della colonna di estrazione in fase solida (SPE) è molto importante. È necessario assicurarsi di aspirare correttamente la soluzione attraverso la membrana utilizzando la siringa mentre si inietta la sospensione di particelle nella colonna. In caso contrario, le particelle non si impaccheranno in modo denso.Ripetere il processo precedente altre due volte, agitando la sospensione madre tra tutti i passaggi di pipettaggio, per garantire una sospensione omogenea delle particelle nella soluzione. Dopo che l'intera sospensione è stata caricata ed essiccata aspirando con una siringa, mantenere la siringa in posizione e posizionare il secondo filtro in nylon sopra utilizzando la pinzetta con l'altra mano. Successivamente, avvitare il secondo connettore con un tubo e smaltire la siringa.A questo punto, stringere la colonna sul dispositivo SPE utilizzando i connettori di bloccaggio inferiori. Collegare la bottiglia contenente il campione al dispositivo avvitando il tappo di sicurezza GL 45 fornito. Caricare 200 microlitri di eluente nel serbatoio dell'eluente.Successivamente, caricare 800 microlitri di acqua deionizzata nel serbatoio di diluizione. Verificare che il regolatore di pressione sia in posizione chiusa ruotandolo in senso antiorario fino a quando non è più possibile proseguire. Dopo aver acceso il prototipo, inserire i valori 580 per pset e 30 per delta pset.Per regolare il regolatore di pressione, avviare la pompa. Quindi, ruotare manualmente il regolatore di pressione finché il valore letto per preg è inferiore ma vicino a 320 millibar. Dopo aver fermato la pompa, avviare la procedura SPE premendo start nell'angolo della modalità automatica.Una volta completata la procedura di SPE, chiudere il piccolo flacone del campione e conservarlo a quattro-cinque gradi Celsius al buio fino all'analisi mediante ELISA. Per pulire il sistema, preparare una soluzione di 10 millilitri al 70 percento di metanolo in volume in un flacone di vetro con filetto GL 45. Scollegare la colonna di SPE e tappare i tubi con i connettori.In modalità automatica, selezionare il file di pulizia e avviarlo con le stesse impostazioni di pressione utilizzate in precedenza per pset, delta pset e preg. La riproducibilità del confezionamento del sorbente è stata valutata mediante essiccazione e pesatura del sorbente dispensato in vial di vetro. La riproducibilità del tempo di iniezione è stata verificata su campioni da 100 millilitri.Le concentrazioni dei campioni iniziali e pre-concentrati arricchiti sono state determinate utilizzando un kit ELISA commerciale per il 17 beta-estradiolo. Dalle curve di calibrazione risulta evidente che il rapporto di metanolo presente nel campione arricchito non influenza la sensibilità del saggio immunoenzimatico. Le rese, pari a 128 ± 22 percento e 107 ± 6 percento, sono state calcolate rispettivamente per acqua deionizzata e acqua di mare artificiale.Una volta padroneggiata, la preparazione di una colonna per SPE può essere eseguita in meno di cinque minuti, se effettuata correttamente. L'intera procedura di SPE può essere completata in meno di un'ora. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze ambientali per esplorare lo sviluppo di metodi di immunorilevamento per il monitoraggio di piccoli inquinanti organici.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni d'acqua utilizzando il nostro strumento automatizzato ed economico per l'analisi di inquinanti mediante saggi immunoenzimatici. Non dimenticare che lavorare con inquinanti organici e solventi può essere pericoloso, e precauzioni come indossare guanti adeguati e occhiali di protezione devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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