Forno a microonde-driven sintesi di ossido di ferro Nanoparticelle per il rilevamento rapido di aterosclerosi

L'obiettivo generale di questo protocollo è l'uso della tecnologia a microonde per la sintesi rapida e la funzionalizzazione di nanoparticelle di ossido di ferro con una porzione bifosfonata per il rilevamento rapido mediante risonanza magnetica dell'aterosclerosi in modelli murini. L'uso della tecnologia a microonde nella sintesi e funzionalizzazione di nanoparticelle di ossido di ferro è ancora limitato. Tuttavia, dimostriamo come sia possibile sviluppare nanoparticelle di alta qualità e protocolli estremamente veloci.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che in tempi estremamente brevi è possibile produrre nanoparticelle funzionalizzate di alta qualità e utilizzarle per il cateterismo delle placche di aterosclerosi mirate alle microcalcificazioni. Per iniziare questa procedura, aggiungere 0,5 grammi di ferro 3-acetilacetenato, 1,4 millilitri di acido oleico, 0,6 millilitri di oleylammina e 1,19 grammi di 1,2-esadodecanediolo a un pallone adattato al microonde. Aggiungere con cautela 10 millilitri di etere fenilico lungo la parete del pallone utilizzando una pipetta graduata.

Successivamente, posizionare il pallone in un reattore a microonde e avviare il protocollo a microonde caricando uno studio dinamico nel microonde. Al termine della reazione e dopo che il pallone si è raffreddato a temperatura ambiente, trasferire la miscela di reazione in un pallone di Erlenmeyer utilizzando una pipetta di vetro e aggiungere 10 millilitri di etanolo al 98%. Posizionare il pallone sopra un magnete al neodimio niobio e boro e rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro dopo 5 minuti.

Quindi, aggiungi 10 millilitri di etanolo al pallone. Sonicare il campione a 40 kilohertz per due minuti a temperatura ambiente. Al termine, posizionare il campione sul magnete e rimuovere il surnatante.

Disperdere le nanoparticelle rivestite di acido oleico in 30 millilitri di cloroformio e sonicare a 40 kilohertz per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la sonicazione, trasferire 0,5 millilitri di nanoparticelle in una cuvetta di vetro e aggiungere 0,5 millilitri di cloroformio. Controllare la dimensione idrodinamica in uno zetasizzatore secondo le istruzioni del produttore.

A questo punto, sciogliere 44,3 milligrammi di permanganato di potassio e 150,4 milligrammi di cloruro di benzoiltrimetilammonio in una miscela tre a due di acqua e cloroformio. Aggiungere la soluzione risultante a 5 millilitri di Aliquat di nanoparticelle rivestite di acido oleico in un pallone adattato alle microonde. Avvia il protocollo a microonde per le nanoparticelle di acido azelaico impostando la temperatura a 105 gradi Celsius, il tempo a nove minuti, la pressione a 250 psi e la potenza a 300 watt.

Successivamente, aggiungere 10 millilitri di tampone fosfato a pH 2,9 nel pallone. Dopo aver ripetuto il protocollo a microonde e aver rimosso il surnatante, aggiungere 10 millilitri di acqua al pallone e trasferire il composto in un pallone di Erlenmeyer. La fase più critica è la purificazione delle nanoparticelle di acido azelaico.

Quindi, aggiungere 5 millilitri di bisolfato di sodio al 10% al pallone di Erlenmeyer e sonicare a 40 kilohertz per due minuti a 25 gradi Celsius. Dopo aver raccolto le particelle e rimosso il surnatante, lavare le nanoparticelle altre tre volte con idrossido di sodio all'1%. Ridisperdere le particelle in 5 millilitri di tampone fosfato a pH 7,2.

Per verificare le dimensioni idrodinamiche e il potenziale zeta, trasferire 0,7 millilitri di nanoparticelle di acido azelaico in una cellula capillare ripiegata monouso e posizionarla nello zetasizzatore per l'analisi. Aggiungere 12 milligrammi di EDC e 15 milligrammi di sulfo-NHS in una provetta da centrifuga con 2 millilitri di Aliquat di nanoparticelle di acido azelaico. Agitare il composto a temperatura ambiente per 35 minuti.

Dopo aver posizionato un magnete sotto la provetta da centrifuga per destabilizzare le nanoparticelle, aspirare il surnatante e lavare le particelle con 1,5 millilitri di tampone hepes da 1 millimolare. Quindi, aggiungere 5 milligrammi di neridronato e agitare il composto per due ore. Separare le nanoparticelle con un magnete e lavare con un tampone hepes da 1 millimolare.

Infine, disperdere le nanoparticelle di neridronato in 2 millilitri di tampone hepes da 1 millimolare. Per verificare le dimensioni idrodinamiche e il potenziale zeta, aggiungere 0,7 millilitri di nanoparticelle di neridronato a una cellula capillare ripiegata monouso e posizionarla nello zetsizer per l'analisi. Tutte le nanoparticelle presentavano piccole dimensioni idrodinamiche in una distribuzione dimensionale molto stretta.

Le particelle presentano un'eccellente cristallinità, come mostrato nelle immagini TEM. Inoltre, gli stessi risultati per le dimensioni e la distribuzione idrodinamica sono stati ottenuti dopo quattro ripetizioni della sintesi, dimostrando uno degli aspetti più importanti dell'approccio a microonde, la sua riproducibilità. Le proprietà di legame degli ioni calcio dovute ai bifosfonati presenti nelle nanoparticelle di neridronato sono state verificate mediante rilassometria e hanno dimostrato che il tempo di rilassamento T2 aumenta linearmente con la quantità di ioni calcio e il tempo di incubazione a causa della formazione di cluster di nanoparticelle, mentre le nanoparticelle senza ioni calcio sono rimaste stabili.

Gli esperimenti di risonanza magnetica in vivo sono stati eseguiti in topi knockout per l'apoe di 48 settimane e a un'ora dopo l'iniezione, il segnale dalla placca era ipointenso rispetto alle immagini basali. Inoltre, il rapporto placca/muscolo era significativamente diverso tra le immagini basali e un'ora dopo l'iniezione. Il segnale nel fegato è stato monitorato anche dopo l'iniezione delle nanoparticelle di neridronato che sono state completamente eliminate dalla circolazione dopo 20 minuti, confermando l'accumulo selettivo di queste nanoparticelle verso la placca aterosclerotica.

Sono state eseguite immagini e istologie ex vivo e l'imaging delle aorte, con e senza nanoparticelle, ha mostrato differenze nell'intensità del segnale in accordo con gli esperimenti in vivo. Una volta padroneggiata, la tecnologia a microonde consente la caratterizzazione della sintesi e il rilevamento della placca in un tempo totale di 3 ore, se eseguita correttamente. Un altro vantaggio di questo metodo è che, con una piccola modifica, possono essere eseguite altre tecniche di imaging, come la termografia, al fine di rispondere a domande aggiuntive come la quantificazione dell'aterosclerosi.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging cardiovascolare per esplorare la diagnosi precoce dell'aterosclerosi con una configurazione sperimentale che può essere facilmente adattata alle esigenze cliniche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre nanoparticelle idrofile di ossido di ferro con le microonde e la sua applicazione nell'imaging cardiovascolare. Non dimenticare che lavorare con i forni a microonde può essere pericoloso a seconda del forno utilizzato e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come il controllo della pressione della cisterna.