Name: Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Impara a trasformare Saccharomyces boulardii per esprimere proteine eterologhe nel tratto gastrointestinale murino. Questo metodo consente la manipolazione genetica senza selezione antibiotica e verifica l'adesione ai tessuti immunitari.

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Gli autori riconoscono il finanziamento attraverso il centro della bambini per Immunologia e vaccini e di un nuovo premio Innovator NIH (1DP2AI112242-01) assegnato a Tracey J. Lamb. Gli autori ringraziano anche Natalya P. Degtyareva per il generoso contributo di RAD1 S. cerevisiae.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Insieme, i protocolli qui descrivono le fasi essenziali necessarie per lo sviluppo e la sperimentazione di ceppi di lievito probiotici auxotrofi per la consegna della proteina terapeutica eterologa per l&#39;intestino. Questa manipolazione e la sperimentazione di ricombinante lievito probiotico richiede tecniche e le risorse con cui ogni singolo laboratorio non può attualmente essere a conoscenza. Quindi, anche se numerosi studi precedenti hanno descritto i protocolli di cui sopra per più di lievito e mouse ceppi, quest...

microrganismi probiotici sono un intrigante potenziali mezzi di fornire in modo efficiente ed economicamente proteine ​​eterologhe al tratto gastrointestinale. Questi organismi sono in grado di sopravvivere passaggio attraverso il tratto gastrointestinale ancora non colonizzare 1 che, consentendo dosaggio controllato e limitando l&#39;esposizione al farmaco espresso. Inoltre, la possibilità di progettare facilmente questi organismi per produrre proteine ​​eterologhe su larga scala li rende un&#39;alternativa economica alle particelle di consegna sintetici. Tuttavia, lo sviluppo di un tale approccio, come recentemente dimostrato mediante un ceppo auxotrophic di lievito Saccharomyces probiotici boulardii 2, richiede la conoscenza di tecniche di laboratorio non tradizionalmente combinati all&#39;interno di un dato studio, che vanno dal lievito e biologia molecolare alle tecniche di manipolazione degli animali e metodi immunologici. Così, sebbene le singole procedure descritte nel presente documento non sono di per sé romanzoprotocolli di laboratorio, l&#39;obiettivo di questo manoscritto è di presentare una introduzione unificato per le tecniche necessarie per la prova sperimentale di lievito probiotico come veicoli di consegna della droga al tratto gastrointestinale murino. Fornito è una raccolta di protocolli essenziali per: 1) generazione di ceppi mutanti auxotrofi di lievito che può facilmente essere manipolato geneticamente; 2) la trasformazione di colture di lieviti per esprimere la proteina eterologa; 3) la somministrazione di lievito ricombinante per l&#39;intestino tramite sonda gastrica; e 4) il recupero di vitale lievito probiotico ricombinante dall&#39;intestino murino e la valutazione della loro espressione della proteina eterologa. In primo luogo, anche se esistono numerosi metodi di selezione positivi e negativi per la manipolazione delle specie di lievito, selezione negativa ad esempio attraverso l&#39;uso di marcatori auxotrofi aumenta l&#39;efficienza e la facilità con cui il lievito può essere trasformata e selezionato. selezione positiva dei trasformanti che utilizzano antibiotici, in collaborazionentrast, aumenta significativamente il costo di manipolazione lievito. Inoltre, la selezione di lievito su supporti solidi antibiotici contenenti può consentire un aumento della crescita di fondo non trasformate colonie relativi alla selezione di lievito auxotrophic su goccia sintetica fuori terreni solidi (osservazioni non pubblicate). lievito auxotrophic è ceppi che mancano di enzimi fondamentali per la sintesi di amminoacidi essenziali o uracile. Tale lievito può crescere solo se integrato con il metabolita mancante o gene metabolica, consentendo in tal modo la selezione negativa quando il lievito è placcato sul calo sintetico fuori media che manca il metabolita essenziale. Molti Saccharomyces cerevisiae comunemente utilizzati ceppi di laboratorio sono infatti già mutanti auxotrofi 3. Industriale, clinica, e ceppi di lievito probiotici, tuttavia, sono tipicamente prototrofici con la capacità di sintetizzare tutti i nutrienti necessari. Per consentire una più efficace manipolazione genetica di tale lievito, i geni auxotrofi possono essere selettivamente miratigenerare ceppi che possono essere selezionati senza antibiotici. Il targeting specifico di geni marcatori auxotrofi può essere raggiunto attraverso distruzione genica PCR-mediata affidamento su ricombinazione omologa o, più recentemente, attraverso CRISPR / Cas9 mira 4-6. In alternativa, mutagenesi UV può generare rapidamente mutanti auxotrofi anche in ceppi di lievito per i quali la trasformazione con più plasmidi è tecnicamente difficile 7. Mentre PCR targeting e CRISPR / Cas9 sono stati descritti ampiamente altrove, presentato nella prima parte di questo manoscritto è un protocollo dettagliato che descrive un approccio mutagenesi UV per creare ceppi auxotrofi che permetteranno di selezione negativa, piuttosto che la selezione antibiotica positivo di trasformanti lievito. Il successivo passo necessario l&#39;uso di tali ceppi auxotrofi consegna orale di proteine ​​eterologhe è il lievito trasformazione con DNA plasmidico. Dal momento che la prima trasformazione di successo di voti a favoret sferoplasti riportati per Saccharomyces cerevisiae nel 1978 8, numerose modifiche sono stati caratterizzati per aumentare l&#39;efficienza e la facilità con cui le specie di lievito possono essere geneticamente modificate. Uso di elettroporazione per la trasformazione di successo di DNA in S. cerevisiae è stato descritto nel 1985 9 e da allora è stato migliorato tramite l&#39;aggiunta di incubazione 1 M sorbitolo al osmoticamente cellule di supporto 10. Efficienza elettroporazione è stato inoltre dimostrato che in relazione alla specie di lievito e ceppo, numero di cellulare e fase di crescita, di volume elettroporazione, intensità di campo, e tamponi specifici 11. Litio acetato (LiOAc) trasformazione, originariamente descritto da Ito et al. 12, è tra i protocolli di trasformazione più comunemente utilizzati in quanto non richiede particolari attrezzature. Ulteriori analisi hanno dimostrato che l&#39;efficienza di LiOAc lievito trasformazione aumenta notevolmente quando le cellule vengono raccolte a metà log fasedi crescita e sono calore scosso in presenza di polietilenglicole (PEG) e DNA a 42 ° C 12. L&#39;incubazione di intero lievito intatto con PEG è essenziale per la trasformazione efficiente, eventualmente migliorando attacco del DNA alla membrana cellulare, nonché tramite altri effetti sulla membrana 13. Litio si aumenta la permeabilità delle cellule intatte 14. Sebbene la maggior parte di laboratorio S. cerevisiae può essere facilmente trasformato utilizzando LiOAc trasformazione 3, altre specie di lievito possono essere trasformati più efficiente utilizzando protocolli alternativi. Pichia pastoris, per esempio, è più efficiente trasformato tramite elettroporazione anziché LiOAc trasformazione 13. È fondamentale, quindi, per testare multipla metodi di trasformazione e di ottimizzare tempi di incubazione e concentrazioni dei reagenti quando si tenta di modificare geneticamente un ceppo di lievito non caratterizzato. Questo manoscritto descrive così sia LiOAc transformation ed elettroporazione come tecniche per la trasformazione di mutante auxotrophic e wild type S. boulardii. I lettori interessati sono diretti alle recensioni recenti per la descrizione approfondita dell&#39;evoluzione di lievito trasformazione, protocolli alternativi, e ulteriori discussioni di possibili meccanismi di azione 13,15. Trasformazione di lievito con plasmide codificante una proteina facilmente rilevabile è inoltre essenziale per test a valle per garantire un&#39;adeguata espressione e la funzione della proteina eterologa. Myriad proteine ​​diverse possono essere selezionati a seconda dello scopo finale dello studio terapeutico e gli anticorpi disponibili per il rilevamento di proteine ​​di immunoblotting, ELISA, e altre tecniche. Protocolli per queste tecniche sono state accuratamente descritto altrove 16,17, e possono essere utilizzati per determinare i livelli di produzione di proteine ​​eterologhe dal lievito trasformato in confronto a curve standard. Ai fini della dimostrazione e per mostrareproduzione di successo di una proteina molto comunemente usato in biologia lievito, questo manoscritto presenta trasformazione con proteine ​​plasmide codificante fluorescente verde (GFP), che consente la successiva rivelazione utilizzando microscopia a fluorescenza. Altrettanto importante per la produzione di organismi probiotici che esprimono la proteina eterologa è la corretta gestione e rilevazione di questi microrganismi all&#39;interno dei tessuti gastrointestinali, come descritto nelle parti tre e quattro. La somministrazione di lievito ricombinante tramite gavage orale consente di erogazione di quantità controllate di lievito direttamente nello stomaco, da cui C57BL / 6 topi sono naturalmente incapaci di vomito 18. Tuttavia, la manipolazione degli animali improprio e sonda gastrica può portare a danni esofagea e perforazione, perforazione gastrica, somministrazione tracheale, e polmonite da aspirazione 19,20. scarsa tecnica e l&#39;inesperienza può, inoltre, aumentare la variabilità nella risposta immunitaria murini e resu sperimentaleLTS, che sono stati attribuiti allo stress degli animali sulla sonda gastrica 21,22. Pratica nella tecnica adeguata può attenuare quindi non solo disagio animale, ma può anche aumentare la precisione dei risultati sperimentali. Questo manoscritto descrive e dimostra la movimentazione degli animali e sonda gastrica per la somministrazione di dosi controllate di lievito ricombinante. Infine, è fondamentale per confermare il successo di consegna di lievito ricombinante analizzando tessuti linfoidi per la presenza di lievito e proteine ​​eterologhe. I tessuti immunitarie gastrointestinali che possono più facilmente e prevedibilmente essere esaminata per la presenza di lievito sono patch di Peyer. Placche di Peyer sono organi linfoidi secondari lungo l&#39;intestino tenue che sono i siti principali della mucosa induzione risposta immunitaria 23. Gli antigeni dal lume vengono trasferiti attraverso transcellularly microfold cellule (M) nell&#39;epitelio e vengono rilasciati nel patch di Peyer, quindi esponendo racchiudered cellule presentanti l&#39;antigene di intestinali contenuto luminale. Sebbene l&#39;assorbimento di particelle attraverso l&#39;epitelio intestinale può essere ottenuto anche con cellule caliciformi, queste cellule hanno dimostrato di prendere soltanto particelle inferiore a 0,02 micron di diametro 24. Dendriti transepiteliale estesi da cellule dendritiche CD103 + (DC) anche richiedere fino piccole particelle dalla intestinale lume 25; tuttavia, attualmente non esistono rapporti che dimostrano che CD103 + DC occupano particelle più grandi di batteri. Così, intatto lievito probiotico, di dimensione media tra 3-6 micron di diametro, hanno più probabilità di essere ripreso da cellule M e trasferito alle patch di Peyer. Qui descritto è un protocollo per la raccolta e lo screening delle placche di Peyer di vitale lievito ricombinante, anche se questa procedura può anche essere facilmente adattato per valutare l&#39;assorbimento di batteri probiotici. In sintesi, la valutazione ricombinante lievito probiotico per la consegna delproteine ​​rapeutic per l&#39;intestino richiede padronanza di tecniche di laboratorio che misurano biologia molecolare alla movimentazione degli animali e immunologia. protocolli qui presentati sono per 1) la generazione e la proiezione di ceppi di lievito auxotrofi che può essere facilmente negativamente selezionato senza antibiotici, 2) protocolli alternativi per trasformare il lievito e consentono l&#39;espressione di proteine ​​eterologhe, 3) dimostrazioni di corrette tecniche di manipolazione degli animali e sonda gastrica per consegna intragastrica di lievito ricombinante, e 4) protocolli per la dissezione di patch di Peyer e lo screening di vitale lievito ricombinante e proteina eterologa funzionale. Insieme, questi protocolli consentiranno la generazione e la verifica di un ceppo di lievito probiotico in grado di erogare proteina terapeutica eterologa al tratto gastrointestinale.

<table><tbody><tr><td>Spettrofotometro SmartSpec 3000</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Esempio di spettrofotometro per la determinazione della concentrazione cellulare e OD600 di colture di lievito</td></tr><tr><td>New Brunswick Roller Drum</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Esempio di tamburo a rulli per l'incubazione di colture di lievito</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Esempio di stratalinker</td></tr><tr><td>Contatore di colonie Stuart SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Plate stand con record di ingrandimento conteggio delle colonie dopo aver rilevato la pressione dalla penna</td></tr><tr><td>Scienceware Colony Counter</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Penna contante colonia portatile</td></tr><tr><td>Dispositivo di placcatura replica</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Esempio di supporto e pastiglie di placcatura replica</td></tr><tr><td>Quadrati in velluto</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>Spandiconcime per celle sterili a forma di L&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Acido desossiribonucleico, a filamento singolo da testicoli di salmone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Esempio di DNA vettore per la trasformazione del lievito LiOAc</td></tr><tr><td>Aghi di gavage</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>Per i topi da 15-20 g, l'ago suggerito è un ago da 22 gauge (palla da 1,25 mm), lungo 1 pollame, dritto e riutilizzabile. Per topi di peso superiore a 20&nbsp; g, possono essere utilizzati aghi per sonda magnetica dritti o curvi calibro 20 o più grandi</td></tr><tr><td>siringa sterile per tubercolina monouso con punta a slitta da 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Pinze smussate come Electron Microscopy Sciences Punta seghettata da 7" (178 mm), pinze a presa larga</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77937-28</td><td>Esempio di pinze smussate necessarie per la dissezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione diritte e curve</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72966-02 e 72966-03</td><td>Esempi di forbici necessarie per la dissezione</td></tr><tr><td>Tecnologie IMDM</td><td>Life</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Lo sviluppo di una terapia orale ricombinante consentirebbe un targeting più diretto del sistema immunitario della mucosa e migliorerebbe la capacità di combattere i disturbi gastrointestinali. L'adattamento del lievito probiotico in particolare per questo approccio comporta diversi vantaggi. Questi ceppi non solo hanno il potenziale per sintetizzare un'ampia varietà di proteine eterologhe complesse, ma sono anche in grado di sopravvivere e proteggere tali proteine durante il transito attraverso l'intestino. Tuttavia, questo approccio richiede competenze in molte tecniche di laboratorio diverse non tipicamente utilizzate in tandem. Inoltre, sebbene i singoli protocolli per la trasformazione del lievito siano ben caratterizzati per i ceppi di laboratorio comunemente usati, l'accento è posto qui su approcci alternativi e sull'importanza di ottimizzare la trasformazione per i ceppi probiotici meno ben caratterizzati. Dettagliare questi metodi aiuterà a facilitare la discussione sui migliori approcci per testare il lievito probiotico come veicoli di somministrazione orale di farmaci e servirà a far progredire lo sviluppo di questa nuova strategia per la terapia gastrointestinale.

Generazione di una curva di sopravvivenza dopo irradiazione UV richiede la placcatura di cellule di lievito diluito in modo tale che le unità distinte formanti colonie (CFU) sono in grado di formare. Ogni campione 500 microlitri raccolto come sopra descritto contiene circa 5 x 10 6 cellule; Tuttavia, più di 100 colonie per piastra sono difficili da distinguere accuratamente. Placcatura campione diluito e seriali 1:10 diluizioni di cellule irradiate garantisce così che CFU poss...

Presentato qui è una descrizione unificata di tecniche che possono essere utilizzati per sviluppare, trasformare, amministrare e verificare l&#39;espressione della proteina eterologa dei probiotici lievito Saccharomyces boulardii.

Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

L'obiettivo generale di queste procedure è sviluppare un ceppo di lievito probiotico che possa essere facilmente trasformato per esprimere e rilasciare proteine eterologhe nell'apparato gastrointestinale del topo. Il principale vantaggio di queste tecniche è che consentono la rapida generazione di ceppi ossitrofici di lievito probiotico. Questi lieviti mutanti possono quindi essere manipolati geneticamente senza dover ricorrere alla selezione antibiotica.L'administrare per via orale tramite gavaggio nei topi e il prelievo delle placche di Peyer permettono inoltre di verificare l'adesione dei lieviti mutanti ai tessuti immunitari gastrointestinali. Questi metodi contribuiranno a rispondere a domande fondamentali nel campo della vaccinazione orale e faciliteranno esperimenti volti a testare probiotici per il rilascio di terapie gastrointestinali. Dopo aver preparato il mezzo YPD e fatto crescere i lieviti per tutta la notte fino alla saturazione, diluire le cellule da uno a dieci in acqua in una cuvetta di plastica.Quindi, utilizzare uno spettrofotometro e determinare la densità ottica della coltura ottenuta dopo l'incubazione notturna. Diluire le cellule con 20 millilitri di acqua d

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra una procedura di trapianto di microbiota fecale in un topo carente di interleuchina-10 con infiammazione del colon. I microbi fecali colonizzati nell'intestino rilasciano metaboliti secondari, provocando il rilascio di citochine antinfiammatorie e riducendo l'infiammazione del colon.

Valutazione degli effetti del trapianto di microbiota fecale in un topo carente di interleuchina-10

Questo video mostra la somministrazione orale di cellule di lievito trasformate in un modello murino. Le cellule di lievito trasformate vengono somministrate per via orale utilizzando una tecnica di gavage, raggiungendo lo stomaco del topo. Successivamente, le cellule migrano verso l'intestino tenue, dove le cellule microfold le inghiottono e facilitano il loro trasferimento ai cerotti di Peyer e ottengono l'accesso al sistema immunitario intestinale.

Somministrazione orale di cellule di lievito trasformate nel sistema immunitario intestinale del topo

Qui forniamo protocolli dettagliati per la somministrazione orale di antibiotici ai topi, raccolta di campioni di feci, estrazione del DNA e quantificazione di batteri fecali di qPCR.

Analisi di basati su reazione a catena della polimerasi quantitativa del Microbiota intestinale murina dopo il trattamento antibiotico orale

Questo studio dettaglia il processo di quantità precisa di gavaging di probiotici per topi neonatali. Il set-up sperimentale è stato ottimizzato per includere ma non è limitato ai probiotici di dosaggio, metodi di somministrazione e la quantificazione dei batteri nell'intestino.

Studi di probiotici in topi neonatali tramite sonda gastrica

Descriviamo un nuovo metodo per generare doppi topi BLT umani umani umani che presentano un sistema immunitario umano funzionale e un microbioma intestinale innestato stabile. Questo protocollo può essere seguito senza la necessità di topi privi di germi o strutture gnotobiotiche.

Un modello di topi BLT a doppia umanizzata caratterizzato da un microbioma intestinale umano stabile e un sistema immunitario umano

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare Candida albicans forma cellulare e localizzazione nel tratto gastrointestinale dei mammiferi.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

L'interazione tra suscettibilità genetica, immunità mucosa e ambiente microecologico intestinale è coinvolta nella patogenesi della malattia infiammatoria intestinale (IBD). In questo studio, abbiamo applicato il trapianto di microbiota fecale a topi carenti di IL-10 e abbiamo studiato il suo impatto sull'infiammazione del colon e sulla funzione cardiaca.

Valutazione terapeutica del trapianto di microbiota fecale in un modello murino carente di interleuchina 10

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire il modello murino di colite indotta da sodio con destrano solfato pseudo-germe indotto da antibiotici per studiare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti positivi del Bacillus cereus sulla colite.

Indagine sugli effetti attenuanti della somministrazione di Bacillus cereus sulla colite attraverso la modulazione del microbiota intestinale

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Questo protocollo descrive le migliori pratiche per il trasferimento e l'alloggiamento di topi privi di germi in isolatori sperimentali a gabbia singola (isocage) mantenendo condizioni sterili. Vengono discussi i metodi per il trapianto fecale in topi privi di germi e la raccolta di batteri vitali da questi topi "umanizzati" intestinali per ulteriori applicazioni.

Preparazione e mantenimento dell'esperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi

Impara a trasformare Saccharomyces boulardii per esprimere proteine eterologhe nel tratto gastrointestinale murino. Questo metodo consente la manipolazione genetica senza selezione antibiotica e verifica l'adesione ai tessuti immunitari.

Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

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