Name: Cellule staminali simil- Xenopus Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale In Vitro E In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri i protocolli per esplanti del tetto del blastocele di Xenopus laevis per studiare lo sviluppo neurale precoce in vitro e in vivo. Questi metodi versatili aiutano a comprendere i meccanismi molecolari della biologia dello sviluppo.

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L'autore ringrazia Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef e Anne Hélène Monsoro-Burq per il loro aiuto e consiglio, e la Struttura per Animali dell'Institut Curie. L'autore ringrazia Paul Johnson per il suo lavoro di editing sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) e da sovvenzioni dell'"Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 e ARC 5115; FRC DOC20120605233 e LABEX Memolife) e la Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Gli esperimenti sono conformi alle normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento. 1. Flat-montaggio Xenopus laevis Girini anteriore del tubo neurale Dopo tutto il montaggio ibridazione in situ <ol><li> Ottenere X. laevis embrioni secondo le procedure standard 4 e invecchiare fino a raggiungere neurula palco 26 e più anziani (secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17. </li><li> Fix X. laevis tadpoles incubandoli in una soluzione di 4% paraformaldeide (PFA). Rock and ruotare gli embrioni in un flaconcino di vetro da 2 ml, 1 a 1,5 ore a temperatura ambiente per la fase 26 di mettere in scena 38 embrioni, 2 ore a temperatura ambiente per gli embrioni in fasi successive. ATTENZIONE: PFA è tossico per contatto e un sospetto cancerogeno. Dovrebbe essere manipolato sotto cappa. NOTA: X One laevis nidiata èdi solito fissato in un flaconcino di vetro da 2 ml, ma un grande fiala di vetro può essere utilizzato. </li><li> Lavare gli embrioni nella stessa fiala utilizzando 1x PBS con 0,1% di Tween (PBT), 3 minuti a temperatura ambiente, due volte. NOTA: Se non altrimenti specificato la PBS usato è con o senza calcio e magnesio. </li><li> Disidratare embrioni in 100% di metanolo (MeOH) per almeno 12 ore a RT nello stesso flaconcino. Modificare il MeOH 100% almeno due volte sotto il cofano con una micropipetta plastica. NOTA: Il MeOH assume una colorazione giallastra come lipidi in essa disciolti. Attenzione il MeOH è tossico per inalazione e deve essere manipolato sotto una cappa. </li><li> Reidratare gli embrioni utilizzando la stessa flaconcino attraverso una serie graduata di bagni MeOH: MeOH 75% in PBS MeOH 50% in PBS MeOH 25% in PBS PBS due volte, ogni vasca 5-10 min a RT. Le soluzioni MeOH vengono modificate sotto il cofano con una micropipetta di plastica. </li><li> Usando una pipetta di plastica, trasferire l&#39;embrione deve essere sezionato in una piastra di Petri 60 millimetri riempito al top con PBT. Utilizzando due pinza sottile curarimuovere completamente gli occhi inserendo una pinza sottile tra gli occhi e il tubo neurale, a livello del gambo ottica. Staccare gli occhi dal tubo neurale. Introdurre con attenzione le pinze sotto l&#39;ectoderma sovrastanti il ​​tubo neurale. Con cura, staccare l&#39;ectoderma partendo da dietro la testa e gettarlo. </li><li> Eseguire un ISH doppia o singola con digossigenina-etichettati o sonde fluoresceina come descritto in precedenza 18,19. </li><li> Dopo la ISH trasferire gli embrioni in una nuova 60 mm piatto Petri riempito l&#39;alto con PBT con una pipetta di plastica. </li><li> Utilizzando una pinza sottile staccare con cura il tubo neurale dal resto dell&#39;embrione. In questa fase, il tubo neurale anteriore separa dal tubo posteriore neurale. Staccare con cautela restanti parti del ectoderma sovrastanti il ​​tubo neurale, la notocorda che è vagamente collegato al di sotto del tubo neurale, le vescicole otic e restanti parti del mesoderma. Assicurarsi che il tubo neurale è privo di appendiciin questa fase. NOTA: per evitare di danneggiare il tubo neurale eseguire tutte neurali trasferimento tubo / embrione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta, se necessario, con un taglio punta alla sua estremità. Il diametro della punta fine è adeguata alle dimensioni del tubo neurale. </li><li> Trasferire il tubo neurale sezionato (vedi nota passo 1.9) in una provetta da 1,5 ml piena di glicerolo al 50% diluito in PBS. Attendere i tubi neurali sono caduti al fondo della soluzione di glicerolo, di solito O / N a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di glicerolo al 50% / PBS usando una micropipetta P1000 e aggiungere nello stesso tubo 1,5 ml di una soluzione di 90% glicerolo / PBS usando una micropipetta P1000. Attendere i tubi neurali cadono sul fondo della soluzione 90% glicerolo / PBS, solitamente O / N a 4 ° C. NOTA: per l&#39;archiviazione a lungo termine, di utilizzare il 90% di glicerolo / PBS più antibiotici per prevenire lo sviluppo di batteri. </li><li> Trasferire i tubi neurali su una lastra di vetro o un vetrino da microscopio con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Dissetta i tubi neurali lungo la dorsale e ventrale linee mediane utilizzando aghi di tungsteno. Durante questo passo i tubi neurali sono mantenute in 90% glicerolo / PBS. </li><li> Montare le due lati del tubo neurale in 90% glicerolo / PBS utilizzando anelli di rinforzo coperto con vetrino coprioggetti. </li><li> Fissare i coprioggetti con vernici e tenere a 4 ° C. </li></ol> 2. Cap Animal Espianti induzione utilizzando biglie scambio di anioni resina <ol><li> Trasferire 100 ml di perle di resina a scambio anionico in una provetta da 2 ml con una micropipetta P1000. Lavare le perline almeno cinque volte consecutive con acqua distillata sterile. Lasciare le perline per sedimentare sul fondo del tubo e sostituire l&#39;acqua distillata sterile utilizzando una micropipetta P1000. Non toccare le perline. </li><li> Lasciare le perline ammollo O / N in una provetta 2 ml riempita con acqua distillata sterile con Bovine Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C. </li><li> Due ore prima di raccogliere l&#39;ACS, luogo la metà delle perline in un nuovo 1,5 mltubo con una micropipetta P1000. Sostituire l&#39;acqua distillata sterile con 500 ml di mezzo contenente la molecola da testare per il suo potenziale induttivo, o noti per indurre un destino specifico. Mantenere l&#39;altra metà delle perline, in quanto saranno utilizzati come controllo negativo. </li><li> Incubare le perle a 4 ° C per almeno 2 ore. </li><li> Eseguire tutte le fasi successive allo stereomicroscopio ed eseguire tutti i trasferimenti di CA con una micropipetta. </li><li> Trasferire blastula o embrioni molto precoci gastrula in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA con una pipetta di trasferimento di plastica. NOTA: Gli embrioni in via di sviluppo in C portata blastula e gastrula fasi 12 ° in 20-24 ore. </li><li> Rimuovere membrana vitellina dell&#39;embrione con pinze come descritto in precedenza 20. Fissare l&#39;embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo la membrana, lentamente staccarlo l&#39;embrione. Eseguire questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell&#39;embrione. Non danneggiare il lato animale dell&#39;embrione. </li><li> Isolare piccoli AC come descritto in precedenza 21. Il polo animale è parte pigmentata dell&#39;embrione. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo le cellule ectodermiche. Assicurarsi che il tessuto è di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall&#39;analisi. </li><li> Mettete ogni AC in Terasaki piastre a pozzetti multipli a 0.5x modificate di Barth Saline (MBS) 4. Posizionare il AC nel pozzo con il lato pigmentata dell&#39;animale, a contatto con il fondo rotondo del pozzo. NOTA: pipette di rivestimento con una soluzione di BSA 0,1% impedisce l&#39;adesione di piccoli pezzi di tessuto adesivo alla plastica. </li><li> Mettere una sferetta su ogni tappo con un P20 micropipetta. Se necessario, utilizzare pinze per posizionare accuratamente il tallone al centro del tappo. NOTA: quando imbevuta di un mezzo condizionato, le perle sono colorati in rosa. Selezionare il maggior numero di coperline lored. </li><li> Incubare a temperatura ambiente (da 18 a 22 ° C) per 6 ore senza spostare la piastra Terasaki pozzetti. Il tallone attacca alla corrente alternata in meno di 2 ore. </li><li> Posizionare la piastra pozzetti Terasaki sulla cima di documenti imbevuto di acqua. Coprire la piastra con un contenitore di plastica. NOTA: Questo &#39;camera di umidita&#39; impedisce l&#39;evaporazione prematura dei pozzetti. </li><li> Cultura l&#39;ACS a 0,5x MBS o 3/4 NAM (vedere il punto 4.1) nella camera umida, a 15-20 ° C fino a quando gli embrioni di pari livello hanno raggiunto la fase giusta per testare l&#39;effetto del fattore. </li><li> Fissare la AC per 1 ora in preparati al momento 4% PFA. Disidratare il ACs in 100% MeOH come precedentemente descritto (Passo 1.4). </li></ol> 3. Cap Animal Dissociazione cellulare e riaggregazione Prima Innesto in Xenopus laevis neurula <ol><li> Piatti petri Coat (60 mm) o 12 pozzetti piastre con 3% agarosio in acqua sterile o in PBS senza calcio e magnesio. Aggiungi abbastanza agarosio per coprire la bottom della capsula di Petri e il bene. Pre-riscaldare le piastre a RT (18-22 ° C). Facoltativamente, memorizzate le piastre per due giorni a 4 ° C per evitare la disidratazione. </li><li> Preparare senza calcio salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)), e soluzione salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mm HEPES, 0,1% BSA pH 7.6) 5. NOTA: la soluzione di CaCl 2 non può essere autoclavata. </li><li> Riempire il agarosio rivestite bene verso l&#39;alto con soluzione salina priva di calcio di Holtfreter. </li><li> Preparare blastula o embrioni molto precoci gastrula per isolare i loro ACs come descritto in precedenza (punti 2,5-2,7). </li><li> Isolare almeno 15 o fino a 30, 21 piccolo ACs. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo celle ectodermiche ed è quindi di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall&#39;analisi. NOTA: Il polo animale è il Embryparte pigmentata di o. </li><li> Trasferire l&#39;ACS in un agarosio rivestite ben riempito al top con soluzione fisiologica di Holtfreter senza calcio. Posizionare l&#39;ACS con il loro lato pigmentata rivolto verso l&#39;alto. NOTA: Il processo di dissociazione inizia rapidamente in soluzione salina di Holtfreter senza calcio. </li><li> Attendere qualche minuto per le cellule per iniziare dissociare. Osservare questo attraverso disaggregazione dei tessuti. Utilizzando una pinza sottile, separare lo strato pigmentato dal resto della AC e gettarli con un P20 micropipetta. Completa processo di dissociazione cella indica la separazione delle cellule tra loro. NOTA: Uno o due strati pigmentati possono essere lasciati alla espianto ri-aggregati per aiutare la visualizzazione durante l&#39;innesto. </li><li> Centrare le cellule utilizzando movimenti circolari della piastra. Usando una micropipetta p1000 rimuovere accuratamente quanto mezzo possibile. Fare attenzione a non toccare le cellule. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con calcio al pozzo. Trasferire l&#39;ACS dissociatein una provetta da 1,5 ml. NOTA: 2 ml tubi non possono essere utilizzati a causa della loro fondo rotondo. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione, 5 min ad una velocità massima di 2.000 giri al minuto per una centrifuga da banco (500 xg). Rimuovere con attenzione il surnatante con una micropipetta P1000. </li><li> Aggiungi alle cellule dissociate 20 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con il calcio (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6) 5. </li><li> Mantenere il dissociato ACs, da 3 a 6 ore a temperatura ambiente (18-22 ° C). NOTA: È tempo necessario per le cellule di ri-aggregazione. La riaggregazione è visibile come le cellule formano una pallina sul fondo della provetta. </li><li> Staccare con cautela l&#39;espianto dal fondo della provetta con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,5x MBS o da 1 ml di 3/4 NAM (vedi punto 4.1). Trasferire l&#39;espianto in un piatto non-rivestita con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Fase espianti che utilizzano i loro fratelli di controllo. Per uso a lungo termine cultura antibiotici: kanamycin (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml). </li></ol> 4. Accrescimento di animali Caps Espianti nella placca neurale di X. laevis Embrione <ol><li> Preparare 3/4 NAM (110 mM NaCl, KCl 2 mm, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 NaHCO mm 3, 0.2x PBS, 50 mg / ml di gentamicina). Non tenere per più di 1 settimana per la dissezione e conservare a 4 ° C. NAM più vecchio può essere utilizzato per la preparazione di piatti dissezione agarosio rivestite (sotto). </li><li> Piatti cappotto di Petri (60 mm), con il 3% agarosio in 3/4 NAM in cui piccoli fori sono stati realizzati utilizzando uno stampo in silicone, o la copertura di una racchetta da ping-pong. NOTA: L&#39;agarosio copre il fondo della capsula di Petri. Lasciare un po &#39;di spazio in modo che la capsula di Petri da riempire con 3/4 NAM. In alternativa, fare piatti dissezione con i non-essiccazione modellazione creta. All&#39;interno l&#39;argilla, spremere gli embrioni leggermente durante la procedura di dissezione. Scavare piccoli fori nellaagarosio usando pinze arrotondate Questo &#39;piatto dissezione&#39; aiuta a tenere gli embrioni durante la procedura di dissezione. </li><li> Raccogliere strumenti di dissezione: pipette di plastica, un &#39;coltello sopracciglio&#39; (realizzato con i capelli sopracciglio inclusi in paraffina sulla punta di una pipetta Pasteur di vetro) 22, due pinze dissezione fine, P1000 micropipetta e suggerimenti, un stereosmicroscope con ingrandimento 8-40X, una fonte di luce brillante con guide in fibra ottica. Tenere tutti gli strumenti di dissezione pulito; dopo ogni esperimento, sciacquare due volte con acqua distillata, una volta con 100% di etanolo e lasciare asciugare. Conservare lontano da polvere e, se necessario, gli strumenti di dissezione in autoclave metallo. </li><li> Lasciate che la ri-aggregato AC (protocollo 3), e loro fratelli dissociato e X. embrioni laevis sviluppano fino a raggiungere stadio 13 (neurula) secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17. Per il trapianto all&#39;interno della fase piastra neurale 13 per mettere in scena 15 embrioni vengono utilizzati. </li><li> Effettuare tuttofasi successive allo stereomicroscopio. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA. Rimuovere membrana vitellina dell&#39;embrione come descritto in precedenza 20. Fissare l&#39;embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo saldamente la membrana, lentamente staccarlo l&#39;embrione. NOTA: Effettuare questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell&#39;embrione. Non danneggiare gli embrioni piastra neurale. Se gli embrioni sono stati danneggiati durante la rimozione fase di membrana vitellina, di trasferire gli embrioni in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 3/4 NAM con un trasferimento pipetta di plastica e attendere 15 minuti, un tempo sufficiente per il processo di guarigione a verificarsi. </li><li> Compila il piatto dissezione verso l&#39;alto con fresco 3/4 NAM. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni senza la loro membrana vitellina nel piatto dissezione. Mettere gli embrioni lato dorsale fino ini pozzi. Durante il processo di trasferimento non consentono l&#39;embrione di entrare in contatto con l&#39;interfaccia aria-liquido dal X. laevis sono lisati dalla tensione superficiale. </li><li> Trasferire il espianto AC da innestare nel piatto dissezione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta P1000. Una volta che la pipetta è all&#39;interno del liquido, consentire gli espianti di affondare lentamente per gravità, o spingere molto delicatamente. </li><li> Mantenere gli embrioni con pinza arrotondati. Con il coltello sopracciglio fare un&#39;incisione nella piastra neurale in cui si intende innestare pezzo del vostro espianto. NOTA: Nella fase 14 la piegatura anteriore della piastra neurale può essere utilizzato come punto di riferimento, segna il territorio diencefalo (Figura 4). </li><li> Tagliare un piccolo pezzo di neuroepitelio, con pinze arrotondate e un coltello sopracciglio. Tagliare un piccolo pezzo di espianto con il coltello sopracciglio. NOTA: Il pezzo di espianto dovrebbe essere circa la stessa dimensione e forma come la zona ablato neuroepitelio. </li&gt; <li> Posizionare il pezzo di espianto nell&#39;incisione neuroepitelio utilizzando il coltello sopracciglio e una pinza sottile. Assicurarsi che l&#39;espianto si attacca rapidamente per l&#39;embrione. </li><li> In alternativa, inserire un pezzo di vetro coprioggetto sul embrione innestato di mantenere l&#39;innesto in posizione. Per fare questo, tagliare un bel vetrino di vetro in pezzi molto piccoli con pinze grossolani. Assicurarsi che la dimensione è di circa 1,5 mm 2. Immergere i pezzi in una capsula di Petri contenente 3/4 NAM o PBS con pinze. Scegliere un pezzo di vetro più grande della embrione per evitare di danneggiarlo. L&#39;embrione sarà un po &#39;appiattito. </li><li> Attendere almeno 30 minuti senza muoversi, o spostare solo il piatto dissezione delicatamente. Lasciate che l&#39;embrione recuperare per 30 minuti a 2 ore e rimuovere delicatamente il vetrino, se necessario. Pipetta con attenzione gli embrioni innestati in un piatto pulito pieno di 3/4 NAM, utilizzando la pipetta plastica. NOTA: Innestata embrioni tendono a sviluppare batteri o funghi contaminazione. A lungo termine culture utilizzare antibiotici: kanamicina (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml). </li></ol>

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<li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+research%3A+metamorphosed+by+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li>
<li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li>
<li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems%3A+a+single+origin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?</a> Evodevo. 4, 27(2013).</li>
<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy%3A+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sviluppo neurale è orchestrata da una complessa interazione tra programmi di sviluppo cellulari e segnali dai tessuti circostanti (Recensito a 3,31,32). Qui si descrive un set di protocolli che possono essere utilizzati in X. laevis embrioni per esplorare fattori estrinseci ed intrinseci coinvolti nella determinazione destino neurale e la morfogenesi neuronale in vitro e in vivo. Questi protocolli possono essere usati come tali X. embrioni tropicalis, tutt...

Il sistema nervoso vertebrato emerge dalla piastra neurale come uno strato omogeneo di cellule neuroepiteliali. Comprendere come sono indotte programmi di sviluppo, codificati, e stabilito durante la regionalizzazione della piastra neurale è, allo stato attuale, un obiettivo importante nella biologia dello sviluppo. Rispetto ad altri sistemi, il sperimentalmente suscettibili di Xenopus embrioni è un modello di riferimento per analizzare i primi passi di sviluppo neurale 1,2. E &#39;facile ottenere un gran numero di embrioni, e sviluppo esterno dà accesso ai primi passi della neurulazione 3. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) lo sviluppo embrionale. Micro-iniezione di mRNA o Morpholinos (MO), tra MO inducibile, insieme agli strumenti biochimiche e farmacologiche, permette di guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (OL) e determinata alterazione delle vie di segnalazione 4,5 controllato. Il blastocoel tetto ectoderma, situato attorno al polo animale di un blastula, o gastrula embrione molto precoce, e denominato &#39;Cap Animal&#39; (AC), è una fonte di cellule pluripotenti che può essere programmato da manipolazione genica prima espianti preparazione. In questo manoscritto sono protocolli dettagliati per usare X. espianti laevis AC per testare in vitro e in vivo dei meccanismi molecolari e dei processi cellulari di sviluppo neurale sottostante. Una tecnica è presentata, permettendo l&#39;osservazione multa di modelli di espressione genica in un tubo neurale girino Xenopus, un passo preliminare per l&#39;identificazione di segnali determinazione destino. Considerando che l&#39;osservazione di tessuti piatto montato è comunemente usato nello studio di embrioni di pollo 6, non è stato correttamente descritto in Xenopus. La manipolazione dell&#39;espressione genica mediante iniezione di mRNA sintetico o MO nei blastomeri di 2 o 4 embrioni stadio cella permette la programmazione di ACespianti 4. Per esempio l&#39;inibizione della proteina morfogenetica (BMP) percorso dalla espressione del movimento anti-BMP fattore Noggin, dà un&#39;identità neurale per celle AC 3. Il protocollo è dettagliata per eseguire esposizione locale e comandato a tempo di espianti AC ai segnali estrinseci tramite contatto diretto con una perlina di resina scambiatrice di anioni. Finalmente una tecnica è descritta per testare le caratteristiche di sviluppo delle progenitori neurali in vivo per il trapianto di espianti miste preparate da cellule distinte programmato dissociate e ri-associati. L&#39;embrione rana è un potente modello per lo studio precoce sviluppo neurale dei vertebrati. Combinando la manipolazione dell&#39;espressione genica di espianto colture in vitro fornisce importanti informazioni per lo studio di neuroepitelio regionalizzazione, la proliferazione e morfogenesi 7-12. La programmazione di espianti AC consentito lo sviluppo di un cuore funzionale ex vivo 13,14. L&#39;usodi espianto innesto 15 ha portato all&#39;individuazione dello switch trascrizionale minimo indurre il programma di differenziazione cresta neurale 16. Il limitans zona per intrathalamica (ZLI) è un centro di segnalazione che secerne sonic hedgehog (Shh) per controllare la crescita e la regionalizzazione del prosencefalo caudale. Quando continuamente esposto a Shh, le cellule neuroepiteliali coexpressing il fattore geni tre trascrizione - Barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) e Iroquois-3 (irx3) - acquistano due caratteristiche del vano ZLI: la competenza a esprimere shh, e la capacità di separare dalle cellule anteriore piastra neurale. Come un sistema modello, l&#39;induzione di un destino ZLI in cellule neuroepiteliali verrà presentato 8. Questi protocolli mirano a fornire semplici, a basso costo, e strumenti efficienti per i biologi dello sviluppo e altri ricercatori per esplorare il mec fondamentalehanisms di comportamenti chiave delle cellule neurali. Tali protocolli sono molto versatili e permettono la ricerca di una vasta gamma di segnali neurali determinazione estrinseci ed intrinseci. Esso consente a lungo termine in analisi in vivo di impegno lignaggio neurale, interazioni induttive e comportamenti delle cellule.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide</td><td>VWR</td><td> 20909.290</td><td>Perle tossiche</td></tr><tr><td>di resina a scambio anionico</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>Per la coltura di cappelle animalepH 7,6</td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp; per la preparazione delle perle</td></tr></tbody></table>

cellule staminali simil-<em&gt; xenopus</em&gt; embrionali espianti di studiare caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; in vitro</em&gt; e<em&gt; in vivo</em

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Comprendere i programmi genetici alla base dello sviluppo neurale è un obiettivo importante della biologia dello sviluppo e delle cellule staminali. Nella blastula anfibia, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti. Queste cellule possono essere isolate e programmate per generare vari tessuti attraverso la manipolazione dell'espressione genica o l'induzione da parte dei morfogeni. In questo manoscritto vengono descritti i protocolli per l'uso di espianti di tetti di blastocele di Xenopus laevis come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce. Questi protocolli consentono lo studio dell'acquisizione del destino, dei comportamenti di migrazione cellulare e delle proprietà autonome e non autonome delle cellule. Gli espianti di blastocele possono essere coltivati in un terreno definito privo di siero e innestati in embrioni ospiti. Questo trapianto in un embrione consente di studiare l'impegno a lungo termine del lignaggio, le proprietà induttive e il comportamento delle cellule trapiantate in vivo. Questi saggi possono essere sfruttati per studiare i meccanismi molecolari, i processi cellulari e le reti di regolazione genica alla base dello sviluppo neurale. Nel contesto della medicina rigenerativa, questi saggi forniscono un mezzo per generare tipi di cellule di derivazione neurale in vitro che potrebbero essere utilizzati nello screening dei farmaci.

Sulla base di considerazioni morfologiche in specie diverse, manipolazioni embriologici, e il pattern di espressione di geni regolatori, un modello concettuale che sostiene la piastra neurale è diviso in segmenti trasversali e longitudinali che definiscono una griglia sviluppo generare campi histogenic distinte. Nel placca neurale, la primordi del prosencefalo, mesencefalo, rombencefalo e del midollo spinale sono tutti già stabilito lungo l&#39;asse antero-posteriore (AP) durante la gast...

Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare espianti del tetto del blastocoele o dell'area animale (animal cap) di x laevis per studiare i meccanismi molecolari e i processi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso in vitro e in vivo. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia dello sviluppo e della biologia delle cellule staminali riguardo all'acquisizione del destino cellulare, alla migrazione cellulare e alle proprietà cellulo-autonome e non autonome delle cellule neurali. Le tecniche presentate offrono strumenti semplici, economici, versatili ed efficienti per esplorare i meccanismi fondamentali che regolano il comportamento delle principali cellule neurali.Questi saggi permettono il test dei fattori determinanti del destino neurale per la riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte e la generazione matura di cellule derivate neurali per ulteriori analisi di screening. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché le tecniche richiedono abilità manuale. Ebbi per la prima volta l'idea di questi metodi quando stavo pensando di an

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

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Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

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Cellule staminali simil- Xenopus Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale In Vitro E In Vivo (Video) | JoVE Journal

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