Preparazione di Thermoresponsive Nanostrutturati Superfici Tissue Engineering

L'obiettivo generale di questo metodo Langmuir-Schaefer con copolimeri a blocchi è quello di fabbricare fogli cellulari in diverse condizioni di superfici sensibili alla temperatura, controllando l'intensità dell'adesione e dell'attacco delle cellule. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei biomateriali, come i materiali biocompatibili, le superfici per la coltura cellulare e la bioseparazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'interazione tra la superficie sensibile alla temperatura e le cellule può essere controllata, e le condizioni di modifica per il recupero dei fogli cellulari possono essere ottimizzate.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione tra cellula e superficie, può essere applicato anche ad altri sistemi come la bioripartizione e i biofilm. Per iniziare, sciogliere lo stirene, ECT e ACVA in 40 millilitri di 1,4-Diossano. Congelare la soluzione in azoto liquido sotto vuoto per 15-20 minuti per rimuovere le specie reattive.

Dopo aver scongelato gradualmente la soluzione a temperatura ambiente, ripetere questo ciclo di congelamento, aspirazione, scongelamento e degasaggio per tre volte. Ottenere l'agente macro-RAFT in polistirene mediante polimerizzazione a 70 gradi Celsius per 15 ore in un bagno d'olio. Precipitare l'agente macro-RAFT in polistirene con 800 millilitri di etere e asciugare sottovuoto.

Successivamente, sciogliere il monomero IPAAm, l'agente macro-RAFT in polistirene e l'ACVA in quattro millilitri di 1,4-Diossano. Rimuovere l'ossigeno dalla soluzione mediante cicli di degasaggio congelamento-pompa-scongelamento come in precedenza. Eseguire una polimerizzazione a 70 gradi Celsius per 15 ore in un bagno d'olio dopo il degasaggio.

Infine, ottenere la molecola di St-IPAAm sintetizzata nello stesso modo del macroagente RAFT in polistirene. Lavare i substrati di vetro con un eccesso di acetone ed etanolo e sottoporli a sonificazione per cinque minuti per rimuovere i contaminanti superficiali. Asciugare i substrati in stufa a 65 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, utilizzare il plasma di ossigeno per attivare le superfici dei substrati a temperatura ambiente. Immergere i substrati in toluene contenente esatrimetossililano al 1% per tutta la notte a temperatura ambiente per silanizzare il substrato. Quindi, lavare i substrati silanizzati in toluene e immergerli in acetone per 30 minuti per rimuovere i reagenti non reagiti.

Annullizzare i substrati per due ore a 110 gradi Celsius per immobilizzare completamente la superficie. Infine, tagliare i substrati silanizzati con un tagliavetro a dimensioni di 25 millimetri per 24 millimetri, in modo da adattarli alle piastre per colture cellulari. Posizionare lo strumento per film di Langmuir all'interno di un armadio per evitare l'accumulo di polvere.

Sciacquare la vasca di Langmuir e le barriere con acqua distillata ed etanolo per rimuovere i contaminanti. Asciugare la vasca e le barriere strofinando con un panno senza pelucchi. Successivamente, riempire la vasca con circa 110 millilitri di acqua distillata e posizionare le barriere su entrambi i lati della vasca.

Successivamente, riscaldare una piastra di platino Wilhelmy per il monitoraggio della tensione superficiale con un cannello a gas finché la piastra diventa rossa. Quindi lavare la piastra con acqua distillata per rimuovere i contaminanti. Sospendere la piastra di Wilhelmy su un filo collegato allo strumento di misurazione della pressione superficiale.

Azzera lo strumento di misurazione della pressione superficiale seguendo il protocollo del produttore. Comprimi l'interfaccia aria-acqua nella vaschetta utilizzando le barriere su entrambi i lati della vaschetta finché l'interfaccia non raggiunge circa 50 centimetri quadrati senza gocce di polimero. Aspira eventuali piccole impurità finché la pressione superficiale non è quasi pari a zero millinewton per metro.

Riposizionare le barriere su entrambi i lati e aggiungere acqua distillata per compensare la diminuzione dell'acqua distillata. Successivamente, sciogliere cinque milligrammi della molecola di St-IPAAm sintetizzata in cinque millilitri di una soluzione di sviluppo di cloroformio. Quindi, aggiungere delicatamente 27 microlitri di St-IPAAm disciolti in cloroformio nel recipiente utilizzando una microsiringa o una micropipetta.

Dopo aver atteso cinque minuti per consentire l'evaporazione completa del cloroformio, spostare entrambe le barriere orizzontalmente per comprimere la molecola di St-IPAAm sulla superficie. Mantenere la velocità di compressione delle barriere a 0,5 millimetri al secondo fino a raggiungere l'area obiettivo di 50 centimetri quadrati. Misurare le isoterme di pressione superficiale Pi-A mediante la piastra di platino di Wilhelmy collegata allo strumento di misurazione della pressione superficiale durante la compressione, seguendo il protocollo del produttore.

Dopo aver raggiunto la dimensione desiderata dell'area, mantenere la superficie per cinque minuti per permettere alle molecole di St-IPAAm di rilassarsi. Le molecole non raggiungono l'equilibrio immediatamente dopo la compressione. Successivamente, trasferire il film di Langmuir su un substrato di vetro modificato idrofobicamente utilizzando un apparato di trasferimento per cinque minuti, al fine di assorbire saldamente il film.

Fissare il substrato di vetro idrofobo in parallelo sul dispositivo. Collegare il dispositivo a uno stadio di allineamento e muoverlo perpendicolarmente. Sollevare il substrato orizzontalmente con l'apparato di trasferimento e lasciarlo asciugare per un giorno in un essiccatore.

Per preparare sospensioni cellulari, coltivare cellule endoteliali dell'arteria carotidea bovina, o BAEC, fino a raggiungere un terzo della confluenza a 37 gradi Celsius in 5% CO2 e 95% aria, su polistirene per colture cellulari con DMEM contenente FBS e penicillina. Una volta raggiunta la confluenza, trattare le BAEC con tre millilitri di tripsina EDTA 0,25% per tre minuti a 37 gradi Celsius in 5% CO2 e 95% aria. Inattivare la tripsina EDTA aggiungendo 10 millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS.

E raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione a 120 ×g per cinque minuti, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di DMEM. Seminare le cellule recuperate sulle superfici di St-IPAAm a una concentrazione di 10.000 cellule per centimetro quadrato, contate mediante emocitometro monouso.

Osservare le cellule sulle superfici mediante un microscopio dotato di incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di CO2 e 95% di aria. Successivamente, sterilizzare le superfici di St-IPAAm mediante luce ultravioletta fornita da un bancone laminare. Registrare immagini in time-lapse di BAEC aderenti per circa 24,5 ore a 37 gradi Celsius mediante un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 10x.

Dopo l'adesione delle BAEC, registrare il distacco delle BAEC dalla superficie di St-IPAAm a 20 gradi Celsius per circa 3,5 ore. Dopo l'ottimizzazione dell'adesione e del distacco cellulare sulla superficie trasferita con film di Langmuir, produrre i fogli cellulari coltivando innanzitutto le BAEC come in precedenza. Seminare un totale di 100.000 cellule per centimetro quadrato sulle superfici di St-IPAAm.

E incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius in 5%CO2. Le BAEC confluenti si sono staccate spontaneamente a 20 gradi Celsius. Qui viene mostrata la preparazione di una superficie trasferita con film di Langmuir sensibile alla temperatura.

La soluzione di St-IPAAm in cloroformio è stata delicatamente depositata su un'interfaccia aria-acqua. Sono state utilizzate due barriere per comprimere le molecole di St-IPAAm sull'interfaccia fino al raggiungimento di un'area obiettivo di 50 centimetri quadrati. La pressione superficiale è stata misurata durante la compressione per rilevare eventuali difetti nel film di Langmuir.

Dopo la compressione, un substrato di vetro coprioggetto modificato idrofobicamente è stato posizionato orizzontalmente sull'interfaccia mediante un banco di allineamento. Il substrato è stato sollevato orizzontalmente e lasciato asciugare per un giorno. Dopo questo passaggio, le superfici di St-IPAAm erano pronte per essere utilizzate nei saggi di coltura cellulare.

Qui sono mostrati risultati rappresentativi di immagini topografiche ottenute mediante microscopia a forza atomica di superfici St-IPAAm. Nanostrutture sono state osservate su entrambe le superfici St-IPAAm. Le dimensioni e la forma delle nanostrutture dipendevano fortemente dall'AM e dalla composizione dello St-IPAAm.

Qui viene mostrata un'immagine macroscopica di un foglietto cellulare recuperato su una superficie con film di Langmuir trasferito con St-IPAAm 480 e un'AM di 40 nanometri quadrati per molecola. Le cellule hanno raggiunto la confluenza dopo tre giorni di coltura su superfici St-IPAAm 170 e St-IPAAm 480 a 37 gradi Celsius. Il foglietto cellulare è stato rapidamente recuperato riducendo la temperatura da 37 a 20 gradi Celsius.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare e progettare la composizione molecolare di un polimero, formare e trasferire un film di Langmuir, controllare l'adesione e il distacco delle cellule e recuperare un foglietto cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dei biomateriali e dell'ingegneria tissutale per esplorare le interazioni tra cellule e superfici e le strategie di coltura cellulare da utilizzare nella medicina rigenerativa. Le implicazioni di questa tecnica si estendono anche alla terapia con trapianto cellulare, poiché questa metodica ha la potenzialità di realizzare foglietti cellulari di vari tipi cellulari, ottenuti dai pazienti.