Preparazione di Thermoresponsive Nanostrutturati Superfici Tissue Engineering

L'obiettivo generale di questo metodo di Langmuir-Schaefer con copolimeri a blocchi è quello di fabbricare fogli cellulari su varie condizioni della superficie sensibile alla temperatura, controllando la forza di adesione e gli attacchi delle cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei biomateriali, come i materiali biocompatibili, la superficie delle colture cellulari e la bioseparazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'interazione tra la superficie sensibile alla temperatura e le celle può essere controllata e le condizioni di modifica per il recupero del foglio cellulare possono essere ottimizzate.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione tra cellula e superficie, può essere applicato anche ad altri sistemi come la bioseparazione e il biofilm. Per iniziare, sciogliere stirene, ECT e ACVA in 40 millilitri di 1,4-diossano. Congelare la soluzione in azoto liquido sotto vuoto per 15-20 minuti per rimuovere le specie reattive.

Dopo aver scongelato gradualmente la soluzione a temperatura ambiente, ripetere questo ciclo di congelamento, pompa, scongelamento e degasaggio tre volte. Ottenere il polistirene come agente macro-RAFT mediante polimerizzazione a 70 gradi Celsius per 15 ore in bagno d'olio. Far precipitare l'agente polistirene macro-RAFT con 800 millilitri di etere e asciugare sotto vuoto.

Successivamente, sciogliere il monomero IPAAm, l'agente macro-RAFT in polistirene e ACVA in quattro millilitri di 1,4-diossano. Rimuovere l'ossigeno nella soluzione utilizzando i cicli di congelamento, pompa, scongelamento del degasaggio come prima. Eseguire una polimerizzazione a 70 gradi Celsius per 15 ore in un bagno d'olio dopo il degasaggio.

Infine, ottenere la molecola di St-IPAAm sintetizzata allo stesso modo dell'agente macro-RAFT in polistirene. Lavare i substrati di vetro con un eccesso di acetone ed etanolo e sonicare per cinque minuti per rimuovere i contaminanti superficiali. Asciugare i substrati in forno a 65 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, utilizzare il plasma di ossigeno per attivare le superfici dei substrati a temperatura ambiente. Immergere i substrati in toluene contenente l'1% di esatrimetossisilano per una notte a temperatura ambiente per silanizzare il substrato. Quindi, lavare i substrati silanizzati in toluene e immergerli in acetone per 30 minuti per rimuovere gli agenti non reagiti.

Ricuocere i substrati per due ore a 110 gradi Celsius per immobilizzare completamente la superficie. Infine, tagliare i substrati silanizzati con un tagliavetro a 25 millimetri per 24 millimetri per adattarli alle piastre di coltura cellulare. Posizionare lo strumento a pellicola Langmuir in un armadietto per evitare l'accumulo di polvere.

Lavare l'abbeveratoio di Langmuir in barriere con acqua distillata ed etanolo per rimuovere i contaminanti. Asciugare l'abbeveratoio e le barriere strofinando con un asciugamano privo di lanugine. Quindi riempire l'abbeveratoio con circa 110 millilitri di acqua distillata e posizionare le barriere su entrambi i lati dell'abbeveratoio.

Quindi, scaldare una piastra Wilhelmy di platino per monitorare la tensione superficiale, con un bruciatore a gas fino a quando la piastra non diventa rossa. Quindi lavare la piastra con acqua distillata per rimuovere i contaminanti. Sospendere la piastra Wilhelmy su un filo collegato allo strumento di misurazione della pressione superficiale.

Azzerare lo strumento di misura della pressione superficiale secondo il protocollo del produttore. Comprimere l'interfaccia aria, acqua sulla vasca dalle barriere su entrambi i lati della vasca fino a quando l'interfaccia raggiunge circa 50 centimetri quadrati senza gocce di polimero. Aspirare eventuali piccoli contaminanti fino a quando la pressione superficiale è quasi zero millinewton per metro.

Riposizionare le barriere su entrambi i lati e aggiungere acqua distillata per compensare la diminuzione dell'acqua distillata. Quindi, sciogliere cinque milligrammi della molecola sinetizzata di St-IPAAm in cinque millilitri di una soluzione di sviluppo di cloroformio. Quindi, versare delicatamente 27 microlitri di St-IPAAm disciolto in cloroformio, sul trogolo utilizzando una microsiringa o una micropipetta.

Dopo aver atteso cinque minuti per consentire la completa evaporazione del cloroformio, spostare entrambe le barriere orizzontalmente per comprimere la molecola di St-IPAAm in superficie. Mantenere la velocità di compressione delle barriere a 0,5 millimetri al secondo fino a raggiungere l'area target di 50 centimetri quadrati. Misurare le isoterme Pi-A della pressione superficiale con la piastra Wilhelmy in platino fissata allo strumento di misurazione della pressione superficiale durante la compressione, secondo il protocollo del produttore.

Dopo aver raggiunto la dimensione dell'area target, mantenere la superficie per cinque minuti per consentire alle molecole di St-IPAAm di rilassarsi. Le molecole non raggiungono l'equilibrio subito dopo la compressione. Quindi, trasferire il film di Langmuir su un substrato di vetro idrofobicamente modificato utilizzando un apparato di trasferimento per cinque minuti per assorbire in modo robusto il film.

Fissare il substrato di vetro idrofobico in parallelo sul dispositivo. Collegare il dispositivo a un tavolino di allineamento e muoverlo perpendicolarmente. Sollevare il substrato orizzontalmente con l'apparecchio di trasferimento e asciugarlo per un giorno in un essiccatore.

Per preparare sospensioni cellulari, colture di cellule endoteliali dell'arteria carotide bovina, o BAEC, a 1/3 di confluenza a 37 gradi Celsius in 5% CO2 e 95% di aria, su polistirene per colture tissutali con DMEM, contenente FBS e penicillina. Dopo aver raggiunto la confluenza, trattare i BAEC con tre millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% per tre minuti a 37 gradi Celsius in 5% CO2 e 95% aria. Disattivare la tripsina EDTA aggiungendo 10 millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS.

E raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver centrifugato a 120 volte g per cinque minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di DMEM. Seminare le cellule recuperate sulle superfici di St-IPAAm a una concentrazione di 10.000 cellule per centimetro quadrato, contate da un emocitometro monouso.

Osservare le cellule sulle superfici con un microscopio dotato di incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 e il 95% di aria. Successivamente, sterilizzare le superfici St-IPAAm con una luce ultravioletta dotata di un banco pulito. Registra immagini timelapse di BAEC aderenti per circa 24,5 ore a 37 gradi Celsius con un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 10x.

Dopo l'adesione al BAEC, registrare il distacco dei BAEC dalla superficie di St-IPAAm a 20 gradi Celsius per circa 3,5 ore. Dopo l'ottimizzazione dell'adesione e del distacco cellulare sulla superficie trasferita con film di Langmuir, fabbricare i fogli cellulari coltivando prima i BAEC come prima. Semina un totale di 100.000 cellule per centimetro quadrato su superfici St-IPAAm.

E incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius in 5% di CO2. I BAEC confluenti si staccano spontaneamente a 20 gradi Celsius. Qui viene mostrata la preparazione di una superficie trasferita con film di Langmuir sensibile alla temperatura.

La soluzione di cloroformio St-IPAAm sintetizzata è stata delicatamente lasciata cadere su un'interfaccia aria-acqua. Due barriere sono state utilizzate per comprimere le molecole di St-IPAAm sull'interfaccia fino a raggiungere un'area target di 50 centimetri quadrati. La pressione superficiale è stata misurata durante la compressione per rilevare eventuali difetti nel film di Langmuir.

Dopo la compressione, un substrato di vetro di copertura idrofobicamente modificato è stato posizionato orizzontalmente sull'interfaccia con uno stadio di allineamento. Il substrato è stato sollevato orizzontalmente e asciugato per un giorno. Dopo questa fase, le superfici di St-IPAAm erano pronte per l'uso in esperimenti di coltura cellulare.

I risultati rappresentativi delle immagini topografiche della microsopia a forza atomica delle superfici di St-IPAAm sono mostrati qui. Nanostrutture sono state osservate su entrambe le superfici di St-IPAAm. Le dimensioni e la forma delle nanostrutture dipendevano fortemente dall'AM e dalla composizione di St-IPAAm.

Qui, viene mostrata un'immagine macroscopica di un foglio cellulare recuperato su una superficie trasferita su film di Langmuir con St-IPAAm 480 e una AM di 40 nanometri quadrati per molecola. Le cellule hanno raggiunto la confluenza dopo tre giorni di coltura sulle superfici di St-IPAAm 170 e St-IPAAm 480 a 37 gradi Celsius. E il foglio cellulare è stato rapidamente recuperato dopo aver ridotto la temperatura da 37 a 20 gradi Celsius.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare, come progettare la composizione molecolare del polimero, fabbricare e trasferire il film di Langmuir, controllare l'adesione e il distacco delle cellule e recuperare il foglio cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dei biomateriali e dell'ingegneria tissutale per esplorare le interazioni tra cellule e superfici e le strategie di coltura cellulare da utilizzare nella medicina degenerativa. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del trapianto di cellule, perché questa tecnica ha il potenziale per fabbricare fogli cellulari di vari tipi di cellule, forniti dai pazienti.