Un metodo semplice per Automated fase solida estrazione di campioni di acqua per l'analisi immunologiche di piccole inquinanti

L'obiettivo generale di questo metodo di preparazione dei campioni è quello di pre-concentrare piccoli inquinanti organici da campioni d'acqua, in modo facile da usare, economico e automatizzato. Questo metodo può sostituire i processi SPE standard quando si studia la contaminazione di campioni d'acqua utilizzando metodi di immunorilevamento, come saggi immunologici su piastra o biosensori. I principali vantaggi di questa tecnica sono che la procedura SPE è automatizzata mentre l'ingombro e il costo degli strumenti sono bassi rispetto agli approcci tradizionali.

Inoltre, le prestazioni del processo di arricchimento soddisfano i requisiti dell'analisi dei saggi immunologici sia in termini di basso contenuto di solvente che di efficienza di pre-concentrazione. Innanzitutto, filtrare un campione d'acqua da 100 millimetri con un filtro di dimensioni pari a due micrometri di punto zero. Collocare il campione filtrato in un flacone di vetro con filettatura GL 45.

Preparare 300 microlitri di eluente diluendo il metanolo in acqua deionizzata, al 50% del volume in un tubo stretto. Successivamente, preparare una sospensione di 20 milligrammi per millilitro di particelle di assorbente di silice ottadecilica aggiungendo 1.600 microlitri di metanolo seguiti da 400 microlitri di acqua deionizzata a 40 milligrammi di assorbente in fase inversa in una fiala di vetro. Chiudere bene il coperchio e agitare con un miscelatore a vortice.

Posizionare una membrana di nylon con pori di 11 micrometri su un doppio strato di tessuto antipolvere. Tagliare due piccole parti nella membrana con un punzone di tre millimetri di diametro. Quindi, afferrare una delle piccole membrane con una pinza filtrante a estremità piatta e posizionarla su un lato della colonna.

Successivamente, avvitare il connettore a fondo piatto con il tubo e serrare. Quindi, disegna una freccia sul corpo della colonna, puntando verso l'estremità in cui è stata posizionata la membrana. A questo punto fissare la colonna sul supporto con la freccia rivolta verso il basso.

Collegare una siringa monouso vuota da 10 millilitri all'estremità del tubo della colonna utilizzando i connettori di blocco inferiori. Agitare la sospensione assorbente con il miscelatore a vortice e pipettare rapidamente 100 microlitri al centro della colonna. Durante l'iniezione, aspirare delicatamente la soluzione pipettata attraverso la membrana utilizzando la siringa con l'altra mano.

La preparazione della colonna SPE è molto importante. È necessario assicurarsi di aspirare correttamente la soluzione attraverso la membrana utilizzando la siringa mentre si inietta la sospensione di particelle nella colonna. In caso contrario, le particelle non saranno impacchettate densamente.

Ripetere il processo precedente altre due volte, agitando la sospensione madre tra tutte le fasi di pipettaggio, per garantire una sospensione omogenea delle particelle nella soluzione. Dopo che l'intera sospensione è stata caricata e asciugata aspirando con una siringa, mantenere la siringa in posizione e posizionare la seconda membrana di nylon sulla parte superiore utilizzando la pinza con l'altra mano. Quindi, avvitare il secondo connettore con un tubo e smaltire la siringa.

A questo punto, serrare la colonna sul dispositivo SPE utilizzando i connettori di blocco inferiori. Collegare il flacone contenente il sample al dispositivo avvitando su di esso il tappo di sicurezza GL 45 in dotazione. Caricare 200 microlitri di eluente nel serbatoio dell'eluente.

Quindi, caricare 800 microlitri di acqua deionizzata nel serbatoio di diluizione. Verificare che il regolatore di pressione sia in posizione chiusa ruotandolo all'indietro in senso orario fino a quando non è possibile un ulteriore movimento. Dopo aver acceso il prototipo, inserire i valori 580 per pset e 30 per delta pset.

Per regolare il regolatore di pressione, avviare la pompa. Quindi, ruotare manualmente il regolatore di pressione fino a quando il valore letto per il preg è inferiore ma vicino a 320 millibar. Dopo aver arrestato la pompa, avviare la procedura SPE premendo start nell'angolo della modalità automatizzata.

Una volta completata la procedura SPE, chiudere la piccola fiala del campione e conservarla a quattro o cinque gradi Celsius al buio, fino all'analisi ELISA. Per pulire il sistema, preparare una soluzione da 10 millilitri di metanolo al 70% in volume in un flacone di vetro con filettatura GL 45. Scollegare la colonna SPE e collegare il tubo con i connettori.

Nella modalità automatica, selezionare il file Pulizia e avviarlo con le stesse impostazioni di pressione precedentemente utilizzate per pset, delta pset e preg. La riproducibilità dell'impacchettamento del sorbente è stata valutata essiccando e pesando il sorbente pipettato in fiale di vetro. La riproducibilità del tempo di iniezione è stata testata per i campioni da 100 millilitri.

Le concentrazioni dei campioni addizionati iniziali e pre-concentrati sono state determinate utilizzando un kit ELISA commerciale di 17 beta-estradiolo. Dalle curve di calibrazione risulta chiaro che il rapporto di metanolo del campione arricchito non influisce sulla sensibilità del test immunologico. I recuperi di 128, più o meno il 22 per cento, e 107 più o meno il 6 per cento, sono stati calcolati rispettivamente per l'acqua deionizzata e l'acqua di mare artificiale.

Una volta padroneggiata, la preparazione di una colonna SPE può essere eseguita in meno di cinque minuti, se eseguita correttamente. L'intera procedura SPE può essere completata in meno di un'ora. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze ambientali per esplorare lo sviluppo di metodi di immunorilevamento per il monitoraggio di piccoli inquinanti organici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni d'acqua utilizzando il nostro strumento automatizzato ed economico per l'analisi degli inquinanti mediante immunodosaggi. Non dimenticare che lavorare con inquinanti organici e solventi può essere pericoloso e che quando si esegue questo processo è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e occhiali protettivi adeguati.