Name: Preparazione di Thermoresponsive Nanostrutturati Superfici Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Impara a preparare superfici nanostrutturate termoresponsive per l'ingegneria tissutale utilizzando il metodo Langmuir-Schaefer con copolimeri a blocchi. Questa tecnica consente di controllare l'adesione e il distacco cellulare mediante variazioni di temperatura.

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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Progetto per lo Sviluppo di Sistemi di Innovazione "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT), Giappone.

1. Sintesi di Polystyrene- blocco -poly (N -isopropylacrylamide) da due fasi reversibile addizione frammentazione catena di trasferimento (RAFT) polimerizzazione radicale <ol><li> Sciogliere stirene (153,6 mmol), 4-ciano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) Acido sulfanylpentanoic (ECT; 0,2 mmoli), e 4,4&#39;-azobis (acido 4-cyanovaleric) (ACVA; 0,04 mmoli) in 40 ml di 1, 4-diossano. Congelare la soluzione in azoto liquido sotto vuoto per 15-20 minuti per rimuovere le specie reattive e gradualmente scongelare a RT. Assicurarsi che la soluzione sia completamente scongelato e ripetere questo ciclo di degasaggio gelo-disgelo pompa-tre volte. </li><li> Ottenere il polistirene (PST) (Mw: 13.500) come agente RAFT macro per polimerizzazione a 70 ° C per 15 h in un bagno d&#39;olio. </li><li> Precipitato PSt agente macro zattera con 800 ml di etere e secco sotto vuoto. </li><li> Sciogliere IPAAm monomero (4,32 mmol), agente RAFT macro PSt (0,022 mmol), e ACVA (0,004 mmol) in 4 ml di 1,4-diossano. </li><li> Cancellal&#39;ossigeno nella soluzione dai cicli di degasaggio gelo-disgelo pompa come indicato nel passaggio 1.1. </li><li> Eseguire una polimerizzazione a 70 ° C per 15 h in un bagno d&#39;olio dopo degasaggio. Ottenere sintetizzato molecola St-IPAAm (Mw: 32.800) nello stesso modo come l&#39;agente macro RAFT PSt. </li></ol> 2. Preparazione di Silanized idrofobo modificati substrati di vetro <ol><li> substrati di vetro Lavare (24 mm x 50 mm) con un eccesso di acetone ed etanolo e ultrasuoni per 5 minuti per rimuovere contaminanti. </li><li> Essiccare i substrati in un forno a 65 ° C per 30 min. Quindi utilizzare plasma di ossigeno (400 W, 3 min) per attivare le superfici dei substrati a RT. </li><li> Immergere i substrati in toluene contenente 1% hexyltrimethoxysilane notte a RT per silanizzare substrato. </li><li> Lavare i substrati silanizzati in toluene e immergere in acetone per 30 minuti per rimuovere gli agenti non hanno reagito. </li><li> substrati ricottura per 2 ore a 110 ° C per immobilizzare accuratamente le sla tua faccia. </li><li> Tagliare i substrati silanizzati da una taglierina di vetro di 25 mm x 24 mm per adattarsi i piatti di coltura cellulare (dimensioni piatto: φ35 mm). </li></ol> 3. Preparazione di Langmuir Films e Film-trasferito Surface <ol><li> Posizionare lo strumento pellicola Langmuir in un armadio per impedire l&#39;accumulo di polvere. </li><li> Lavare la vasca Langmuir (dimensioni: 580 millimetri x 145 mm) e barriere con acqua distillata ed etanolo per rimuovere i contaminanti. </li><li> Asciugare il canale e le barriere strofinando con un panno senza filaccia. Poi riempire la vasca con circa 110 ml di acqua distillata, e impostare le barriere su entrambi i lati del trogolo. Si noti che l&#39;acqua distillata dovrebbe essere aggiunta senza versare nelle seguenti operazioni dal 3.5 al 3.13. </li><li> Riscaldare platino Wilhelmy piastra (perimetrale: 39,24 millimetri) per il monitoraggio della tensione superficiale con un bruciatore a gas finché la piastra diventa rosso e poi lavare con acqua distillata per rimuovere i contaminanti. Sospendere la piastra Wilhelmy su un filo attaccatolo strumento superficie di misurazione della pressione. </li><li> Azzerare lo strumento superficie di misurazione della pressione secondo il protocollo del produttore. Comprimere all&#39;interfaccia aria-acqua trogolo dalle barriere su entrambi i lati del trogolo fino all&#39;interfaccia raggiunge circa il 50 cm 2 senza gocce di polimero. </li><li> Aspirare piccoli contaminanti fino alla pressione di superficie è quasi 0 mN / m. </li><li> Riposizionare le barriere su entrambi i lati, e aggiungere acqua distillata per compensare la diminuzione di acqua distillata dal punto 3.6. </li><li> Disciogliere 5 mg del sintetizzato molecole St-IPAAm in 5 ml di una soluzione di sviluppo di cloroformio. Nota: diclorometano o toluene può anche essere usato come solvente. </li><li> Delicatamente cadere 27 ml di St-IPAAm disciolti in cloroformio sul trogolo con una microsiringa o micropipetta. </li><li> Dopo un&#39;attesa di 5 minuti per consentire la completa evaporazione del cloroformio, spostare entrambi barriere orizzontale per comprimere il molecu St-IPAAmle all&#39;interfaccia. Mantenere il tasso di compressione delle barriere a 0,5 mm / sec fino alla zona di destinazione del 50 cm 2 è raggiunto. Nota: Un rapporto di compressione rapida provoca difetti nel film Langmuir. </li><li> Misurare la pressione superficiale (π) -A m isoterme con il platino Wilhelmy piatto attaccato allo strumento superficie di misurazione della pressione durante la compressione secondo il protocollo del produttore. </li><li> Dopo aver raggiunto le dimensioni dell&#39;area di destinazione, mantenere la superficie per 5 minuti per consentire alle molecole di St-IPAAm per rilassarsi; le molecole non raggiungono l&#39;equilibrio subito dopo la compressione. </li><li> Trasferire il film Langmuir ad un substrato di vetro idrofobicamente modificato utilizzando un dispositivo di trasferimento per 5 minuti per adsorbire robusto film. Fissare il substrato di vetro idrofoba in parallelo sul dispositivo. Collegare il dispositivo a una fase di allineamento e spostare perpendicolarmente. </li><li> Sollevare il substrato orizzontalmente con il dispositivo di trasferimento e asciugare per 1 giorno in un desiccator. </li></ol> 4. coltura di cellule e ottimizzazione adesione cellulare e distacco sulla superficie Langmuir Film Trasferito <ol><li> Per preparare sospensioni cellulari, cellule endoteliali cultura bovini carotide (BAECs) a un terzo confluenza a 37 ° C in 5% CO 2 e il 95% di aria in coltura tissutale polistirene (TCPS) con Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) contenente 10% fetale siero bovino (FBS) e 100 U / ml di penicillina. </li><li> Dopo confluenza viene raggiunto, trattare BAECs con 3 ml di 0,25% tripsina-EDTA per 3 minuti a 37 ° C in 5% CO 2 e il 95% di aria. </li><li> Disattivare la tripsina-EDTA aggiungendo 10 ml di DMEM contenente 10% FBS, e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Centrifugare a 120 xg per 5 min, e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule con 10 ml di DMEM. </li><li> Posizionare le superfici St-IPAAm sotto luce ultravioletta su un banco pulito per la sterilizzazione per 5 min. </li><li> Seme ce recuperatoLLS sulla St-IPAAm superfici ad una concentrazione di 1,0 x 10 4 cellule / cm 2 conteggiati da un emocitometro monouso e osservare le cellule sulle superfici da un microscopio dotato di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% aria. Nota: Sterilizzare le superfici St-IPAAm dalla luce ultravioletta dotato di un banco pulito. </li><li> Per registrare immagini time-lapse di BAECs aderenti per circa 24,5 ore a 37 ° C con un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 10x. Dopo l&#39;adesione BAEC, registrare distacco delle BAECs dalla superficie St-IPAAm a 20 ° C per circa 3,5 ore. </li></ol> 5. cellulare Foglio Fabrication sulle superfici Langmuir Film-trasferiti <ol><li> BAECs di coltura utilizzate nello stesso modo descritto nella Sezione 4. </li><li> Seme un totale di 1,0 x 10 5 cellule / cm 2 su superfici St-IPAAm ed incubare per 3 giorni a 37 ° C in 5% CO 2. Confluenti BAECs spontaneamente staccato a 20 ° C.</li>
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Tutti gli autori hanno contribuito in egual misura alla stesura del manoscritto e hanno approvato la versione finale. Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Una superficie sensibile alla temperatura è stato fabbricato con il metodo Langmuir-Schaefer, e le proprietà di superficie per l&#39;adesione cellulare / distacco e strato di cellule di recupero sono state ottimizzate. Quando si utilizza questo metodo per la realizzazione di superfici, diversi passaggi sono critici. La composizione molecolare delle molecole St-IPAAm ha un grande effetto sulla struttura superficiale e alla stabilità della superficie, e, per estensione, a adesione cellulare e distacco. In particolare, le ...

superfici nanostrutturate hanno recentemente attirato notevole attenzione a causa delle loro diverse applicazioni potenziali, tra cui patterning, colture cellulari, la pulizia, e la commutazione di superficie. Ad esempio, le superfici superhydrophobic ispirati al nanostruttura della foglia di loto e altre superfici sensibili sono in grado di reagire agli stimoli esterni 1-4. Il film Langmuir è uno dei rivestimenti polimerici più studiati. Un film Langmuir è formato facendo cadere molecole anfifiliche su una interfaccia aria-acqua 5-8. Il film può poi essere trasferito su una superficie solida per adsorbimento fisico o chimico, e la conformazione molecolare su una superficie solida può essere controllato usando metodi di trasferimento verticali e orizzontali 9-12. La densità del film Langmuir può essere regolata con precisione comprimendo l&#39;interfaccia aria-acqua. Recentemente, questo metodo si è dimostrato efficace anche per la realizzazione di nanoscaled structur mare-isolaes utilizzando copolimeri a blocchi anfifilici. Le nanostrutture sono considerata formata da un nucleo di segmenti idrofobi e un guscio di segmenti idrofili 13-17. Inoltre, il numero di nanostrutture su una superficie è regolata controllando l&#39;area per molecola (A m) del copolimero a blocchi all&#39;interfaccia. Ci siamo concentrati su un originale, unico approccio di ingegneria tissutale senza patibolo, ingegneria strato di cellule, utilizzando una superficie cultura sensibile alla temperatura. La tecnologia sviluppata è stata applicata alle terapie rigenerative per vari organi 18. Una superficie coltura sensibile alla temperatura è stato fabbricato mediante innesto poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), una molecola sensibile alla temperatura, su una superficie 19-27. PIPAAm ei suoi copolimeri presentano una temperatura più bassa soluzione critica (LCST) in ambiente acquoso a temperature vicine a 32 ° C. La superficie di cultura anche esposto un alternati sensibile alla temperatura<html> ON tra idrofobicità e idrofilia. A 37 ° C, la superficie PIPAAm innestate divenne idrofobi, e le cellule facilmente attaccata e proliferavano sulla superficie e sulla convenzionale polistirene coltura tissutale. Quando la temperatura è stata abbassata a 20 ° C, la superficie diventa idrofila, e le cellule spontaneamente staccato dalla superficie. Pertanto, le cellule confluenti in coltura sulla superficie potrebbero essere raccolti come un foglio intatto variando la temperatura. Queste proprietà di adesione cellulare e il distacco sono stati visualizzati anche da una superficie fabbricata da film di rivestimento Langmuir per il laboratorio dimostrativo 26, 27. Un film Langmuir di copolimeri a blocchi costituiti da polistirene (P (St)) e PIPAAm (St-IPAAm) è stato fabbricato. Il film Langmuir con una determinata A m potrebbe essere orizzontalmente trasferito ad un substrato di vetro idrofobicamente modificato. Inoltre, l&#39;adesione cellulare su e distacco dalla superficie preparata in risposta alla temperatura sono stati valutati. _content &quot;&gt; Qui, descriviamo protocolli per la realizzazione di un film Langmuir nanostrutturati composto di copolimeri a blocchi anfifilici termo-reattivo su un substrato di vetro. Il nostro metodo può fornire una tecnica di fabbricazione efficace per nanopellicole organici in vari campi della scienza delle superfici e può facilitare more controllo efficace di adesione cellulare su e distacco spontaneo da una superficie.

<table><tbody><tr><td>N-isopropilacrilammide</td><td>Kohjin</td><td></td><td>Nessun numero di catalogo</td></tr><tr><td>Azobis(acido 4-cianovalerico)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>Stirene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-triossano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diossano</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nakarai</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Giappone Biosiero</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>BAEC</td> Health <td>Science Reserch Resources Bank</td><td>JCRB0099</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura</td><td>Matsunami Glass Industry</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td> Abbeveratoi di deposizione di <td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett</td><td>KSV Instruments</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA Midium trogolo</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di thermoresponsive nanostrutturati superfici tissue engineering

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Le superfici termoresponsive immobilizzate in poli(N-isopropilacrilammide) (PIPAAm) per il controllo dell'adesione e del distacco cellulare sono state fabbricate con il metodo Langmuir-Schaefer. I copolimeri a blocchi anfifilici composti da polistirene e PIPAAm (St-IPAAms) sono stati sintetizzati mediante polimerizzazione radicalica reversibile a trasferimento di catena di addizione-frammentazione (RAFT). Una soluzione di cloroformio di molecole di St-IPAAm è stata delicatamente lasciata cadere in un apparato a trogolo di Langmuir, ed entrambe le barriere dell'apparato sono state spostate orizzontalmente per comprimere il film e regolarne la densità. Quindi, il film di Langmuir St-IPAAm è stato trasferito orizzontalmente su un substrato di vetro modificato idrofobicamente da un dispositivo fissato in superficie. Le immagini al microscopio a forza atomica hanno rivelato chiaramente strutture di isole marine su scala nanometrica sulla superficie. La forza, la velocità e la qualità dell'adesione e del distacco cellulare sulla superficie preparata sono state modulate dalle variazioni di temperatura nell'intervallo di temperatura critica inferiore della soluzione delle molecole PIPAAm. Inoltre, una struttura cellulare bidimensionale (foglio cellulare) è stata recuperata con successo sulle superfici ottimizzate. Queste superfici PIPAAm uniche possono essere utili per controllare la forza di adesione e distacco delle cellule.

Copolimeri a blocchi composti da polistirolo e poli (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) con pesi molecolari specifici sono stati sintetizzati in zattera polimerizzazione radicale. ECT è stato preparato come trasferitore di catena come descritto in Moad et al. 28. Due molecole St-IPAAm di diversa lunghezza di catena PIPAAm stati sintetizzati, ei polimeri a blocchi ottenuti sono stati caratterizzati da 1 H di risonanza magnetica nucleare (NMR) e cro...

Le superfici nanometriche di isole marine composte da copolimeri a blocchi termoresponsivi sono state fabbricate con il metodo Langmuir-Schaefer per controllare l'adesione e il distacco spontaneo delle cellule. Sono stati visualizzati sia la preparazione della superficie che l'adesione e il distacco delle cellule sulla superficie.

Preparazione di Thermoresponsive Nanostrutturati Superfici Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

L'obiettivo generale di questo metodo Langmuir-Schaefer con copolimeri a blocchi è quello di fabbricare fogli cellulari in diverse condizioni di superfici sensibili alla temperatura, controllando l'intensità dell'adesione e dell'attacco delle cellule. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei biomateriali, come i materiali biocompatibili, le superfici per la coltura cellulare e la bioseparazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'interazione tra la superficie sensibile alla temperatura e le cellule può essere controllata, e le condizioni di modifica per il recupero dei fogli cellulari possono essere ottimizzate.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione tra cellula e superficie, può essere applicato anche ad altri sistemi come la bioripartizione e i biofilm. Per iniziare, sciogliere lo stirene, ECT e ACVA in 40 millilitri di 1,4-Diossano. Congelare la soluzione in azoto liquido sotto vuoto per 15-20 minuti per rimuovere le specie reattive.Dopo aver scongelato gradualmente la soluzione a temperatura ambiente, ripetere questo ciclo di congelamento, aspirazione, scongelamento e degasaggio per tre volte. Otten

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Impara a preparare superfici nanostrutturate termoresponsive per l'ingegneria tissutale utilizzando il metodo Langmuir-Schaefer con copolimeri a blocchi. Questa tecnica consente di controllare l'adesione e il distacco cellulare mediante variazioni di temperatura.

Preparazione di Thermoresponsive Nanostrutturati Superfici Tissue Engineering

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