Name: Un rapido aria secca cadente Cromosoma Metodo di preparazione adatto per i pesci nelle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Scopri un metodo rapido di preparazione cromosomica con aria secca per piante, ideale per l'ibridazione in situ con fluorescenza (FISH). Questa tecnica efficiente migliora la qualità e la quantità dei cromosomi utilizzabili per la ricerca citogenetica.

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Ringraziamo il DFG per il sostegno finanziario (HO 1779/21-1) così come Katrin Kumke e il Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) per la consulenza tecnica.

1. Cromosoma Preparazione <ol><li> Germinazione dei semi e la fissazione di apici radicali <ol><li> Germinare 10-20 semi di orzo su due strati di carta da filtro umida in una capsula di Petri in condizioni di oscurità per 2 giorni a 22-24 ° C. Tagliare radici vigorose con la lunghezza di 1-2 cm dal seme usando una lama di rasoio. </li><li> Preparare acqua ghiacciata mettendo una bottiglia di vetro da 500 ml contenente acqua di rubinetto fredda nel ghiaccio tritato-acqua. Aerare l&#39;acqua ghiacciata e immergere apici radicali per 20 ore di aumentare la frequenza di cellule in metafase. </li><li> Trasferire radici da acqua a 50 ml di etanolo: acido acetico (3: 1) fissativo fissarli a temperatura ambiente per 2 giorni. Conservare radici in etanolo appena preparato: acido acetico (3: 1) fissativo a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso fino ad un anno. </li></ol></li><li> Lavaggio e trattamento enzimatico <ol><li> Lavare le 10-20 radici con 30 ml acqua di rubinetto ghiacciata per 5 minuti due volte con un bicchiere di vetro da 50 ml. Utilizzare microscopio binoculare. Trasferire radici uno per uno in30 ml di 0,01 M tampone citrato (0,01 M di acido citrico + 0,01 M sodio citrato, pH 4.8) con pinze e lavare agitando il bicchiere di vetro per 5 minuti due volte. Posizionare radici su carta da filtro per rimuovere completamente il liquido e cut-off non-tessuto meristematico indesiderato usando una lama di rasoio. </li><li> Incubare fino a 20 apici radicali in miscela enzimatica 1 ml a 37 ° C per circa 50 minuti per ammorbidire i tessuti vegetali (Tabella 1) in un vetro da orologio. Miscela enzimatico contiene 0,7% cellulasi R10, 0,7% cellulasi, 1% e 1% pectolyase cytohelicase diluito in tampone citrato 0,01 M. Conservare la miscela enzimatica a -20 ° C e riutilizzati fino a cinque volte. </li><li> Rimuovere l&#39;enzima pipettando e lavare le punte delle radici su ghiaccio con 5 ml di 0,01 M tampone citrato due volte per sostituire l&#39;enzima residuale. </li></ol></li><li> Root macerazione <ol><li> Apici radicali Lavare con 1 ml di etanolo al 96% per due volte con attenzione nello stesso vetro dell&#39;orologio. Sostituire etanolo con appena preparato fissativo (75% di acido acetico: 25% etanolo). Usa 10-15fissativo pl per punta della radice. </li><li> Apici radicali trasferimento insieme al fissatore in un tubo da 2 ml e disintegrare meristemi radice con un ago da dissezione o pinze. Premere il tubo 20 volte per risospendere le cellule per ottenere una sospensione di cellule. Conservare la sospensione cellulare a -20 ° C fino a due mesi. </li></ol></li><li> Cadute di sospensione cellulare <ol><li> Mettere 2-3 strati di carta velina imbevuta di acqua su un piatto caldo a 50 ° C. Immergere i vetrini microscopici in acqua di rubinetto ghiacciata in frigo per 30 minuti. E posto scivola sulla parte superiore del tessuto di carta umida. </li><li> Pipettare 7-10 ml di sospensione cellulare e inserirla da una distanza di 20 cm sul vetrino raffreddata posto sulla piastra calda. Pipettare 10 ml di miscela di acidi acetico-etanolo nello stesso luogo come sospensione cellulare sul vetrino e mantenere la slitta sulla piastra calda per ulteriori 2 min. Posizionare il vetrino sulla piastra calda senza il tessuto bagnato e lasciare asciugare per 1 minuto. </li></ol></li><li> Controllo qualità e contene di diapositive <ol><li> Controllare diapositive utilizzando un microscopio a contrasto di fase per il controllo della qualità della diffusione cromosoma. Utilizzare vetrini sia lo stesso giorno o deposito immergendo in 96% di etanolo in una vaschetta Coplin a -20 ° C. </li></ol></li><li> Il pretrattamento di diapositive prima FISH; tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente <ol><li> Collocare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 50 ml di 2x SSC (20x SSC contiene 3 M di NaCl e 300 mm citrato trisodico) per 5 min. Utilizzando pinze, trasferimento vetrini in una vaschetta Coplin contenente 50 ml di 45% di acido acetico per 3-10 min. </li><li> Trasferire i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 50 ml di 2x SSC per 10 min. Trasferire i vetrini ad una vaschetta Coplin contenente 50 ml di formaldeide al 4% (in 2x SSC) e immergere i vetrini per 10 minuti per riparare i cromosomi. </li><li> Rimuovere formaldeide risciacquando i vetrini 3 volte per 4 min ciascuno, in una vaschetta Coplin contenente 50 ml 2x SSC. Disidratare i vetrini in una vaschetta Coplin per 2 min in serie di 70%, 90% e 100% etanolo, rispettivamente, e scorre secco in verticaleposizione. </li></ol></li></ol> 2. ibridazione in situ fluorescente (FISH) <ol><li> Per ciascun vetrino, preparare una soluzione di ibridazione di 20 microlitri in totale utilizzando 10 ml di formammide deionizzata, 5 ml di tampone 4x ibridazione (200 microlitri di buffer contiene 80 microlitri 20x SSC, 8 microlitri 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 microlitri 0,5 M EDTA, 11.2 ml 10 mg / mL di sperma di salmone e acqua priva di DNasi 99,2 ml), 3 ml di sonda e 2 ml di acqua priva di DNasi. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione di ibridazione per vetrino e coprire con un vetrino 24 x 32 mm ed arrestare la polizza di copertura con il cemento di gomma. Denaturare vetrini con sonde contemporaneamente a 80 ° C per 2 min su una piastra calda. </li><li> Trasferire i vetrini in una camera umida e incubare i vetrini a 37 ° CO / N luce evitando. Rimuovere vetrini risciacquando i vetrini in una vaschetta Coplin con SSC 2x. Collocare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 55-60 ° C 2x SSC e incubare per 20 min. </li><li> Porre i vetrini a 2x SSC in una vaschetta Coplin per 2 minuti a temperatura ambiente. Disidratare i vetrini in una vaschetta Coplin per 2 min in serie di 70%, 90% e 100% etanolo, rispettivamente. </li><li> Asciugare le diapositive e di contrasto con 1 mg / ml di 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) in antifade mezzo di montaggio, evitare la luce intensa. </li></ol> 3. Analisi microscopica e bagagli <ol><li> Analizzare le diapositive utilizzando un microscopio a epifluorescenza. La selezione di filtro dipende dalla fluorocromo usato per la marcatura della sonda. Se necessario, conservare i vetrini a 4 ° C in condizioni di oscurità fino a un anno. </li></ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;esperimento preparazione cromosoma è stata effettuata utilizzando radici giovani di cereali appartenenti alla famiglia delle graminacee (Poaceae). Tutte le specie analizzate hanno 14 cromosomi in metafase relativamente lunga mitotico (11-15 micron) nel set genoma diploide e appartengono a specie di grande genoma (5,1-7,9 GBP). Lunghezza di radici germinati non era più di 2 cm per ottenere un massimo di tessuti meristematici. Sincronizzazione di divisione delle cellule è stato raggiunto...

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è uno strumento efficace per la mappatura fisica delle sequenze singole e alta copia a livello cromosomico. Il presupposto è la preparazione degli spread cromosomiche di alta qualità. Non c&#39;è cromosoma protocollo preparazione generale che sarebbe ugualmente adatto per cellule animali e vegetali. Preparazione dei cromosomi vegetali è particolarmente difficile a causa della parete cellulare rigida e vari coerenza citoplasma in specie diverse. Uno dei metodi favorevoli per la preparazione di cromosomi pianta è una tecnica cosiddetta goccia anche noto come tecnica di diffusione drop e asciugatura all&#39;aria tecnica 1,2. Questo metodo è stato introdotto nel 1958 da Rothfels e Siminovitch per in vitro cellule di mammifero coltivate 3. Successivamente Martin et al. 4 e Kato et al. 5 adattato questo metodo per le piante. Più di recente, un metodo denominato &#39;SteamDrop &amp;# 39; stato sviluppato che utilizzava vapore acqueo per la preparazione di cromosomi non sovrapposti 6. Anche se, l&#39;influenza positiva di elevata umidità è stato osservato in precedenza 7, &#39;SteamDrop&#39; offre un flusso di lavoro controllata di preparati cromosomici di alta qualità 6. Il trattamento a vapore provoca stiramento dei cromosomi, probabilmente legati ad alcune modifiche di proteine ​​cromosomiche. La qualità del risultato spread metafase è molto alta, anche se di contenimento del numero sufficiente di completo metafase si diffonde per le successive esperimenti di FISH richiede competenze tecniche. Qui vi presentiamo un protocollo per la preparazione di cromosomi mitotici di cereali adatti per la rilevazione FISH di singoli e di alta copia sonde 5,8. Questo metodo è una migliore variante del metodo caduta asciugare descritto da Kato 9 eseguita sotto umidità relativa del 50% -55% (Figura 1). Questo protocollo comprende un numero ridottodi fasi di lavaggio rendendo l&#39;applicazione facile, efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo abbiamo ottenuto spread cromosomiche di alta qualità e risultati FISH per Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.

<table><tbody><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Cellulasi R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulasi&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectoliasi</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Citoelicasi</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>fluorocromo diretto</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>fluorocromo diretto&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)&nbsp;</td><td>Colorante fluorescente</td> <td>H-1200</td> <td>di Vector Laboratories</td></tr></tbody></table>

un rapido aria secca cadente cromosoma metodo di preparazione adatto per i pesci nelle piante

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparazione degli spread dei cromosomi è un prerequisito per la performance di successo di ibridazione in situ fluorescente (FISH). Preparazione di alta qualità spread pianta cromosomiche è difficile a causa della parete cellulare rigida. Uno dei metodi approvati per la preparazione di cromosomi pianta è una cosiddetta preparazione goccia, noto anche come ripartizione goccia o tecnica aria di essiccazione. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione rapida del cromosoma mitotica diffonde adatto al rilevamento di FISH sonde singole e alte DNA copia. Questo metodo è una migliore variante del metodo goccia aria secca eseguita sotto un&#39;umidità relativa del 50% -55%. Questo protocollo comprende un numero ridotto di fasi di lavaggio rendendo l&#39;applicazione facile, efficiente e riproducibile. Evidenti vantaggi di questo approccio sono ben distribuite, non danneggiati e numerosi cromosomi in metafase che servono come presupposto ideale per l&#39;analisi FISH successo. Usando questo protocollo abbiamo ottenuto cromato di alta qualitàosome spread e risultati FISH riproducibili per Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.

Preparati microscopici con spread metafase mitotico sono stati preparati dalla caduta cromosoma metodo rapido di preparazione asciugare sopra descritto (Suppl. Figura 1). Analisi FISH è stata condotta utilizzando sia, sequenze ripetitive e singola copia. Le immagini sono state ottenute con un microscopio a epifluorescenza dotato di una serie di filtri che permettono di eccitazione di fluorofori corrispondenti e catturato da una telecamera CCD monocromatica ad alta sensibilità. Per l&#39;acquisizione di ...

Viene descritto un protocollo per la preparazione di diffusioni cromosomiche vegetali mitotiche di alta qualità con un metodo di goccia veloce all'aria adatto per la rilevazione FISH di sonde di DNA singole e ad alta copia.

Un rapido aria secca cadente Cromosoma Metodo di preparazione adatto per i pesci nelle piante

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

L'obiettivo generale di questo metodo è preparare cromosomi vegetali adatti alla tecnica di ibridazione fluorescente in situ mediante sonde di DNA singole e ad alta copia. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella citogenetica e nella ricerca genomica, come il rilevamento di riarrangiamenti cromosomici, l'ordinamento di marcatori genetici sui cromosomi e l'analisi comparativa tra specie diverse. Il vantaggio principale di questa procedura è che la preparazione di strisci cromosomici diventa rapida, semplice ed efficiente.La sospensione cellulare può essere conservata a meno 20 gradi fino a due mesi ed utilizzata per la preparazione dei cromosomi quando necessario. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato che la qualità e il numero di cromosomi adatti aumentavano in modo significativo nei giorni umani Germinate da 10 a 20 semi d'orzo su due strati di carta filtrante umida in una piastra di Petri in condizioni di buio per due giorni a 22-24 gradi Celsius dopo due giorni. Rimuovete con un rasoio le radici vigorose lunghe da uno a due centimetri dai semi.Successivamente, preparare acqua fredda di ghiaccio posizionando una bottiglia di vetro da 500 millilitri contenente acqua fredda del rubinetto in acqua ghiacciata tritata. Aerare l'acqua fredda di ghiaccio e immergervi le punte delle radici per 20 ore per aumentare la frequenza delle cellule in metafase. Trasferire le radici dall'acqua in 50 millilitri di fissativo etanolo-acido acetico per fissarle a temperatura ambiente per due giorni dopo la fissazione.Lavare da 10 a 20 radici con 30 millilitri di acqua del rubinetto ghiacciata in un becher di vetro da 50 millilitri per cinque minuti, due volte. Trasferire le radici una alla volta in 30 millilitri di tampone citrato utilizzando pinzette. Lavare le radici agitando il becher di vetro per cinque minuti, due volte.Quindi posizionare le radici su carta da filtro per rimuovere completamente il liquido al microscopio. Rimuovere con una lametta i tessuti non meristematici indesiderati. Il passaggio più critico di questa procedura consiste nel determinare il tempo di digestione appropriato, che può variare tra specie diverse.Qui, fino a 20 apici radicali vengono incubati in un millilitro di miscela enzimatica a 37 gradi Celsius per circa 50 minuti. Per ammorbidire il tessuto vegetale in una capsula in vetro sotto un microscopio, rimuovere l'enzima mediante pipettaggio e lavare gli apici radicali su ghiaccio con cinque millilitri di tampone citrato 0,01 molare per sostituire l'enzima residuo. Proseguire lavando gli apici radicali con un millilitro di etanolo al 96% due volte con attenzione nella stessa capsula in vetro.Sostituire quindi l'etanolo con 10-15 microlitri di fissativo appena preparato per ogni apice radicale. Trasferire gli apici radicali insieme al fissativo in un tubo da due millilitri e disintegrare i tessuti meristematici della radice con un ago da dissezione o con pinzette. Agitare il tubo 20 volte per risospendere le cellule e ottenere una sospensione cellulare.Successivamente, posizionare due o tre strati di carta da filtro inzuppata d'acqua su un piatto riscaldante a 50 gradi Celsius. Immergere le lamelle in ghiaccio, in acqua fredda del rubinetto e riporre in frigorifero per 30 minuti. Quindi posizionare le lamelle sopra la carta da filtro umida, aggiungere da sette a dieci microlitri di sospensione cellulare mediante pipetta e lasciar cadere la goccia da un'altezza di 20 centimetri sulla lamella raffreddata posta sul piatto riscaldante.Aggiungere successivamente 10 microlitri della miscela di acido acetico ed etanolo nello stesso punto della sospensione cellulare sul vetrino e mantenere il vetrino sulla piastra riscaldante. Dopo due minuti, posizionare il vetrino sulla piastra riscaldante senza il tessuto umido e lasciarlo asciugare per un ulteriore minuto. Verificare i vetrini utilizzando un microscopio a contrasto di fase per controllare la qualità della dispersione dei cromosomi.Utilizzare i vetrini lo stesso giorno oppure conservarli immergendoli in un barattolo Coplin contenente etanolo al 96% a meno 20 gradi Celsius per la pretrattamento dei vetrini prima della FISH. Posizionare i vetrini in un barattolo Coplin contenente 50 millilitri di 2XSSC per cinque minuti utilizzando pinzette. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente 50 millilitri di acido acetico al 45% per tre-dieci minuti.Successivamente, trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente 50 millilitri di 2XSSC per 10 minuti. Poi trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente 50 millilitri di formaldeide al 4% e immergerli per 10 minuti per fissare i cromosomi. Rimuovere la formaldeide lavando i vetrini tre volte per quattro minuti ciascuna in un barattolo Coplin contenente 50 millilitri di 2XSSC.Quindi disidratare i vetrini per due minuti in una serie di etanolo al 70%, 90% e 100%, e asciugare i vetrini in posizione verticale. Per ogni vetrino, preparare una soluzione di ibridazione di 20 microlitri utilizzando 10 microlitri di formammide deionizzata, 5 microlitri di buffer di ibridazione 4X, 3 microlitri della sonda e 2 microlitri di acqua priva di D ns. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di ibridazione per ogni vetrino e coprire con un coprioggetto di 24 per 32 millimetri.Dopo aver sigillato il vetrino con cemento di gomma, denaturare contemporaneamente vetrini e sonde a 80 gradi Celsius per due minuti su una piastra riscaldata, quindi trasferire i vetrini in una camera umida e incubarli a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Evitando la luce, rimuovere i vetrini lavando i preparati in un barattolo di accoppiamento con due XSSC. Successivamente, posizionare i vetrini in un barattolo coplan contenente due XSSC a 55-60 gradi Celsius e incubare per 20 minuti.Successivamente, posizionare i vetrini in due XSSC in un barattolo Coplan per due minuti a temperatura ambiente. Disidratare i vetrini in un barattolo Coplan per due minuti in una serie di etanolo al 70%, 90% e 100%. Lasciare asciugare all'aria i vetrini e controcolorare con DAPI in un mezzo di montaggio Antifa, evitando la luce intensa.Analizzare i vetrini utilizzando un microscopio a fluorescenza in epifluorescenza. La scelta del filtro dipende dal fluorocromo utilizzato per l'etichettatura della sonda, se necessario. Conservare i vetrini a quattro gradi Celsius al buio per un periodo fino a un anno.Qui sono mostrati preparati cromosomici in metafase mitotica ottenuti mediante il metodo rapido di diffusione su vetrino con essiccazione aerea. L'analisi FISH è stata eseguita utilizzando sia sequenze ripetitive che sequenze uniche. Le immagini sono state acquisite mediante un microscopio a fluorescenza episcopica dotato di un set di filtri che permette l'eccitazione dei corrispondenti fluorocromi, e sono state registrate da una telecamera CCD monocromatica ad alta sensibilità.L'esperimento FISH su cromosomi mitotici in metafase di hoard e vulgari, utilizzando una sonda a copia singola e cinque S-R-D-N-A, ha rivelato segnali distinti e di alta qualità. L'ibridazione della microsatellite CT CTT 10 sui cromosomi di hordy e BULBUS ha prodotto un profilo specifico e distinto. L'esperimento FISH su cromosomi mitotici in metafase di sala serial, effettuato con la sonda PSC 119 due, ha fornito segnali specifici e di alta qualità.I vantaggi evidenti di questo approccio sono cromosomi metafasici ben distribuiti, indenni e numerosi, che costituiscono un prerequisito ideale per un'analisi FISH di successo. Una volta acquisita padronanza, questa procedura può essere completata in meno di due ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare un preparato di cromosomi mitotici in metafase di alta qualità per FISH, IDE e formazione; tuttavia, l'uso di sostanze pericolose può essere estremamente rischioso, pertanto è sempre necessario utilizzare guanti e cappa chimica durante l'esecuzione di queste procedure.

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Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

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Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni intatti di zebrafish.

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

Questo protocollo descrive una procedura modificata per isolare rapidamente ovociti puliti allo stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa, fornendo così un metodo conveniente per la ricerca specifica per gli ovociti.

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

Scopri un metodo rapido di preparazione cromosomica con aria secca per piante, ideale per l'ibridazione in situ con fluorescenza (FISH). Questa tecnica efficiente migliora la qualità e la quantità dei cromosomi utilizzabili per la ricerca citogenetica.

Un rapido aria secca cadente Cromosoma Metodo di preparazione adatto per i pesci nelle piante

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