Cellule staminali simil- Xenopus Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale In Vitro E In Vivo

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare espianti di x laevis blastocoel roof o di cappello animale per testare i meccanismi molecolari e i processi cellulari alla base dello sviluppo neurale in vitro e in vivo. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo e della biologia delle cellule staminali sull'acquisizione del destino, la migrazione cellulare e le proprietà autonome e non autonome delle cellule neurali. Le tecniche presentate forniscono strumenti semplici, economici, versatili ed efficienti per esplorare il meccanismo fondamentale dei comportamenti chiave delle cellule neurali.

Questi saggi consentono di testare i determinali del destino neurale per la riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte e la generazione matura di legami cellulari di derivazione neurale ha favorito lo screening. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché le tecniche richiedono destrezza manuale. Ho avuto l'idea di questi metodi per la prima volta quando stavo pensando di analizzare il comportamento di segregazione cellulare.

Per montare in piano un tubo neurale anteriore di xenopus laevis, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire un embrione fissato, disidratato e reidratato in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita fino in cima con PBT. Quindi, inserire un paio di pinze sottili tra gli occhi e il tubo neurale a livello del gambo ottico e staccare gli occhi. Quindi, introdurre con cautela la pinza sotto l'ectoderma sovrastante il tubo neurale dietro la testa e staccare con cura l'ectoderma.

Dopo aver eseguito l'appropriata etichettatura di ibridazione NC2, trasferire l'embrione in una nuova capsula di Petri da 60 millilitri riempita di PBT e utilizzare una pinza fine per isolare grossolanamente il tubo neurale anteriore dall'embrione. Quindi, rimuovere con cautela la notocorda attaccata in modo lasco da sotto il tubo neurale. Se necessario, le vescicole otiche e le restanti parti del mesoderma.

Quando tutte le appendici del tubo neurale sono state recise, separare il tubo neurale anteriore dall'embrione. Quindi, trasferire il tubo neurale isolato in un tubo conico da 1,5 millilitri riempito con glicerolo al 50% e PBS per il trattamento notturno a quattro gradi Celsius. Dopo un secondo trattamento notturno in glicerolo al 90%, trasferire il tubo neurale su un vetrino da microscopio in una piccola quantità di glicerolo e utilizzare aghi di tungsteno per sezionare i tubi neurali lungo le linee mediane dorsali e ventrali.

Quindi utilizzare anelli di rinforzo coperti da un vetrino coprioggetti per montare i due lati del tubo neurale in glicerolo e PBS al 90%. Per preparare il cordone per l'induzione dell'espiantazione del cappello animale, utilizzare una micropipetta P200 per dividere metà di un'aliquota di perle di resina trattate con BSA in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Quindi, sostituire l'acqua distillata sterile nella nuova provetta con 200 microlitri di terreno contenente la molecola sperimentale di interesse per due ore a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, trasferire gli embrioni di blastula o gastrula molto precoce in PBS con calcio e magnesio integrati con lo 0,2% di BSA. Successivamente, sotto uno stereomicroscopio, pizzicare la membrana vitellina con il lato di un paio di pinze e utilizzare un secondo paio di pinze per staccare lentamente la membrana dal lato vegetale dell'embrione facendo attenzione a non danneggiare il lato animale. Quindi, usando una pinza fine, ritaglia un quadratino dal palo dell'animale di ogni embrione.

Utilizzando un puntale per pipetta rivestito in BSA, trasferire i tappi nei singoli pozzetti di una piastra multipozzetto Terasaki in soluzione salina di Barth modificata 0,5X, posizionando il lato dell'animale pigmentato a contatto con il fondo rotondo del pozzetto. Utilizzando una micropipetta P20, selezionare le perle rosa più scuro dal tubo di trattamento e posizionare una perlina su ciascun tappo, utilizzando una pinza per centrare le perle sui tappi. Quando l'ultima perlina è stata posizionata, posizionare la piastra sopra della carta imbevuta d'acqua e coprire la piastra con un contenitore di plastica prima dell'incubazione.

Per preparare espianti di cappello animale dissociati e riaggregati, isolare da 15 a 30 cappucci animali come appena dimostrato. Usando una pinza fine per ritagliare un piccolo quadrato di tessuto dai pali dell'animale. Trasferire i cappucci degli animali in un pozzetto rivestito di agarosio riempito con soluzione salina Holtfreter priva di calcio con i lati pigmentati rivolti verso l'alto.

Dopo alcuni minuti, si dovrebbe osservare la disaggregazione. Usa una pinza sottile per separare gli strati pigmentati dal resto del tessuto. Quindi, utilizzare una micropipetta P20 per scartare il pigmento.

Quando la maggior parte degli strati pigmentati è stata rimossa e le cellule sono completamente dissociate, agitare la piastra per centrare le cellule e utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere quanto più terreno possibile, facendo attenzione a non toccare le cellule. Quindi, aggiungi un millilitro di soluzione salina di Holtfreter con calcio al pozzetto. Trasferire i cappucci degli animali dissociati in una provetta da 1,5 millilitri.

Dopo aver fatto girare le cellule, utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere con cura il surnatante e risospendere il pellet in 20 microlitri di soluzione salina di Holtfreter con calcio. Lasciare che le cellule si riaggreghino per tre-sei ore a temperatura ambiente. Quindi aggiungere lentamente un millilitro di 3/4 di NAM per staccare con cura gli espianti dal fondo della provetta e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per distribuire gli espianti in singole piastre non rivestite.

Per espiantare espianti di cappello animale su piastre neurali di xenopus laevis, rivestire prima piastre di Petri da 60 millimetri con agarosio al 3% e NAM 3/4 in cui sono stati praticati piccoli fori. Successivamente, trasferire gli embrioni di neurula precoce in PBS con calcio e magnesio integrati con un BSA allo 0,2% per la rimozione della membrana vitellina. Quindi riempire la piastra di dissezione rivestita di agarosio con 3/4 NAM fresco e trasferire gli embrioni nella piastra di dissezione con il lato dorsale rivolto verso l'alto.

A questo punto, trasferire un espiante riaggregato con tappo di animale sulla piastra di dissezione in modo che l'espiante affondi lentamente nella piastra per gravità una volta che la punta della pipetta ha violato la superficie NAM. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una pinza arrotondata per tenere l'embrione in posizione mentre si utilizza un ago di tungsteno per praticare un'incisione sulla piastra neurale per l'espianto. Ritaglia un piccolo pezzo dell'espiante del cappello dell'animale riaggregato usando una pinza arrotondata e un coltello per sopracciglia.

Utilizzare il frammento di tessuto per dimensionare un pezzo di espianto per l'innesto. Questa figura mostra i tubi neurali anteriori X laevis e X tropicalis montati in piano, come appena dimostrato negli stadi 30, 32 e 35 dopo l'ibridazione NC2 doppia a montaggio intero. Come osservato in queste immagini, l'espressione di xenopus sonic hedgehog è rilevata nelle cellule a contatto con perle imbevute di terreno condizionato integrato con l'estremità terminale del gene sonic hedgehog, ma non nelle cellule a contatto con le perle trattate con il mezzo di controllo.

Dopo la dissociazione e la riaggregazione, come appena dimostrato, questi espianti con cellule di cap animale anteriorizzate sono stati mescolati con cellule di cap animali anteriorizzate che esprimono Otx2. Come osservato, queste cellule che esprimono Otx2 non si segregano dalle cellule che non esprimono Otx2. Entrambi i tipi di cellule si sono mescolati liberamente durante l'espianto.

Al contrario, negli espianti in cui le cellule che esprimono Otx2 sono state mescolate con cellule che esprimono BAR HL-2, Otx2 e IRX3, le cellule che esprimono il multigene hanno formato patch coesive che non si sono diffuse uniformemente all'interno dell'espiante riaggregato. Quando innestati nella placca neurale anteriore di embrioni di x laevis, come appena dimostrato, gli espianti misti composti da cellule che coesprimono BAR HL-2, Otx2 e IRX3 mescolate con cellule che esprimono il riccio sonico N-terminale hanno mostrato un'espressione indogena del riccio sonico e segregati dalle cellule epiteliali neurali anteriori. Mentre, quando gli espianti misti composti da cellule che esprimono Otx2 e N-terminus sonic hedgehog sono stati innestati nella piastra neurale x laevis, le cellule grattugiate non hanno espresso sonic hedgehog né sono state segregate dalle loro vicine.

Una volta padroneggiato, l'innesto dell'espiante del cappello animale su placche neurali embrionali può essere eseguito in due o tre ore a seconda del numero di embrioni innestati. È una tecnica molto robusta e molto gratificante. Quando si tenta questa procedura, è importante prestare la massima attenzione alla contaminazione batterica e fungina.

Dopo le procedure di innesto, possono essere eseguiti altri metodi come l'ibridazione in situ a montatura intera per seguire i destini e i comportamenti delle cellule innestate. I programmi di sviluppo alla base dell'organogenosi del tubo neurale sono in gran parte conservati, soprattutto nei vertebrati. Pertanto, le informazioni acquisite negli anfibi hanno migliorato la nostra comprensione dei processi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo dei vertebrati.