Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come analizzare con precisione il contenuto di endotossine e DNA delle particelle aerodisperse estratte e campionate su filtri. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sugli aerosol biologici interni ed esterni, ad esempio comprendere le cause sanitarie. La procedura di campionamento su filtro sarà dimostrata da Yinon Mazar, uno studente laureando del mio laboratorio.

Per campionamenti ad alto volume, utilizzare filtri in fibra di quarzo. In alternativa, scegliere il tipo specifico di filtro e la dimensione di cutoff del filtro più adatti alle esigenze della ricerca. Preriscaldare i filtri destinati al campionamento di composti organici e biologici avvolgendoli singolarmente in fogli di alluminio.

E quindi cuocerli in un forno da laboratorio a 450 gradi Celsius per almeno cinque ore. Questo distruggerà eventuali residui organici preesistenti. Conservare i filtri cotti a 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso per il campionamento.

Successivamente, pulire e disinfettare il campionatore ad alto volume, come quello descritto nel protocollo testuale allegato. Quindi, inserire il filtro preriscaldato nella capsula del filtro ed eseguire il campionamento seguendo le istruzioni del produttore per raccogliere un campione appropriato. All'interno di una cappa biologica di classe due, tagliare 22 pezzi circolari di materiale filtrante pulito e preriscaldato utilizzando un punzone sterile di 1,12 centimetri di diametro.

Utilizzare questi pezzi per preparare una serie di filtri aggiunti con endotossina da usare come controlli. Successivamente, tagliare i filtri contenenti il campione raccolto utilizzando un trapano per tappi pulito con diametro di 1,12 centimetri e posizionare ciascun campione in un tubo privo di pirrogeni da due millilitri. Inoltre, trasferire i filtri essiccati aggiunti con endotossina in tubi privi di pirrogeni da due millilitri separati.

Aggiungere un millilitro di acqua priva di pirògeni a ciascuna provetta. Agitarle quindi per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un agitatore da laboratorio. Successivamente, centrifugare le provette in un microcentrifugo a 375 ×g per 10 minuti.

Quindi, trasferire il sopranatante, che contiene gli endotossine, in un nuovo tubo privo di pirrogeni da due millilitri. Preparare una piastra microtitolazione priva di pirrogeni da 96 pozzetti con fondo piatto e coperchio per il test delle endotossine, definendo innanzitutto le posizioni dei campioni.

Successivamente, accendere il lettore di micropiastre e programmarlo per una reazione cinetica a 37 gradi Celsius con agitazione ogni cinque minuti, seguita da letture a 405 nanometri. Ripetere l'agitazione di cinque minuti e la lettura della piastra 18 volte.

Caricare i campioni nell'acate posizionando 50 microlitri delle soluzioni standard di endotossina precedentemente utilizzate per contaminare i filtri nelle righe da A1 ad A10 e da B1 a B10. Posizionare i bianchi in A11, A12, B11 e B12. Successivamente, aggiungere il sopranatante ottenuto dall'estrazione del filtro contaminato centrifugato e i relativi bianchi nelle righe C e D. Quindi, aggiungere i sopranatanti dei campioni sperimentali e dei bianchi nelle pozzette rimanenti secondo necessità.

Per attivare il test, aggiungere rapidamente 50 microlitri di soluzione di glicolato di amebociti di Limulus in ciascun pozzetto. Agitare delicatamente la piastra in orizzontale. Prima di posizionarla nel lettore di piastre e avviare la corsa sperimentale.

Al termine, rimuovere la piastra dal lettore di piastre. Determinare il livello di endotossine in ogni campione utilizzando la curva standard e calcolare anche l'efficienza con cui le endotossine vengono estratte dai filtri del campione. Preparare innanzitutto i filtri spikeati con DNA come descritto nel protocollo testuale allegato.

Per ogni campione di filtro, preparare una miscela di perline di vetro lavate con acido in provette sterili da 0,5 millilitri, aggiungendo 0,1 grammi di perline con un diametro compreso tra 425 e 600 micrometri e 0,3 grammi di perline con un diametro minore o uguale a 106 micrometri. Successivamente, tagliare tre pezzi circolari da posizioni scelte casualmente su ciascun campione di filtro utilizzando un punzone sterile di diametro 1,12 centimetri. Posizionare i campioni di filtro in provette individuali da due millilitri con tappo a vite.

Quindi, aggiungere la miscela di perline di vetro in ogni provetta insieme a 60 microlitri del tampone di lisi cellulare fornito con il kit di estrazione del DNA. Chiudere le provette e posizionare i campioni nel bead beater. Utilizzare il bead beater per rompere meccanicamente le cellule filtrate per un minuto, quindi raffreddare i campioni ponendoli sul ghiaccio per un minuto aggiuntivo.

Ripetere questo ciclo cinque volte. Procedere seguendo il protocollo del fornitore del kit ed estrarre il DNA dalle cellule lisate. Dopo l'eluzione, ricaricare il campione eluito attraverso la colonna di estrazione una seconda volta per migliorare il rendimento del DNA.

Accendere in anticipo lo strumento di PCR quantitativa per consentirgli di riscaldarsi. In un nuovo file di programma, inserire i dettagli per l'esecuzione della PCR quantitativa nel software operativo dello strumento. Successivamente, disinfettare la superficie di lavoro con un decontaminante per DNA da superficie e utilizzare esclusivamente provette, punte e reagenti sterili.

Inoltre, posizionare un secchio con ghiaccio accanto al banco di lavoro e mettere la miscela di tac polemoraris nel secchio. Preparare la miscela di reazione per PCR quantitativa come descritto nella tabella quattro del protocollo testuale allegato. Conservare la miscela di reazione al buio e sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Successivamente, posizionare una micropiastra pulita in un supporto per piastre per evitare che entri in contatto con la superficie di lavoro e per mantenerla pulita. Aggiungere un microlitro di DNA standard, DNA del campione o acqua priva di nucleasi nei pozzetti della micropiastra per PCR quantitativa in triplice replicato. Quindi, aggiungere nove microlitri della miscela di reazione master in ciascun pozzetto di reazione.

Una volta terminato, coprire la piastra con un film adesivo ottico e sigillarla accuratamente su tutti i lati. Centrifugare la piastra in una centrifuga dotata di portapiastra per un minuto a 1000 ×g prima di posizionarla nel termociclatore. Infine, attivare ed eseguire il programma di PCR quantitativa preparato.

Durante l'estrazione dell'endotossina, i campioni filtrati vengono centrifugati per estrarre l'endotossina dal filtro. Velocità di centrifugazione diverse determinano efficienze di estrazione differenti, specialmente a concentrazioni elevate di endotossina.

Deve essere condotto un test preliminare dell'efficienza di estrazione per il filtro specifico scelto e per il protocollo eseguito. Si ottengono efficienze di estrazione più elevate aggiungendo campioni puri su filtri puliti, rispetto ai filtri al quarzo campionati, e entrambe queste efficienze sono inferiori a quelle ottenute mediante la rilevazione diretta della soluzione standard. Una volta acquisita padronanza, l'analisi degli endotossine può essere completata in tre ore e mezza se eseguita correttamente.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il sequenziamento del DNA per rispondere a ulteriori domande riguardanti il trasporto di organismi nell'atmosfera. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come estrarre in modo efficiente endotossine e DNA da filtri di campioni d'aria e analizzarli con precisione.