Name: Cellule staminali simil- Xenopus Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale In Vitro E In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri i protocolli per esplanti del tetto del blastocele di Xenopus laevis per studiare lo sviluppo neurale precoce in vitro e in vivo. Questi metodi versatili aiutano a comprendere i meccanismi molecolari della biologia dello sviluppo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L'autore ringrazia Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef e Anne Hélène Monsoro-Burq per il loro aiuto e consiglio, e la Struttura per Animali dell'Institut Curie. L'autore ringrazia Paul Johnson per il suo lavoro di editing sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) e da sovvenzioni dell'"Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 e ARC 5115; FRC DOC20120605233 e LABEX Memolife) e la Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Gli esperimenti sono conformi alle normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento. 1. Flat-montaggio Xenopus laevis Girini anteriore del tubo neurale Dopo tutto il montaggio ibridazione in situ <ol><li> Ottenere X. laevis embrioni secondo le procedure standard 4 e invecchiare fino a raggiungere neurula palco 26 e più anziani (secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17. </li><li> Fix X. laevis tadpoles incubandoli in una soluzione di 4% paraformaldeide (PFA). Rock and ruotare gli embrioni in un flaconcino di vetro da 2 ml, 1 a 1,5 ore a temperatura ambiente per la fase 26 di mettere in scena 38 embrioni, 2 ore a temperatura ambiente per gli embrioni in fasi successive. ATTENZIONE: PFA è tossico per contatto e un sospetto cancerogeno. Dovrebbe essere manipolato sotto cappa. NOTA: X One laevis nidiata èdi solito fissato in un flaconcino di vetro da 2 ml, ma un grande fiala di vetro può essere utilizzato. </li><li> Lavare gli embrioni nella stessa fiala utilizzando 1x PBS con 0,1% di Tween (PBT), 3 minuti a temperatura ambiente, due volte. NOTA: Se non altrimenti specificato la PBS usato è con o senza calcio e magnesio. </li><li> Disidratare embrioni in 100% di metanolo (MeOH) per almeno 12 ore a RT nello stesso flaconcino. Modificare il MeOH 100% almeno due volte sotto il cofano con una micropipetta plastica. NOTA: Il MeOH assume una colorazione giallastra come lipidi in essa disciolti. Attenzione il MeOH è tossico per inalazione e deve essere manipolato sotto una cappa. </li><li> Reidratare gli embrioni utilizzando la stessa flaconcino attraverso una serie graduata di bagni MeOH: MeOH 75% in PBS MeOH 50% in PBS MeOH 25% in PBS PBS due volte, ogni vasca 5-10 min a RT. Le soluzioni MeOH vengono modificate sotto il cofano con una micropipetta di plastica. </li><li> Usando una pipetta di plastica, trasferire l&#39;embrione deve essere sezionato in una piastra di Petri 60 millimetri riempito al top con PBT. Utilizzando due pinza sottile curarimuovere completamente gli occhi inserendo una pinza sottile tra gli occhi e il tubo neurale, a livello del gambo ottica. Staccare gli occhi dal tubo neurale. Introdurre con attenzione le pinze sotto l&#39;ectoderma sovrastanti il ​​tubo neurale. Con cura, staccare l&#39;ectoderma partendo da dietro la testa e gettarlo. </li><li> Eseguire un ISH doppia o singola con digossigenina-etichettati o sonde fluoresceina come descritto in precedenza 18,19. </li><li> Dopo la ISH trasferire gli embrioni in una nuova 60 mm piatto Petri riempito l&#39;alto con PBT con una pipetta di plastica. </li><li> Utilizzando una pinza sottile staccare con cura il tubo neurale dal resto dell&#39;embrione. In questa fase, il tubo neurale anteriore separa dal tubo posteriore neurale. Staccare con cautela restanti parti del ectoderma sovrastanti il ​​tubo neurale, la notocorda che è vagamente collegato al di sotto del tubo neurale, le vescicole otic e restanti parti del mesoderma. Assicurarsi che il tubo neurale è privo di appendiciin questa fase. NOTA: per evitare di danneggiare il tubo neurale eseguire tutte neurali trasferimento tubo / embrione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta, se necessario, con un taglio punta alla sua estremità. Il diametro della punta fine è adeguata alle dimensioni del tubo neurale. </li><li> Trasferire il tubo neurale sezionato (vedi nota passo 1.9) in una provetta da 1,5 ml piena di glicerolo al 50% diluito in PBS. Attendere i tubi neurali sono caduti al fondo della soluzione di glicerolo, di solito O / N a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di glicerolo al 50% / PBS usando una micropipetta P1000 e aggiungere nello stesso tubo 1,5 ml di una soluzione di 90% glicerolo / PBS usando una micropipetta P1000. Attendere i tubi neurali cadono sul fondo della soluzione 90% glicerolo / PBS, solitamente O / N a 4 ° C. NOTA: per l&#39;archiviazione a lungo termine, di utilizzare il 90% di glicerolo / PBS più antibiotici per prevenire lo sviluppo di batteri. </li><li> Trasferire i tubi neurali su una lastra di vetro o un vetrino da microscopio con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Dissetta i tubi neurali lungo la dorsale e ventrale linee mediane utilizzando aghi di tungsteno. Durante questo passo i tubi neurali sono mantenute in 90% glicerolo / PBS. </li><li> Montare le due lati del tubo neurale in 90% glicerolo / PBS utilizzando anelli di rinforzo coperto con vetrino coprioggetti. </li><li> Fissare i coprioggetti con vernici e tenere a 4 ° C. </li></ol> 2. Cap Animal Espianti induzione utilizzando biglie scambio di anioni resina <ol><li> Trasferire 100 ml di perle di resina a scambio anionico in una provetta da 2 ml con una micropipetta P1000. Lavare le perline almeno cinque volte consecutive con acqua distillata sterile. Lasciare le perline per sedimentare sul fondo del tubo e sostituire l&#39;acqua distillata sterile utilizzando una micropipetta P1000. Non toccare le perline. </li><li> Lasciare le perline ammollo O / N in una provetta 2 ml riempita con acqua distillata sterile con Bovine Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C. </li><li> Due ore prima di raccogliere l&#39;ACS, luogo la metà delle perline in un nuovo 1,5 mltubo con una micropipetta P1000. Sostituire l&#39;acqua distillata sterile con 500 ml di mezzo contenente la molecola da testare per il suo potenziale induttivo, o noti per indurre un destino specifico. Mantenere l&#39;altra metà delle perline, in quanto saranno utilizzati come controllo negativo. </li><li> Incubare le perle a 4 ° C per almeno 2 ore. </li><li> Eseguire tutte le fasi successive allo stereomicroscopio ed eseguire tutti i trasferimenti di CA con una micropipetta. </li><li> Trasferire blastula o embrioni molto precoci gastrula in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA con una pipetta di trasferimento di plastica. NOTA: Gli embrioni in via di sviluppo in C portata blastula e gastrula fasi 12 ° in 20-24 ore. </li><li> Rimuovere membrana vitellina dell&#39;embrione con pinze come descritto in precedenza 20. Fissare l&#39;embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo la membrana, lentamente staccarlo l&#39;embrione. Eseguire questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell&#39;embrione. Non danneggiare il lato animale dell&#39;embrione. </li><li> Isolare piccoli AC come descritto in precedenza 21. Il polo animale è parte pigmentata dell&#39;embrione. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo le cellule ectodermiche. Assicurarsi che il tessuto è di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall&#39;analisi. </li><li> Mettete ogni AC in Terasaki piastre a pozzetti multipli a 0.5x modificate di Barth Saline (MBS) 4. Posizionare il AC nel pozzo con il lato pigmentata dell&#39;animale, a contatto con il fondo rotondo del pozzo. NOTA: pipette di rivestimento con una soluzione di BSA 0,1% impedisce l&#39;adesione di piccoli pezzi di tessuto adesivo alla plastica. </li><li> Mettere una sferetta su ogni tappo con un P20 micropipetta. Se necessario, utilizzare pinze per posizionare accuratamente il tallone al centro del tappo. NOTA: quando imbevuta di un mezzo condizionato, le perle sono colorati in rosa. Selezionare il maggior numero di coperline lored. </li><li> Incubare a temperatura ambiente (da 18 a 22 ° C) per 6 ore senza spostare la piastra Terasaki pozzetti. Il tallone attacca alla corrente alternata in meno di 2 ore. </li><li> Posizionare la piastra pozzetti Terasaki sulla cima di documenti imbevuto di acqua. Coprire la piastra con un contenitore di plastica. NOTA: Questo &#39;camera di umidita&#39; impedisce l&#39;evaporazione prematura dei pozzetti. </li><li> Cultura l&#39;ACS a 0,5x MBS o 3/4 NAM (vedere il punto 4.1) nella camera umida, a 15-20 ° C fino a quando gli embrioni di pari livello hanno raggiunto la fase giusta per testare l&#39;effetto del fattore. </li><li> Fissare la AC per 1 ora in preparati al momento 4% PFA. Disidratare il ACs in 100% MeOH come precedentemente descritto (Passo 1.4). </li></ol> 3. Cap Animal Dissociazione cellulare e riaggregazione Prima Innesto in Xenopus laevis neurula <ol><li> Piatti petri Coat (60 mm) o 12 pozzetti piastre con 3% agarosio in acqua sterile o in PBS senza calcio e magnesio. Aggiungi abbastanza agarosio per coprire la bottom della capsula di Petri e il bene. Pre-riscaldare le piastre a RT (18-22 ° C). Facoltativamente, memorizzate le piastre per due giorni a 4 ° C per evitare la disidratazione. </li><li> Preparare senza calcio salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)), e soluzione salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mm HEPES, 0,1% BSA pH 7.6) 5. NOTA: la soluzione di CaCl 2 non può essere autoclavata. </li><li> Riempire il agarosio rivestite bene verso l&#39;alto con soluzione salina priva di calcio di Holtfreter. </li><li> Preparare blastula o embrioni molto precoci gastrula per isolare i loro ACs come descritto in precedenza (punti 2,5-2,7). </li><li> Isolare almeno 15 o fino a 30, 21 piccolo ACs. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo celle ectodermiche ed è quindi di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall&#39;analisi. NOTA: Il polo animale è il Embryparte pigmentata di o. </li><li> Trasferire l&#39;ACS in un agarosio rivestite ben riempito al top con soluzione fisiologica di Holtfreter senza calcio. Posizionare l&#39;ACS con il loro lato pigmentata rivolto verso l&#39;alto. NOTA: Il processo di dissociazione inizia rapidamente in soluzione salina di Holtfreter senza calcio. </li><li> Attendere qualche minuto per le cellule per iniziare dissociare. Osservare questo attraverso disaggregazione dei tessuti. Utilizzando una pinza sottile, separare lo strato pigmentato dal resto della AC e gettarli con un P20 micropipetta. Completa processo di dissociazione cella indica la separazione delle cellule tra loro. NOTA: Uno o due strati pigmentati possono essere lasciati alla espianto ri-aggregati per aiutare la visualizzazione durante l&#39;innesto. </li><li> Centrare le cellule utilizzando movimenti circolari della piastra. Usando una micropipetta p1000 rimuovere accuratamente quanto mezzo possibile. Fare attenzione a non toccare le cellule. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con calcio al pozzo. Trasferire l&#39;ACS dissociatein una provetta da 1,5 ml. NOTA: 2 ml tubi non possono essere utilizzati a causa della loro fondo rotondo. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione, 5 min ad una velocità massima di 2.000 giri al minuto per una centrifuga da banco (500 xg). Rimuovere con attenzione il surnatante con una micropipetta P1000. </li><li> Aggiungi alle cellule dissociate 20 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con il calcio (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6) 5. </li><li> Mantenere il dissociato ACs, da 3 a 6 ore a temperatura ambiente (18-22 ° C). NOTA: È tempo necessario per le cellule di ri-aggregazione. La riaggregazione è visibile come le cellule formano una pallina sul fondo della provetta. </li><li> Staccare con cautela l&#39;espianto dal fondo della provetta con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,5x MBS o da 1 ml di 3/4 NAM (vedi punto 4.1). Trasferire l&#39;espianto in un piatto non-rivestita con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Fase espianti che utilizzano i loro fratelli di controllo. Per uso a lungo termine cultura antibiotici: kanamycin (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml). </li></ol> 4. Accrescimento di animali Caps Espianti nella placca neurale di X. laevis Embrione <ol><li> Preparare 3/4 NAM (110 mM NaCl, KCl 2 mm, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 NaHCO mm 3, 0.2x PBS, 50 mg / ml di gentamicina). Non tenere per più di 1 settimana per la dissezione e conservare a 4 ° C. NAM più vecchio può essere utilizzato per la preparazione di piatti dissezione agarosio rivestite (sotto). </li><li> Piatti cappotto di Petri (60 mm), con il 3% agarosio in 3/4 NAM in cui piccoli fori sono stati realizzati utilizzando uno stampo in silicone, o la copertura di una racchetta da ping-pong. NOTA: L&#39;agarosio copre il fondo della capsula di Petri. Lasciare un po &#39;di spazio in modo che la capsula di Petri da riempire con 3/4 NAM. In alternativa, fare piatti dissezione con i non-essiccazione modellazione creta. All&#39;interno l&#39;argilla, spremere gli embrioni leggermente durante la procedura di dissezione. Scavare piccoli fori nellaagarosio usando pinze arrotondate Questo &#39;piatto dissezione&#39; aiuta a tenere gli embrioni durante la procedura di dissezione. </li><li> Raccogliere strumenti di dissezione: pipette di plastica, un &#39;coltello sopracciglio&#39; (realizzato con i capelli sopracciglio inclusi in paraffina sulla punta di una pipetta Pasteur di vetro) 22, due pinze dissezione fine, P1000 micropipetta e suggerimenti, un stereosmicroscope con ingrandimento 8-40X, una fonte di luce brillante con guide in fibra ottica. Tenere tutti gli strumenti di dissezione pulito; dopo ogni esperimento, sciacquare due volte con acqua distillata, una volta con 100% di etanolo e lasciare asciugare. Conservare lontano da polvere e, se necessario, gli strumenti di dissezione in autoclave metallo. </li><li> Lasciate che la ri-aggregato AC (protocollo 3), e loro fratelli dissociato e X. embrioni laevis sviluppano fino a raggiungere stadio 13 (neurula) secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17. Per il trapianto all&#39;interno della fase piastra neurale 13 per mettere in scena 15 embrioni vengono utilizzati. </li><li> Effettuare tuttofasi successive allo stereomicroscopio. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA. Rimuovere membrana vitellina dell&#39;embrione come descritto in precedenza 20. Fissare l&#39;embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo saldamente la membrana, lentamente staccarlo l&#39;embrione. NOTA: Effettuare questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell&#39;embrione. Non danneggiare gli embrioni piastra neurale. Se gli embrioni sono stati danneggiati durante la rimozione fase di membrana vitellina, di trasferire gli embrioni in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 3/4 NAM con un trasferimento pipetta di plastica e attendere 15 minuti, un tempo sufficiente per il processo di guarigione a verificarsi. </li><li> Compila il piatto dissezione verso l&#39;alto con fresco 3/4 NAM. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni senza la loro membrana vitellina nel piatto dissezione. Mettere gli embrioni lato dorsale fino ini pozzi. Durante il processo di trasferimento non consentono l&#39;embrione di entrare in contatto con l&#39;interfaccia aria-liquido dal X. laevis sono lisati dalla tensione superficiale. </li><li> Trasferire il espianto AC da innestare nel piatto dissezione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta P1000. Una volta che la pipetta è all&#39;interno del liquido, consentire gli espianti di affondare lentamente per gravità, o spingere molto delicatamente. </li><li> Mantenere gli embrioni con pinza arrotondati. Con il coltello sopracciglio fare un&#39;incisione nella piastra neurale in cui si intende innestare pezzo del vostro espianto. NOTA: Nella fase 14 la piegatura anteriore della piastra neurale può essere utilizzato come punto di riferimento, segna il territorio diencefalo (Figura 4). </li><li> Tagliare un piccolo pezzo di neuroepitelio, con pinze arrotondate e un coltello sopracciglio. Tagliare un piccolo pezzo di espianto con il coltello sopracciglio. NOTA: Il pezzo di espianto dovrebbe essere circa la stessa dimensione e forma come la zona ablato neuroepitelio. </li&gt; <li> Posizionare il pezzo di espianto nell&#39;incisione neuroepitelio utilizzando il coltello sopracciglio e una pinza sottile. Assicurarsi che l&#39;espianto si attacca rapidamente per l&#39;embrione. </li><li> In alternativa, inserire un pezzo di vetro coprioggetto sul embrione innestato di mantenere l&#39;innesto in posizione. Per fare questo, tagliare un bel vetrino di vetro in pezzi molto piccoli con pinze grossolani. Assicurarsi che la dimensione è di circa 1,5 mm 2. Immergere i pezzi in una capsula di Petri contenente 3/4 NAM o PBS con pinze. Scegliere un pezzo di vetro più grande della embrione per evitare di danneggiarlo. L&#39;embrione sarà un po &#39;appiattito. </li><li> Attendere almeno 30 minuti senza muoversi, o spostare solo il piatto dissezione delicatamente. Lasciate che l&#39;embrione recuperare per 30 minuti a 2 ore e rimuovere delicatamente il vetrino, se necessario. Pipetta con attenzione gli embrioni innestati in un piatto pulito pieno di 3/4 NAM, utilizzando la pipetta plastica. NOTA: Innestata embrioni tendono a sviluppare batteri o funghi contaminazione. A lungo termine culture utilizzare antibiotici: kanamicina (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml). </li></ol>

<ol><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IIB%2C+Pattern+formation+in+the+developing+central+nervous+system+%28CNS%29+of+the+amphibians+and+birds+%28English%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Koninklijke+Nederlandse+Akademie+van+Wetenschappen%22%5BJournal%5D)">IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English).</a> Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+induction+process%3B+its+morphogenetic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The neural induction process; its morphogenetic aspects.</a> Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).</li>
<li>Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Neural induction.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Hoppler, S., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoppler%2C+S+%22Xenopus+protocols+%3A+post-genomic+approaches%22">Xenopus protocols : post-genomic approaches</a>. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).</li>
<li>Franklin Hughes, W., La Velle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+early+tectal+lesions+on+development+in+the+retinal+gonglion+cell+layer+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos.</a> J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beads+on+the+run%3A+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+barH-like+homeobox-2+gene+barhl2+acts+downstream+of+orthodentricle-2+and+together+with+iroquois-3+in+establishment+of+the+caudal+forebrain+signaling+center+induced+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog.</a> Dev Biol. 396, 107-120 (2014).</li>
<li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71, 731-739 (1992).</li>
<li>Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+during+convergent+extension+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling during convergent extension in Xenopus.</a> Curr Biol. 11, 652-661 (2001).</li>
<li>Kiecker, C., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphogen+gradient+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+regulates+anteroposterior+neural+patterning+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22DEVELOPMENT%22%5BJournal%5D)">A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus.</a> DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).</li>
<li>Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epidermis+and+inhibition+of+neural+fate+by+Bmp-4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4.</a> Nature. 376, 331-333 (1995).</li>
<li>Afouda, B. A., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+explants+as+an+experimental+model+system+for+studying+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cardiovascular+medicine%22%5BJournal%5D)">Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development.</a> Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).</li>
<li>Afouda, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-like+embryonic+explants+to+study+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development.</a> Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).</li>
<li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent%2C+migratory%2C+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Early+Steps+in+the+Development+of+the+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Review: Early Steps in the Development of the Forebrain.</a> Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+neural+plate%3A+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li>
<li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+early+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+vertebrate+forebrain%3A+the+prosomeric+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li>
<li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li>
<li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regionalization+of+the+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li>
<li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Building+a+bridal+chamber%3A+development+of+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li>
<li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xotch%2C+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li>
<li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+signals%2C+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+old+problem%2C+new+findings%2C+yet+more+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+research%3A+metamorphosed+by+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li>
<li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li>
<li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems%3A+a+single+origin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?</a> Evodevo. 4, 27(2013).</li>
<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy%3A+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sviluppo neurale è orchestrata da una complessa interazione tra programmi di sviluppo cellulari e segnali dai tessuti circostanti (Recensito a 3,31,32). Qui si descrive un set di protocolli che possono essere utilizzati in X. laevis embrioni per esplorare fattori estrinseci ed intrinseci coinvolti nella determinazione destino neurale e la morfogenesi neuronale in vitro e in vivo. Questi protocolli possono essere usati come tali X. embrioni tropicalis, tutt...

Il sistema nervoso vertebrato emerge dalla piastra neurale come uno strato omogeneo di cellule neuroepiteliali. Comprendere come sono indotte programmi di sviluppo, codificati, e stabilito durante la regionalizzazione della piastra neurale è, allo stato attuale, un obiettivo importante nella biologia dello sviluppo. Rispetto ad altri sistemi, il sperimentalmente suscettibili di Xenopus embrioni è un modello di riferimento per analizzare i primi passi di sviluppo neurale 1,2. E &#39;facile ottenere un gran numero di embrioni, e sviluppo esterno dà accesso ai primi passi della neurulazione 3. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) lo sviluppo embrionale. Micro-iniezione di mRNA o Morpholinos (MO), tra MO inducibile, insieme agli strumenti biochimiche e farmacologiche, permette di guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (OL) e determinata alterazione delle vie di segnalazione 4,5 controllato. Il blastocoel tetto ectoderma, situato attorno al polo animale di un blastula, o gastrula embrione molto precoce, e denominato &#39;Cap Animal&#39; (AC), è una fonte di cellule pluripotenti che può essere programmato da manipolazione genica prima espianti preparazione. In questo manoscritto sono protocolli dettagliati per usare X. espianti laevis AC per testare in vitro e in vivo dei meccanismi molecolari e dei processi cellulari di sviluppo neurale sottostante. Una tecnica è presentata, permettendo l&#39;osservazione multa di modelli di espressione genica in un tubo neurale girino Xenopus, un passo preliminare per l&#39;identificazione di segnali determinazione destino. Considerando che l&#39;osservazione di tessuti piatto montato è comunemente usato nello studio di embrioni di pollo 6, non è stato correttamente descritto in Xenopus. La manipolazione dell&#39;espressione genica mediante iniezione di mRNA sintetico o MO nei blastomeri di 2 o 4 embrioni stadio cella permette la programmazione di ACespianti 4. Per esempio l&#39;inibizione della proteina morfogenetica (BMP) percorso dalla espressione del movimento anti-BMP fattore Noggin, dà un&#39;identità neurale per celle AC 3. Il protocollo è dettagliata per eseguire esposizione locale e comandato a tempo di espianti AC ai segnali estrinseci tramite contatto diretto con una perlina di resina scambiatrice di anioni. Finalmente una tecnica è descritta per testare le caratteristiche di sviluppo delle progenitori neurali in vivo per il trapianto di espianti miste preparate da cellule distinte programmato dissociate e ri-associati. L&#39;embrione rana è un potente modello per lo studio precoce sviluppo neurale dei vertebrati. Combinando la manipolazione dell&#39;espressione genica di espianto colture in vitro fornisce importanti informazioni per lo studio di neuroepitelio regionalizzazione, la proliferazione e morfogenesi 7-12. La programmazione di espianti AC consentito lo sviluppo di un cuore funzionale ex vivo 13,14. L&#39;usodi espianto innesto 15 ha portato all&#39;individuazione dello switch trascrizionale minimo indurre il programma di differenziazione cresta neurale 16. Il limitans zona per intrathalamica (ZLI) è un centro di segnalazione che secerne sonic hedgehog (Shh) per controllare la crescita e la regionalizzazione del prosencefalo caudale. Quando continuamente esposto a Shh, le cellule neuroepiteliali coexpressing il fattore geni tre trascrizione - Barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) e Iroquois-3 (irx3) - acquistano due caratteristiche del vano ZLI: la competenza a esprimere shh, e la capacità di separare dalle cellule anteriore piastra neurale. Come un sistema modello, l&#39;induzione di un destino ZLI in cellule neuroepiteliali verrà presentato 8. Questi protocolli mirano a fornire semplici, a basso costo, e strumenti efficienti per i biologi dello sviluppo e altri ricercatori per esplorare il mec fondamentalehanisms di comportamenti chiave delle cellule neurali. Tali protocolli sono molto versatili e permettono la ricerca di una vasta gamma di segnali neurali determinazione estrinseci ed intrinseci. Esso consente a lungo termine in analisi in vivo di impegno lignaggio neurale, interazioni induttive e comportamenti delle cellule.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide</td><td>VWR</td><td> 20909.290</td><td>Perle tossiche</td></tr><tr><td>di resina a scambio anionico</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>Per la coltura di cappelle animalepH 7,6</td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp; per la preparazione delle perle</td></tr></tbody></table>

cellule staminali simil-<em&gt; xenopus</em&gt; embrionali espianti di studiare caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; in vitro</em&gt; e<em&gt; in vivo</em

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Comprendere i programmi genetici alla base dello sviluppo neurale è un obiettivo importante della biologia dello sviluppo e delle cellule staminali. Nella blastula anfibia, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti. Queste cellule possono essere isolate e programmate per generare vari tessuti attraverso la manipolazione dell'espressione genica o l'induzione da parte dei morfogeni. In questo manoscritto vengono descritti i protocolli per l'uso di espianti di tetti di blastocele di Xenopus laevis come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce. Questi protocolli consentono lo studio dell'acquisizione del destino, dei comportamenti di migrazione cellulare e delle proprietà autonome e non autonome delle cellule. Gli espianti di blastocele possono essere coltivati in un terreno definito privo di siero e innestati in embrioni ospiti. Questo trapianto in un embrione consente di studiare l'impegno a lungo termine del lignaggio, le proprietà induttive e il comportamento delle cellule trapiantate in vivo. Questi saggi possono essere sfruttati per studiare i meccanismi molecolari, i processi cellulari e le reti di regolazione genica alla base dello sviluppo neurale. Nel contesto della medicina rigenerativa, questi saggi forniscono un mezzo per generare tipi di cellule di derivazione neurale in vitro che potrebbero essere utilizzati nello screening dei farmaci.

Sulla base di considerazioni morfologiche in specie diverse, manipolazioni embriologici, e il pattern di espressione di geni regolatori, un modello concettuale che sostiene la piastra neurale è diviso in segmenti trasversali e longitudinali che definiscono una griglia sviluppo generare campi histogenic distinte. Nel placca neurale, la primordi del prosencefalo, mesencefalo, rombencefalo e del midollo spinale sono tutti già stabilito lungo l&#39;asse antero-posteriore (AP) durante la gast...

Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare espianti del tetto del blastocoele o dell'area animale (animal cap) di x laevis per studiare i meccanismi molecolari e i processi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso in vitro e in vivo. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia dello sviluppo e della biologia delle cellule staminali riguardo all'acquisizione del destino cellulare, alla migrazione cellulare e alle proprietà cellulo-autonome e non autonome delle cellule neurali. Le tecniche presentate offrono strumenti semplici, economici, versatili ed efficienti per esplorare i meccanismi fondamentali che regolano il comportamento delle principali cellule neurali.Questi saggi permettono il test dei fattori determinanti del destino neurale per la riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte e la generazione matura di cellule derivate neurali per ulteriori analisi di screening. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché le tecniche richiedono abilità manuale. Ebbi per la prima volta l'idea di questi metodi quando stavo pensando di analizzare il comportamento di segregazione cellulare.Per montare in piano il tubo neurale anteriore di Xenopus laevis, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire un embrione fissato, disidratato e reidratato in una capsula di Petri da 60 millimetri riempita fino all'orlo con PBT. Successivamente, inserire una coppia di pinzette fini tra gli occhi e il tubo neurale al livello del peduncolo ottico e staccare gli occhi. Quindi, introdurre con attenzione le pinzette al di sotto dell'ectoderma sovrastante il tubo neurale dietro la testa e rimuovere con cura l'ectoderma.Dopo aver eseguito l'ibridazione NC2 con etichettatura appropriata, trasferire l'embrione in una nuova piastra di Petri da 60 millilitri contenente PBT ed utilizzare pinzette fini per isolare grossolanamente il tubo neurale anteriore dall'embrione. Successivamente, rimuovere con attenzione la notocorda, che è debolmente adesa al di sotto del tubo neurale. Se necessario, rimuovere anche le vescicole otiche e le parti rimanenti del mesoderma.Dopo aver reciso tutti gli appendici del tubo neurale, separare il tubo neurale anteriore dall'embrione. Successivamente, trasferire il tubo neurale isolato in una provetta conica da 1,5 millilitri contenente una soluzione al 50% di glicerolo in PBS, per un trattamento notturno a quattro gradi Celsius. Dopo un secondo trattamento notturno in glicerolo al 90%, trasferire il tubo neurale su un vetrino in una piccola quantità di glicerolo e utilizzare aghi di tungsteno per dissezionare i tubi neurali lungo le linee medie dorsale e ventrale.Quindi utilizzare anelli di rinforzo ricoperti con un vetrino per montare i due lati del tubo neurale in glicerolo al 90% e PBS. Per preparare le perline per l'induzione di espianti di capsula animale, utilizzare una micropipetta P200 per dividere metà di un aliquota di perline di resina trattate con BSA in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, sostituire l'acqua distillata sterile nel nuovo tubo con 200 microlitri di mezzo contenente la molecola sperimentale di interesse per due ore a quattro gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, trasferire gli embrioni allo stadio di blastula o di gastrula molto precoce in PBS con calcio e magnesio, integrato con BSA allo 0,2%. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, afferrare la membrana vitellina con il lato di una coppia di pinzette e utilizzare una seconda coppia di pinzette per rimuovere lentamente la membrana dal lato vegetativo dell'embrione, avendo cura di non danneggiare il lato animale. Quindi, utilizzando pinzette fini, asportare un piccolo quadrato dal polo animale di ciascun embrione.Utilizzando una punta di pipetta rivestita con BSA, trasferire le calotte in singole pozzette di una piastra multiwell Terasaki contenente soluzione salina di Barth modificata 0,5X, posizionando il lato animale pigmentato a contatto con il fondo arrotondato della pozzetta. Con una micropipetta P20, selezionare le perle di colore rosa più scuro dal tubo del trattamento e posizionarne una su ciascuna calotta, utilizzando pinzette per centrare le perle sulle calotte. Una volta posizionata l'ultima perla, posizionare la piastra su carta inumidita con acqua e coprirla con un contenitore di plastica prima dell'incubazione.Per preparare espianti di calotta animale dissociati e riaggregati, isolare da 15 a 30 calotte animali come appena illustrato. Utilizzare pinzette fini per asportare un piccolo quadrato di tessuto dai poli animali. Trasferire le calotte animali in una pozzetta rivestita di agarosio riempita con soluzione salina di Holtfreter priva di calcio, con le superfici pigmentate rivolte verso l'alto.Dopo alcuni minuti, si dovrebbe osservare la disgregazione. Utilizzare pinzette fini per separare i livelli pigmentati dal resto del tessuto. Quindi, utilizzare una micropipetta P20 per eliminare il pigmento.Quando la maggior parte dei livelli pigmentati è stata rimossa e le cellule sono completamente dissociate, ruotare delicatamente la piastra per centrare le cellule ed utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo, avendo cura di non toccare le cellule. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione salina di Holtfreter con calcio nel pozzetto. Trasferire i blastomeri animali dissociati in una provetta da 1,5 millilitro.Dopo aver centrifugato le cellule, utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in 20 microlitri di soluzione salina di Holtfreter con calcio. Lasciare aggregare nuovamente le cellule per tre-sei ore a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere lentamente un millilitro di 3/4 NAM per staccare delicatamente gli espianti dal fondo del tubo ed utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per distribuire gli espianti in piastre singole non rivestite.Per trapiantare espianti di cappuccio animale su placche neurali di xenopus laevis, rivestire prima delle capsule di Petri da 60 millimetri con agarosio al 3% e 3/4 NAM, nei quali sono stati praticati dei piccoli fori. Successivamente, trasferire gli embrioni allo stadio di neurula precoce in PBS con calcio e magnesio, integrato con BSA allo 0,2%, per la rimozione della membrana vitellina. Poi riempire la capsula per dissezione rivestita con agarosio con 3/4 NAM fresco e trasferire gli embrioni nella capsula per dissezione con il lato dorsale rivolto verso l'alto.Ora, trasferire un espianto di calotta animale reaggregata nella piastra per dissezione, permettendo all'espianto di affondare lentamente nel piatto per gravità una volta che la punta della pipetta ha attraversato la superficie del NAM. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette arrotondate per tenere fermo l'embrione mentre si pratica un'incisione nella placca neurale per l'espianto, usando un ago di tungsteno. Asportare una piccola porzione dell'espianto di calotta animale reaggregata utilizzando pinzette arrotondate e un bisturi per sopracciglia.Utilizzare il frammento di tessuto per dimensionare un pezzo di espianto destinato al trapianto. Questa figura mostra i tubi neurali anteriori di X laevis e X tropicalis montati in piano come appena illustrato negli stadi 30, 32 e 35 dopo ibridazione doppia in toto con NC2. Come osservato in queste immagini, l'espressione di sonic hedgehog di xenopus viene rilevata nelle cellule a contatto con perline immerse in un mezzo condizionato integrato con l'estremità finale del gene sonic hedgehog, ma non nelle cellule a contatto con perline trattate con mezzo di controllo.Dopo la dissociazione e la reaggregazione appena descritte, questi espianti contenenti cellule del cappuccio animale anteriorizzate sono stati mescolati con cellule del cappuccio animale anteriorizzate che esprimevano Otx2. Come osservato, queste cellule che esprimevano Otx2 non si sono separate dalle cellule che non esprimevano Otx2. Entrambi i tipi di cellule si sono mescolati liberamente in tutto l'espianto.Al contrario, negli espianti in cui le cellule esprimenti Otx2 erano mischiate con cellule BAR HL-2, Otx2 e IRX3 esprimenti, le cellule esprimenti più geni formavano aggregati coesivi che non si diffondevano uniformemente all'interno dell'espianto riassemblato. Quando innestati nella placca neurale anteriore di embrioni di x laevis come appena dimostrato, espianti misti composti da cellule che coesprimono BAR HL-2, Otx2 e IRX3 mescolati con cellule esprimenti la porzione N-terminale di sonic hedgehog mostravano espressione endogena di sonic hedgehog e si separavano dalle cellule epiteliali neurali anteriori. Diversamente, quando espianti misti composti da cellule esprimenti Otx2 e la porzione N-terminale di sonic hedgehog venivano innestati nella placca neurale di x laevis, le cellule innestate non esprimevano né sonic hedgehog né si separavano dai loro vicini.Una volta acquisita padronanza, l'innesto dell'espianto di cappuccio animale su piastre neurali embrionali può essere eseguito in due o tre ore, a seconda del numero di embrioni innestati. Si tratta di una tecnica molto robusta e altamente gratificante. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale prestare estrema attenzione alla contaminazione batterica e fungina.Dopo le procedure di innesto, è possibile eseguire altri metodi come l'ibridazione in situ su preparati interi per seguire il destino e il comportamento delle cellule innestate. I programmi di sviluppo alla base dell'organogenesi del tubo neurale sono ampiamente conservati, specialmente nei vertebrati. Pertanto, le informazioni ottenute negli anfibi hanno approfondito la nostra comprensione dei processi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo dei vertebrati.

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che...

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Questo protocollo descrive come sezionare premigratory cresta neurale cranica (NC) da Xenopus laevis neurulas. Tali espianti possono essere placcati in fibronectina e coltivate in vitro, o innestate di nuovo in embrioni di accoglienza. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi di NC epitelio a mesenchima transizione, migrazione e differenziazione.

Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

L'embrione di Xenopus laevis continua ad essere eccezionalmente utile nello studio dello sviluppo precoce grazie alle sue grandi dimensioni e alla facilità di manipolazione.   Viene fornito un protocollo semplificato per l'ibridazione in situ dell'intera montatura che può essere utilizzato nell'identificazione di organi specifici in questo sistema modello.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Questo articolo presenta un metodo conveniente e rapido per la visualizzazione di diverse popolazioni cellulari neuronali nel sistema nervoso centrale di embrioni di Xenopus mediante immunofluorescenza su sezioni.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Gli espianti di blastoderma Zebrafish sono generati isolando cellule embrionali da centri di segnalazione endogeni all'interno dell'embrione precoce, producendo cluster cellulari relativamente ingenui facilmente manipolati e coltivati ex vivo. Questo articolo fornisce istruzioni per effettuare tali espianti e dimostra la loro utilità interrogando i ruoli per la segnalazione nodale durante la gastrulazione.

Generazione di espianti di blastoderma naïve da embrioni di zebrafish

Scopri i protocolli per esplanti del tetto del blastocele di Xenopus laevis per studiare lo sviluppo neurale precoce in vitro e in vivo. Questi metodi versatili aiutano a comprendere i meccanismi molecolari della biologia dello sviluppo.

Cellule staminali simil- Xenopus Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale In Vitro E In Vivo (Video) | JoVE Journal

Cellule staminali simil-

Esplora altri video