Un rapido aria secca cadente Cromosoma Metodo di preparazione adatto per i pesci nelle piante

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di preparare cromosomi vegetali adatti alla fluorescenza nella tecnica di ibridazione C 2 utilizzando sonde di DNA a copia singola e ad alta copia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella citogenetica e nella ricerca sul genoma, come il rilevamento di riarrangiamenti cromosomici, l'ordinamento dei marcatori genetici sui cromosomi e l'analisi comparativa tra specie diverse. Il vantaggio principale di questa procedura è che la preparazione delle propagande cromosomiche diventa veloce, facile ed efficiente.

La sospensione cellulare può essere conservata a meno 20 gradi fino a due mesi e utilizzata per la preparazione dei cromosomi quando necessario. Abbiamo avuto per la prima volta questa idea di questo metodo quando abbiamo osservato che la qualità e il numero di cromosomi adatti aumentavano notevolmente durante i giorni umani Germinare da 10 a 20 semi d'orzo su due strati di carta da filtro umida in una capsula di Petri in condizioni di oscurità per due giorni a 22-24 gradi Celsius dopo due giorni. Taglia le radici vigorose con lunghezze di uno o due centimetri dal seme usando una lama di rasoio.

Quindi, prepara l'acqua ghiacciata mettendo una bottiglia di vetro da 500 millilitri contenente acqua fredda del rubinetto nell'acqua ghiacciata tritata. Aerare l'acqua ghiacciata e immergere le punte delle radici per 20 ore per aumentare la frequenza delle cellule in metafase. Trasferire le radici dall'acqua a 50 millilitri di fissativo dell'acido acetico etanolo per fissarle a temperatura ambiente per due giorni dopo la fissazione.

Lavare da 10 a 20 radici con 30 millilitri di acqua di rubinetto ghiacciata in un altoparlante di vetro da 50 millilitri per cinque minuti due volte. Trasferire le radici una ad una in 30 millilitri di tampone citrato utilizzando una pinza. Lavare le radici agitando due volte l'altoparlante in vetro per cinque minuti.

Quindi posizionare le radici su carta da filtro per rimuovere completamente il liquido al microscopio. Tagliare il tessuto non meristematico indesiderato utilizzando una lama di rasoio. Il passaggio più critico di questa procedura è determinare il corretto tempo di digestione che può variare tra le diverse specie.

Qui fino a 20 punte di radice vengono incubate in un millilitro di miscela enzimatica a 37 gradi Celsius per circa 50 minuti. Per ammorbidire il tessuto vegetale in un vetro di orologio al microscopio, rimuovere l'enzima mediante pipettaggio e lavare le punte delle radici con ghiaccio con cinque millilitri di tampone citrato molare 0,01 per sostituire l'enzima residuo. Continua a lavare accuratamente le punte delle radici con un millilitro di etanolo al 96% due volte nello stesso vetro dell'orologio.

Quindi sostituire l'etanolo con 10-15 microlitri di fissativo appena preparato per punta della radice. Trasferire le punte delle radici insieme al fissativo in una provetta da due millilitri e disintegrare gli steli delle radici con un ago da dissezione o una pinza. Picchiettare il tubo 20 volte per risospendere le cellule e ottenere una sospensione cellulare.

Quindi, posizionare due o tre strati di carta velina imbevuta d'acqua su una piastra calda a 50 gradi Celsius. Immergere i vetrini microscopici in ghiaccio e acqua fredda del rubinetto in frigorifero per 30 minuti. Quindi posizionare i vetrini sopra la carta velina umida, pipettare da sette a 10 microlitri di sospensione cellulare e lasciarla cadere da una distanza di 20 centimetri sul vetrino raffreddato posizionato sulla piastra riscaldante.

Seguire con 10 microlitri della miscela di etanolo di acido acetico nello stesso punto della sospensione cellulare sul vetrino e mantenere il vetrino sulla piastra riscaldante. Dopo due minuti, posizionare il vetrino sulla piastra riscaldante senza il fazzoletto bagnato e lasciarlo asciugare per un altro minuto. Controllare i vetrini utilizzando un microscopio a contrasto facciale per controllare la qualità della diffusione cromosomica.

Utilizzare i vetrini lo stesso giorno o conservarli immergendoli in etanolo al 96% in un barattolo di coplin a meno 20 gradi Celsius per pretrattare i vetrini prima del pesce. Mettere i vetrini in un barattolo di copin contenente 50 millilitri di due XSSC per cinque minuti utilizzando una pinza. Trasferire i vetrini in un barattolo coplan contenente 50 millilitri di acido acetico al 45% per tre-10 minuti.

Quindi, trasferire i vetrini in un barattolo coplan contenente 50 millilitri di due XSSC per 10 minuti. Quindi trasferire i vetrini in un barattolo di Coplin contenente 50 millilitri di formaldeide al 4% e immergere i vetrini per 10 minuti per fissare i cromosomi. Rimuovere la formaldeide sciacquando i vetrini tre volte per quattro minuti ciascuno in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di due XSSC.

Quindi disidratare i vetrini per due minuti in una serie di etanolo al 70%90% e al 100% e asciugare i vetrini in posizione verticale. Per ogni vetrino, preparare una soluzione di ibridazione di 20 microlitri utilizzando 10 microlitri di ammide in forma deionizzata, cinque microlitri di quattro tampone di ibridazione X, tre microlitri della sonda e due microlitri di acqua libera Dns. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di ibridazione per vetrino e coprire con un vetrino coprioggetti da 24 x 32 millimetri.

Dopo aver sigillato il vetrino coprioggetto con cemento di gomma, denaturare i vetrini con le sonde contemporaneamente a 80 gradi Celsius per due minuti su una piastra calda, trasferire i vetrini in una camera umida e incubarli a 37 gradi Celsius per una notte. Evitando la luce, rimuovere i vetrini coprioggetti sciacquando i vetrini in un barattolo di accoppiamento con due XSSC. Quindi posizionare i vetrini in un barattolo coplan contenente da 55 a 60 gradi Celsius, due XSSC e incubare per 20 minuti.

Quindi, posizionare i vetrini in due XSSC in un barattolo coplan per due minuti a temperatura ambiente. Certo. Disidratare i vetrini in un barattolo coplan per due minuti in una serie di etanolo al 70%90% e 100%. Aria. Asciugare i vetrini e controcolorare con dappy in Antifa mounting medium, evitando la luce intensa.

Analizzare i vetrini utilizzando un microscopio a epifluorescenza. La scelta del filtro dipende dal fluorocromo utilizzato per l'etichettatura della sonda, se necessario. Conservare i vetrini a quattro gradi Celsius in condizioni di oscurità fino a un anno.

Qui sono mostrate le distribuzioni di metafase mitotica preparate con il metodo di preparazione del cromosoma a goccia ad asciugatura rapida. L'analisi dei pesci è stata effettuata utilizzando sia sequenze ripetitive che a copia singola. Le immagini sono state ottenute da un microscopio a epifluorescenza con una serie di filtri che consentono l'eccitazione dei corrispondenti quattro fluoro e catturate da una telecamera monocromatica CCD ad alta sensibilità.

L'esperimento FISH su cromosomi in metafase mitotica di hoard e vulgari utilizzando una sonda a copia singola e cinque S-R-D-N-A ha rivelato segnali distinti e di alta qualità. L'ibridazione del microsatellite CT CTT 10 sui cromosomi di hordy e BULBUS ha portato a un pattern specifico e distinto. L'esperimento FISH su cromosomi in metafase mitotica di sala seriale utilizzando PSC 119 a due sonde ha prodotto segnali specifici e di alta qualità.

Gli ovvi vantaggi di questo approccio sono la buona diffusione, l'integrità e i numerosi cromosomi in metafase che fungono da prerequisito perfetto per il successo dell'analisi dei pesci. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in meno di due ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come preparare lo spazio cromosomico mitotico di alta qualità per IDE e precedenti, un'altezza può essere estremamente pericolosa, sempre per utilizzare grafici e cappa quando si eseguono queste procedure.