Tenda Colonna flusso: ottimizzazione dell'efficienza e della sensibilità
12 giugno 2016
Qui, presentiamo un protocollo per il funzionamento e l'ottimizzazione della colonna AFT (Active Flow Technology) in modalità Curtain flow (CF) per migliorare le prestazioni di separazione.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di migliorare l'efficienza e la sensibilità di una separazione attraverso l'ottimizzazione di una colonna di flusso a tenda. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle scienze ambientali, della medicina legale e nelle aree che richiedono l'analisi di campioni in tracce, dove è richiesta una tecnica di separazione efficiente e altamente sensibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aumenta l'efficienza di una separazione e la sensibilità dell'analisi rispetto ai metodi convenzionali di separazione HPLC.
Questo metodo può fornire un mezzo per aumentare la potenza di separazione, e quindi la capacità di velocità, in modo economico ed efficiente in termini di tempo. La colonna di flusso a tenda è un concetto nuovo per i professionisti dell'HPLC, tuttavia il suo utilizzo non è complicato. Richiede semplicemente l'ottimizzazione di rapporti di flusso appropriati.
Innanzitutto, preparare flaconi di acqua ultra pura al 100% e 100 metanolo per le fasi mobili A e B dello strumento HPLC. Spurgare le pompe secondo i requisiti del produttore. Dopo lo spurgo, scollegare la linea della pompa dalla valvola dell'iniettore dell'autocampionatore.
Fissare un raccordo a T alla linea scollegata. A ciascuna porta del raccordo a T, collegare un tubo di 0,13 millimetri di diametro interno e 15 centimetri di lunghezza. Collegare un tubo dal raccordo a T alla valvola dell'iniettore del campionatore automatico.
Infine, impostare la pompa su una portata di un millilitro al minuto. Tarare due recipienti di raccolta vuoti ed etichettarli al centro e alla periferia. Per 60 secondi, utilizzare il recipiente etichettato centralmente per raccogliere la fase mobile in uscita dalla linea proveniente dall'iniettore.
Pesare nuovamente il recipiente centrale e determinare la massa della fase mobile raccolta. Ripetere questo processo raccogliendo il flusso attraverso la porta periferica con il recipiente etichettato con la periferica. Determinare la percentuale di flusso, o millilitri al minuto, da ciascuna linea utilizzando le equazioni indicate.
La porta centrale dovrebbe essere circa il 40% e la porta periferica circa il 60%. Se i valori differiscono di oltre il due percento, modificare la lunghezza o il diametro del tubo per regolare il rapporto di flusso. Quindi ripetere i passaggi di raccolta e calcolo.
Quindi, chiudere il flusso della pompa e collegare la linea dell'iniettore alla porta centrale dell'ingresso della colonna. Collegare anche la linea dal raccordo a T alla porta periferica dell'ingresso della colonna. Aumentare lentamente la portata a un millilitro al minuto di fase mobile al 100% B.To terminare la messa a punto del sistema, far fluire il 100% di metanolo a un millilitro al minuto per 10 minuti per equilibrare la colonna.
Per iniziare, utilizzare un tubo per collegare la porta di uscita centrale al rilevatore UV-Vis. Collegare lo stesso tipo e lunghezza di tubo alla porta di uscita periferica della colonna CF. Quindi, impostare la pompa su una portata di un millilitro al minuto.
Tarare due recipienti di raccolta vuoti ed etichettare nuovamente uno per la raccolta centrale e uno per la periferica. Per 60 secondi, utilizzare il recipiente con etichetta centrale per raccogliere la fase mobile in uscita dal rivelatore UV-Vis. Pesare nuovamente il recipiente di raccolta per determinare la massa di soluzione elusa.
Ripetere questo processo con la porta di uscita periferica e il recipiente di raccolta etichettato. Determinare ora la percentuale di flusso da ciascuna linea come eseguito in precedenza con il flusso di ingresso. La linea UV-Vis dovrebbe essere del 21% e il flusso di uscita periferico dovrebbe essere del 79%.
Se il rapporto di flusso si discosta in modo significativo, regolare le dimensioni del tubo collegato all'uscita del rilevatore UV-Vis per modificare la percentuale di flusso centrale. È importante che i rapporti di flusso tra il centrale e il periferico all'ingresso e all'uscita della colonna seguano questo protocollo per garantire prestazioni ottimali della colonna di flusso a tendina. Le colonne con tecnologia a flusso attivo sono state sviluppate utilizzando un design specializzato in fritta nei raccordi terminali della colonna multiporta per superare l'eterogeneità del letto della colonna e migliorare le prestazioni di separazione.
Una miscela di prova contenente fenetolo, butilene e pentilbenzene è stata analizzata su colonne convenzionali di diametro interno di 4,6 e 2,1 millimetri e su una colonna di flusso a tenda di diametro interno di 4,6 millimetri. La separazione della miscela illustra le migliori prestazioni in termini di efficienza e sensibilità di una colonna a flusso a tenda rispetto alle colonne standard. L'uso di una colonna di flusso a tenda ha aumentato il segnale per il butilbenzene nonostante il volume di picco ridotto.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere impostata in meno di mezz'ora se eseguita correttamente. La configurazione della colonna di flusso a tendina può essere riutilizzata più e più volte, ma i rapporti di flusso devono essere controllati regolarmente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere il più vicino possibile ai rapporti di flusso prescritti.
La colonna a flusso a tendina ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'HPLC per spingere i limiti delle colonne e degli strumenti UPLC per ottenere un'analisi del campione più rapida senza compromettere le prestazioni di separazione. Dopo aver visto questo video, è necessario comprendere l'importanza delle colonne a flusso tendina, in quanto possono fornire una migliore separazione rispetto alle colonne HPLC convenzionali.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'ottimizzazione delle colonne Active Flow Technology (AFT) in modalità Curtain flow (CF). Il metodo mira a migliorare le prestazioni di separazione, in particolare nei settori che richiedono elevata sensibilità ed efficienza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Scienze ambientali
- Scienze forensi
- Analisi di campioni in tracce
Sfondo
- I metodi convenzionali di HPLC possono mancare di efficienza e sensibilità.
- La colonna a flusso di cortina è un approccio innovativo nella HPLC.
- L'ottimizzazione dei rapporti di flusso è essenziale per un uso efficace.
- Questa tecnica è efficiente sotto il profilo economico e temporale.
Scopo dello studio
- Per migliorare l'efficienza e la sensibilità della separazione.
- Per fornire un metodo affidabile per l'analisi in tracce.
- Per aumentare la velocità e la capacità delle separazioni.
Metodi Utilizzati
- Ottimizzazione dei rapporti di flusso in colonne a flusso di tenda.
- Confronto con metodi HPLC convenzionali.
- Applicazione in diversi campi scientifici.
- Sviluppo di protocolli per l'implementazione pratica.
Risultati principali
- Maggiore efficienza delle separazioni.
- Sensibilità migliorata dell'analisi.
- Applicazione con successo nelle scienze ambientali e forensi.
- Facilità d'uso dimostrata per gli operatori.
Conclusioni
- La colonna a flusso a tendina rappresenta un notevole progresso nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
- I rapporti di flusso ottimizzati sono fondamentali per massimizzare le prestazioni.
- Questo metodo può affrontare le principali sfide nell'analisi di campioni in tracce.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tecnologia della colonna a flusso a tendina (CF) risponde alla necessità di un'efficienza e sensibilità di separazione migliorate nelle applicazioni di analisi in tracce, in particolare quando il caricamento del campione e i limiti di rilevamento sono critici. Ottimizzando i rapporti di flusso per creare una colonna virtuale di "diametro infinito", il metodo riduce la dispersione radiale e migliora la risoluzione dei picchi senza compromettere la produttività. Questo approccio supporta la previsione affidabile nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta, dove è richiesta una caratterizzazione affidabile dei composti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di miscele complesse migliorando la risoluzione di composti con tempi di eluizione simili, supportando l'identificazione di bersagli nelle fasi iniziali di screening.
- Valore operativo: Aumenta la sensibilità per analiti a bassa abbondanza, consentendo la rilevazione di segnali deboli in matrici biologiche complesse.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce output di separazione quantitativi e riproducibili, essenziali per la standardizzazione del saggio e la conferma dei risultati positivi.
- Valore operativo: La regolazione del rapporto di flusso garantisce prestazioni costanti tra diversi esperimenti, supportando la robustezza e la scalabilità del saggio in contesti a media produttività.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo una separazione netta di metaboliti o prodotti di degradazione in campioni preclinici.
- Valore operativo: Una configurazione della colonna riutilizzabile, con verifica routinaria del rapporto di flusso, consente una continuità a lungo termine del metodo attraverso le fasi di scoperta.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla valutazione iniziale dell'hit all'ottimizzazione del composto leader, in cui dati affidabili di separazione forniscono informazioni per la conferma strutturale e la valutazione della purezza.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi risolvendo interferenti co-eluiti che potrebbero oscurare i segnali di interazione con il bersaglio.
- Screening: Fornisce letture quantitative ad alta sensibilità che consentono confronti accurati tra librerie di composti.
- Analitica: Genera parametri di efficienza e sensibilità dipendenti dal rapporto di flusso, utilizzati per valutare la qualità della separazione e l'idoneità del metodo.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla scoperta alla fase preclinica fornendo un comportamento cromatografico costante per il tracciamento di biomarcatori o metaboliti.
- Riutilizzo aziendale: La piattaforma di colonne CF è progettata per un uso ripetuto, con l'ottimizzazione del flusso come procedura standardizzata e trasferibile tra team e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva grazie a una risoluzione e sensibilità migliorate, con riduzione dei falsi negativi nell'analisi di tracce.
- Valore operativo: Standardizzazione mediante protocolli basati sui rapporti di flusso, che garantiscono riproducibilità e riducono i tempi di sviluppo del metodo.
- Valore strategico: Consente decisioni più accurate di tipo go/no-go fornendo dati più puliti in una fase precoce del processo, riducendo il rischio di eliminazione tardiva.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce una priorizzazione adeguata al rischio grazie a dati analitici affidabili che guidano l'avanzamento dei composti.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nella configurazione del sistema HPLC e nella dinamica del flusso.
- Necessita di tubi e raccordi di precisione per raggiungere e mantenere i rapporti di flusso specificati (ad esempio, 40:60 in ingresso, 21:79 in uscita).
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i team delle procedure di taratura per garantire prestazioni costanti della colonna.
- Comporta considerazioni di adattamento nel trasferire il metodo tra diverse chimiche delle colonne o tipi di detector.
- Limite pratico: le prestazioni dipendono da un rigoroso rispetto delle tolleranze del rapporto di flusso; deviazioni superiori al 2% richiedono una nuova ottimizzazione.
