Name: Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Impara a estrarre e analizzare endotossine e DNA da filtri per campionamento atmosferico utilizzando filtri in fibra di quarzo. Questo metodo consente di studiare gli aerosol biologici indoor e outdoor per ricerche sulla salute ambientale.

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Gli autori ringraziano il Dr. Yoav Barak della Facoltà di Chimica, Istituto Weizmann, per il supporto e il consiglio. Questo studio è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione # 913/12) e dalla Fondazione Minerva con il finanziamento del Ministero Federale Tedesco per l'Istruzione e la Ricerca.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro descrive i metodi di estrazione e di rilevazione per quantificare sia endotossine e DNA presente in campioni di aerosol raccolti su filtri. I metodi richiedono routine accurati e possono essere eseguiti facilmente finché sperimentatore aderisce ad alcuni punti essenziali ed importanti discussi qui. Per la fase di rilevazione endotossine, si noti che la soluzione lisato è molto viscoso e tende a produrre bolle su pipettaggio. E &#39;difficile da rimuovere te bolle, e si portano ...

Campionamento dell&#39;aria sui filtri è uno strumento fondamentale nella ricerca aerosol atmosferico. 1 I filtri campionati sono il punto di partenza per varie chimiche, fisiche, e caratterizzazioni biologiche delle particelle ambientali raccolti. 2-11 Il vantaggio di questo approccio è che varie analisi possono essere eseguito off-line sullo stesso campione. Compilare i dati provenienti da tutte le diverse analisi permette al ricercatore di ottenere una buona comprensione delle caratteristiche delle particelle raccolte e aiuti a risolvere questioni complesse nel campo delle scienze atmosferiche. 12,13 Per esempio, marine ed interne aria-campioni prelevati durante la stessa periodo può essere confrontata rispetto alla tossicità particelle campionata e composizione biologica. 14 per questo studio, lipopolisaccaridi (LPS), componenti batteriche pareti cellulari gram-negativi, noto anche come endotossine, sono stati estratti dai filtri campionata on-shore ea un sito interno, e sono stati valutati utilizzando ilLimulus lisato di amebociti (LAL). In parallelo, una valutazione genomica della carica batterica (batteri totali, gram negativi, e cianobatteri) è stata eseguita sullo stesso campione usando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (q-PCR). Il test LAL si basa su misure di torbidità formate in seguito all&#39;aggiunta di un estratto acquoso di amebociti dal limulo, Limulus polyphemus, ad una soluzione acquosa contenente le endotossine. Maggiore è la concentrazione di endotossina nel campione, la torbidità veloce sviluppa. 15 L&#39;analisi q-PCR si basa su un segnale di fluorescenza emessa da uno specifico frammento di DNA amplificato. 16 Con il monitoraggio in tempo reale del segnale durante la fase esponenziale della PCR reazione e calibrazione con una curva standard, l&#39;importo iniziale di DNA possono essere quantificati. La combinazione di queste due analisi insieme ad altri, come descritto altrove, 14 possono fornire una buona stima dei livelli di endotossina equantità di batteri di origine nei campioni. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un&#39;analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. Mentre i metodi per il campionamento delle caratteristiche chimico fisiche ed inorganici aerosol sono ben noti e, più recentemente, sono stati sviluppati metodi per indagare sua componente materia organica, 17 vi è stata la ricerca scarsa sulla componente biologica di aerosol. 18 Il razionale per la corrente il metodo è quello di affrontare questa lacuna presentando in dettaglio un metodo robusto per l&#39;estrazione, l&#39;analisi e l&#39;identificazione la frazione biologica di aerosol nell&#39;aria. 14 Il metodo descritto qui è prevista per trovare impiego diffuso in progetti di ricerca biologica per interni ed esterni di aerosol che coinvolgono l&#39;analisi del filtro. 20-24

<table><tbody><tr><td>Campionamento filtri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiVol 3000 - Campionatore d'aria ad alto volume</td><td>Filtri</td> in microfibra di quarzo Ecotech <td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman</td><td></td><td>1851-865</td><td>203 mm x 254 mm</td></tr><tr><td>ELF - Forni a camera da laboratorio</td><td>Carbolite</td><td>ELF 11series</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Opale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Endotoxin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16368&nbsp;</td><td>Reagente di laboratorio, 96%</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica Airstream Classe II AC-4E1</td><td>ESCO</td><td>10011712</td><td></td></tr><tr><td>Pyrotell -T</td><td>Associates di Cape Cod, Inc.</td><td>T0051</td><td></td></tr><tr><td>Standard di controllo Endotossina</td><td>Associates di Cape Cod, Inc.</td><td>E0005-1</td><td>Escherichia coli&nbsp; O113:H10, 0,5 & micro; g/fiala 1 confezione di</td></tr><tr><td>reagente LAL Water</td><td>Associates di Cape Cod, Inc.</td><td>W0051</td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile da 10 ml con punta Luer-Lok</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td></td><td></td>309605</tr><tr><td>BD Precisionglide ago per siringa</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td>305129</td><td>Sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>Nastro sigillante Parafilm-M</td><td>Parafilm</td><td>P7543</td><td>Sigma numero di catalogo</td></tr><tr><td>Microtubi</td><td>Axigen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 ml, apirogeno</td></tr><tr><td>1,12 cm di diametro Alesatore per sughero</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601 Serie BD - Acciaio</td><td>Parte di un set di alesatori per sughero contenente alesatrici con vari diametri.&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 50 mm</td><td>Miniplast Ein-Shemer</td><td>72050-01</td><td>Vortice asettico</td></tr><tr><td>Genie 2&nbsp;</td><td>Industrie scientifiche, inc.</td><td>SI-0297</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5415 D</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>TC MicroWell 96 F SI c/coperchio</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Pozzetti a fondo piatto (con coperchio (confezionato singolarmente)), sterili, apirogeni</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre a rilevamento multiplo Synergy HT Biotek</td><td></td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA away</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>DNA standard delle specie microbiche di interesse</td><td>ATCC o altra collezione</td><td></td> di colture <td>O il ceppo microbico appropriato per l'estrazione del DNA o il DNA estratto</td></tr><tr><td>Emocitometro Neubauer</td><td>Marienfeld</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>tampone TE, Low EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,0)&nbsp; 0,1 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Acqua PCR priva di nucleasi&nbsp;</td><td>Primer per PCR Sigma Aldrich</td><td>3315959001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Prende di mira le specie microbiche di interesse</td></tr><tr><td>Sonde a doppia marcatura</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Prende di mira le specie microbiche di interesse</td></tr><tr><td>Provette con tappo a vite</td><td>Axigen</td><td>ST-200-SS</td><td>2 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA PowerSoil&nbsp;</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro, lavate con acido 425-600 & micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772-100G</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro, lavate con acido < 106 &micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4649-100G</td><td></td></tr><tr><td>PowerSoil Solution C1</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100-1</td><td>Tampone di lisi cellulare, Power soil Kit</td></tr><tr><td>Magic Touch secchiello per il ghiaccio</td><td>Bel-Art</td><td>18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607EUR</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema PCR in tempo reale</td><td>Biosistemi applicati</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Veloce SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4370048</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica rapida a 96 pozzetti MicroAmp con codice a barre, 0,1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Base a 96 pozzetti senza spruzzi</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>pellicola</td> <td>adesiva ottica MicroAmpApplied Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td>Rotore A-4-62 con secchi MTP&nbsp;</td></tr></tbody></table>

filtro analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di dna

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

la ricerca di aerosol all&#39;aperto comunemente utilizza il particolato di campionamento su filtri. Questa procedura permette diverse caratterizzazioni di particelle raccolte da eseguire in parallelo. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un&#39;analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. L&#39;estrazione di alto peso molecolare molecole organiche, come lipopolisaccaridi, da filtri campione comporta agitando il campione in un mezzo a base di acqua apirogena. La successiva analisi si basa su una reazione enzimatica che può essere rivelato utilizzando una misurazione turbidimetrico. Come risultato di elevato contenuto organico sui filtri campione, l&#39;estrazione del DNA da campioni viene effettuata usando un kit di estrazione del DNA commerciale che è stato originariamente progettato per suoli e modificato per migliorare la resa DNA. L&#39;individuazione e la quantificazione delle specie microbiche specifici utilizzando riatti a catena della polimerasi quantitativaon (q-PCR) sono descritti e confrontati con altri metodi disponibili.

È comune per studiare aerosol atmosferici usando &quot;off-line&quot; analisi di filtri campione (vedere Figura 2). Analisi 32 chimica del contenuto campionato sostanza includere organica (ad esempio proteine, molecole di idrocarburi, saccaridi) ed inorganici (ad esempio metalli, sali) . analisi biologiche includono contenuti vitali e non vitali microorganismo, identificazione delle specie utilizzando un approccio DNA o la microscopia, nonché...

Qui sono descritte due analisi complementari di particelle biologiche atmosferiche provenienti da filtri campionati in aria: l'estrazione e la rilevazione di endotossine e di DNA.

Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come analizzare con precisione il contenuto di endotossine e DNA delle particelle aerodisperse estratte e campionate su filtri. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sugli aerosol biologici interni ed esterni, ad esempio comprendere le cause sanitarie. La procedura di campionamento su filtro sarà dimostrata da Yinon Mazar, uno studente laureando del mio laboratorio.Per campionamenti ad alto volume, utilizzare filtri in fibra di quarzo. In alternativa, scegliere il tipo specifico di filtro e la dimensione di cutoff del filtro più adatti alle esigenze della ricerca. Preriscaldare i filtri destinati al campionamento di composti organici e biologici avvolgendoli singolarmente in fogli di alluminio.E quindi cuocerli in un forno da laboratorio a 450 gradi Celsius per almeno cinque ore. Questo distruggerà eventuali residui organici preesistenti. Conservare i filtri cotti a 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso per il campionamento.Successivamente, pulire e disinfettare il campionatore ad alto volume, come quello descritto nel protocollo testuale allegato. Quindi, inserire il filtro preriscaldato nella capsula del filtro ed eseguire il campionamento seguendo le istruzioni del produttore per raccogliere un campione appropriato. All'interno di una cappa biologica di classe due, tagliare 22 pezzi circolari di materiale filtrante pulito e preriscaldato utilizzando un punzone sterile di 1,12 centimetri di diametro.Utilizzare questi pezzi per preparare una serie di filtri aggiunti con endotossina da usare come controlli. Successivamente, tagliare i filtri contenenti il campione raccolto utilizzando un trapano per tappi pulito con diametro di 1,12 centimetri e posizionare ciascun campione in un tubo privo di pirrogeni da due millilitri. Inoltre, trasferire i filtri essiccati aggiunti con endotossina in tubi privi di pirrogeni da due millilitri separati.Aggiungere un millilitro di acqua priva di pirògeni a ciascuna provetta. Agitarle quindi per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un agitatore da laboratorio. Successivamente, centrifugare le provette in un microcentrifugo a 375 ×g per 10 minuti.Quindi, trasferire il sopranatante, che contiene gli endotossine, in un nuovo tubo privo di pirrogeni da due millilitri. Preparare una piastra microtitolazione priva di pirrogeni da 96 pozzetti con fondo piatto e coperchio per il test delle endotossine, definendo innanzitutto le posizioni dei campioni.Successivamente, accendere il lettore di micropiastre e programmarlo per una reazione cinetica a 37 gradi Celsius con agitazione ogni cinque minuti, seguita da letture a 405 nanometri. Ripetere l'agitazione di cinque minuti e la lettura della piastra 18 volte.Caricare i campioni nell'acate posizionando 50 microlitri delle soluzioni standard di endotossina precedentemente utilizzate per contaminare i filtri nelle righe da A1 ad A10 e da B1 a B10. Posizionare i bianchi in A11, A12, B11 e B12. Successivamente, aggiungere il sopranatante ottenuto dall'estrazione del filtro contaminato centrifugato e i relativi bianchi nelle righe C e D. Quindi, aggiungere i sopranatanti dei campioni sperimentali e dei bianchi nelle pozzette rimanenti secondo necessità.Per attivare il test, aggiungere rapidamente 50 microlitri di soluzione di glicolato di amebociti di Limulus in ciascun pozzetto. Agitare delicatamente la piastra in orizzontale. Prima di posizionarla nel lettore di piastre e avviare la corsa sperimentale.Al termine, rimuovere la piastra dal lettore di piastre. Determinare il livello di endotossine in ogni campione utilizzando la curva standard e calcolare anche l'efficienza con cui le endotossine vengono estratte dai filtri del campione. Preparare innanzitutto i filtri spikeati con DNA come descritto nel protocollo testuale allegato.Per ogni campione di filtro, preparare una miscela di perline di vetro lavate con acido in provette sterili da 0,5 millilitri, aggiungendo 0,1 grammi di perline con un diametro compreso tra 425 e 600 micrometri e 0,3 grammi di perline con un diametro minore o uguale a 106 micrometri. Successivamente, tagliare tre pezzi circolari da posizioni scelte casualmente su ciascun campione di filtro utilizzando un punzone sterile di diametro 1,12 centimetri. Posizionare i campioni di filtro in provette individuali da due millilitri con tappo a vite.Quindi, aggiungere la miscela di perline di vetro in ogni provetta insieme a 60 microlitri del tampone di lisi cellulare fornito con il kit di estrazione del DNA. Chiudere le provette e posizionare i campioni nel bead beater. Utilizzare il bead beater per rompere meccanicamente le cellule filtrate per un minuto, quindi raffreddare i campioni ponendoli sul ghiaccio per un minuto aggiuntivo.Ripetere questo ciclo cinque volte. Procedere seguendo il protocollo del fornitore del kit ed estrarre il DNA dalle cellule lisate. Dopo l'eluzione, ricaricare il campione eluito attraverso la colonna di estrazione una seconda volta per migliorare il rendimento del DNA.Accendere in anticipo lo strumento di PCR quantitativa per consentirgli di riscaldarsi. In un nuovo file di programma, inserire i dettagli per l'esecuzione della PCR quantitativa nel software operativo dello strumento. Successivamente, disinfettare la superficie di lavoro con un decontaminante per DNA da superficie e utilizzare esclusivamente provette, punte e reagenti sterili.Inoltre, posizionare un secchio con ghiaccio accanto al banco di lavoro e mettere la miscela di tac polemoraris nel secchio. Preparare la miscela di reazione per PCR quantitativa come descritto nella tabella quattro del protocollo testuale allegato. Conservare la miscela di reazione al buio e sul ghiaccio fino al momento dell'uso.Successivamente, posizionare una micropiastra pulita in un supporto per piastre per evitare che entri in contatto con la superficie di lavoro e per mantenerla pulita. Aggiungere un microlitro di DNA standard, DNA del campione o acqua priva di nucleasi nei pozzetti della micropiastra per PCR quantitativa in triplice replicato. Quindi, aggiungere nove microlitri della miscela di reazione master in ciascun pozzetto di reazione.Una volta terminato, coprire la piastra con un film adesivo ottico e sigillarla accuratamente su tutti i lati. Centrifugare la piastra in una centrifuga dotata di portapiastra per un minuto a 1000 ×g prima di posizionarla nel termociclatore. Infine, attivare ed eseguire il programma di PCR quantitativa preparato.Durante l'estrazione dell'endotossina, i campioni filtrati vengono centrifugati per estrarre l'endotossina dal filtro. Velocità di centrifugazione diverse determinano efficienze di estrazione differenti, specialmente a concentrazioni elevate di endotossina.Deve essere condotto un test preliminare dell'efficienza di estrazione per il filtro specifico scelto e per il protocollo eseguito. Si ottengono efficienze di estrazione più elevate aggiungendo campioni puri su filtri puliti, rispetto ai filtri al quarzo campionati, e entrambe queste efficienze sono inferiori a quelle ottenute mediante la rilevazione diretta della soluzione standard. Una volta acquisita padronanza, l'analisi degli endotossine può essere completata in tre ore e mezza se eseguita correttamente.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il sequenziamento del DNA per rispondere a ulteriori domande riguardanti il trasporto di organismi nell'atmosfera. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come estrarre in modo efficiente endotossine e DNA da filtri di campioni d'aria e analizzarli con precisione.

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Saggio dell'attività delle endotossine: un saggio biologico basato sulla chemiluminescenza per studiare l'attività delle endotossine in un campione di sangue

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Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA

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