Quantificare Pesce Nuoto Comportamento in risposta all'esposizione acuta acquosa di rame utilizzando Computer Assisted Video e Digital Image Analysis

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come quantificare le risposte comportamentali nello storione bianco all'esposizione sub-letale al rame acquoso. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecotossicologia, come ad esempio come l'esposizione sub-letale ai contaminanti influenzi il comportamento di nuoto dei pesci. Questo metodo può fornire informazioni importanti per la conservazione dello storione bianco.

Può essere facilmente applicato anche ad altre specie ittiche, anfibi e invertebrati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la risposta è altamente sensibile, fornisce un'indicazione precoce di tossicità ed è rilevante per la sopravvivenza dell'organismo. Inizialmente questo metodo può essere impegnativo se l'individuo non ha familiarità con le misurazioni comportamentali.

A dimostrare il protocollo sarà la mia co-autrice Holly Puglis. Per prima cosa, preparare due litri di reagente acquoso di rame due solfato pentaidrato. Quindi, equilibrare il sistema di diluizione e i serbatoi di esposizione.

Posizionare il tubo di aspirazione dal distributore automatico di siringhe nel pallone della soluzione madre. Quindi, impostare il volume di picco della pompa automatizzata su un millilitro e accendere il diluitore. Il sistema effettua una serie di diluizioni del 50% di cinque concentrazioni e un controllo.

Attraverso uno splitter a quattro vie, queste soluzioni vengono erogate alle quattro camere di esposizione replicate. Quindi, accendere la pompa del refrigeratore impostata per mantenere il bagno d'acqua a 15 gradi Celsius. Ora, utilizzando il timer automatico sul dilatatore, impostalo in modo che si ciclizzi ogni 30 minuti.

Il livello dell'acqua nei serbatoi è mantenuto da uno scarico a tubo verticale. Preparare le camere di esposizione inserendo un foro di quattro centimetri sul lato e coprendo il foro con una rete in acciaio inossidabile da 30 micron. Assicurati di selezionare camere di esposizione che contengano almeno un litro d'acqua per 10 grammi di pesce.

Ad esempio, uno storione bianco di 89 giorni pesa circa 373 milligrammi e può quindi essere testato in una camera quadrata di 28 centimetri per 13 virgola cinque centimetri per 25 centimetri. All'inizio, a metà e alla fine di un esperimento, raccogliere sottocampioni di soluzione di prova da 24 millilitri per l'analisi chimica. Utilizzare cannucce attaccate a siringhe di plastica.

Sostituire la cannuccia con un filtro in polietersulfone da quattro cinque micron a punto zero ed erogare quattro millilitri di acqua di prova attraverso il filtro. Smaltire quest'acqua. Quindi, filtrare i restanti 20 millilitri di acqua in una bottiglia di polietilene pulita con acido.

Acidificare il campione con acido nitrico 16 molare all'1% in volume in volume. Questi campioni possono quindi essere conservati per un massimo di tre mesi. Una volta confermate le esposizioni di prova, immagazzinare tre storioni in ciascuna camera di prova replicata per circa 172 milligrammi di pesce per litro di camera.

Raccogli lo storione usando una rete non abrasiva e trasferiscilo in un piccolo secchio. In totale, sono necessari 144 pesci per raccogliere dati da sei soluzioni di test. Durante l'esposizione di 96 ore, non dare da mangiare ai pesci.

Devono essere effettuate osservazioni quotidiane coerenti per valutare la mortalità e il comportamento anormale. La mattina è il momento migliore della giornata per farlo e, idealmente, l'osservatore è cieco alle condizioni di prova. La perdita di equilibrio è definita come l'incapacità dei pesci di mantenere una posizione eretta all'interno della colonna d'acqua.

L'immobilità è definita come l'incapacità dei pesci di muoversi o nuotare a meno che non siano pungolati. Registrare anche eventuali altre anomalie, come letargia, iperattività, aumento o diminuzione della respirazione, cambiamenti di colore, tremori, spasmi, addome gonfio, posizione nella colonna d'acqua e qualsiasi altro modello di nuoto insolito. I pesci morti devono sempre essere rimossi immediatamente.

Ogni giorno, misura anche i livelli di ossigeno disciolto con un misuratore portatile da due campioni d'acqua. Al termine delle 96 ore di esposizione, realizzare video per l'analisi del comportamento di nuoto. Posiziona l'arena di prova all'interno di un serbatoio di esposizione.

Assicurati di selezionare un'arena di prova abbastanza grande da consentire ai pesci di nuotare liberamente. Direttamente sopra ogni arena di prova, installa una videocamera portatile su un treppiede. Ora, tra i pesci trattati, seleziona casualmente fino a tre sopravvissuti.

Trasferisci tre nell'arena di prova usando una piccola rete a maglie. Lasciare che i pesci si acclimatino all'arena per circa 30 minuti. Mentre il pesce si acclimata, metti a fuoco l'immagine, riduci al minimo le distorsioni dell'abbagliamento dovute all'acqua in movimento e massimizza il contrasto del pesce sullo sfondo, regolando la vista in modo che il pesce non sia oscurato.

Una volta che il pesce si è acclimatato, avvia la registrazione e raccogli due minuti di dati video. Dopo aver girato il video, sopprimere e smaltire il pesce. Dopo aver convertito i file video nel formato necessario per il software di analisi digitale, aprire il software di tracciamento e selezionare Nuovo esperimento predefinito nell'opzione Crea un nuovo esperimento nella schermata principale.

Compila le istruzioni e premi OK. Quindi, vai all'opzione delle impostazioni dell'esperimento in configurazione e scegli dal file video in sorgente video. Imposta il numero di arene su uno.

Imposta il numero di soggetti per arena su tre. Quindi, selezionare il rilevamento del punto centrale in Funzioni tracciate e selezionare le unità desiderate. Ora, in Configurazione, seleziona l'opzione dell'elenco di prova e fai clic su Aggiungi video nella parte superiore dello schermo.

Scegli l'ordine alfabetico dalla finestra di dialogo. Fare clic su Sfoglia. Passare alla cartella in cui si trovano i video, evidenziare i file pertinenti e fare clic su Apri.

Ora che i file video sono selezionati, procedere con la definizione dell'ambito dell'esperimento nel software. Innanzitutto, fai clic su aggiungi variabile nella parte superiore dello schermo e inserisci la concentrazione nella casella dell'etichetta. Inserire la concentrazione di rame in microgrammi per litro nella casella della descrizione.

Quindi, scegli numerico dall'elenco a discesa per tipo. Fare clic sulla casella dei valori predefiniti e scegliere l'opzione Definisci valori individuali dalla finestra di dialogo. Inserisci le concentrazioni utilizzate per l'esperimento, facendo clic su Aggiungi tra ogni aggiunta di numeri.

Quindi, deseleziona l'opzione Consenti altri valori e fai clic su OK. Scegliere Versione di prova dal menu a discesa nella casella di definizione. Inserire la concentrazione appropriata per ogni prova nelle apposite caselle.

Fai clic su Aggiungi variabile nella parte superiore dello schermo. Immettere replica nella casella dell'etichetta. Immettere il numero di replica nella casella della descrizione.

Scegliere numerico dall'elenco a discesa per tipo. Quindi, fai clic sulla casella dei valori predefiniti e scegli l'opzione Definisci valori individuali dalla finestra di dialogo. Immettere uno, due, tre e quattro e deselezionare l'opzione Consenti altri valori.

Quindi, fai clic su OK. Ora, scegli l'opzione di prova dal menu a discesa nella casella di definizione. Immettere il numero di replica appropriato per ogni versione di prova.

Il prossimo compito è quello di allestire gli spazi dell'arena. Inizia scegliendo le impostazioni dell'arena nella scheda di configurazione e nomina la prima impostazione come quella di prova. Dalla finestra di dialogo, seleziona l'opzione Afferra immagine di sfondo e fai clic su Sfoglia.

Individua il file video per la prima versione di prova e fai clic su Apri. Dopo che il video viene visualizzato, fai clic su Afferra nella finestra di dialogo Afferra immagine di sfondo. Quindi, fai clic sull'icona del cerchio bianco nella parte superiore dello schermo nelle impostazioni dell'arena e manipola il cerchio che appare per circondare l'area di nuoto.

Quindi, fai clic sull'icona della scala di calibrazione nelle impostazioni dell'arena. Usa un movimento di clic-tieni-trascinamento per selezionare lo spazio dell'arena. Ora, sotto la casella della distanza del mondo reale nella distanza di calibrazione, inserisci 10 virgola cinque.

Quindi, fai clic su OK. Se necessario, regolare la linea di calibrazione in modo che si estenda per l'intero diametro dell'arena circolare. Fai clic sull'opzione Convalida impostazioni arena nella casella delle impostazioni dell'arena e risolvi eventuali problemi nelle impostazioni che non sono stati convalidati.

Ora, ripeti questo processo fino a quando tutte le arene sono definite per ogni prova. Quindi, impostare i parametri di rilevamento dei pesci. Prima di tutto, scegli le impostazioni di rilevamento sotto l'opzione di configurazione dalla barra degli strumenti di esplorazione dell'esperimento a sinistra dello schermo.

Quindi, scegli la sottrazione dinamica dal menu a discesa sotto il metodo nella finestra di dialogo delle impostazioni di rilevamento uno. Inoltre, scegli un colore di riempimento per ogni soggetto sotto l'identificazione del soggetto nella finestra di dialogo. Quindi, scegli seleziona video e individua il video per la versione di prova.

Nella finestra di dialogo delle impostazioni di rilevamento uno, compila la casella della frequenza di campionamento sotto il video con cinque virgola nove nove quattro uno. Nella stessa casella, fare clic su impostazioni per l'opzione immagine di riferimento in Rilevamento. Quindi, fai clic sull'opzione Inizia a imparare C nella finestra di dialogo dell'immagine di riferimento.

Quando l'immagine nella finestra di dialogo dell'immagine di riferimento viene visualizzata senza animali, fare clic su Usa immagine di riferimento dinamica nelle impostazioni di acquisizione all'interno della finestra di dialogo e chiudere questa finestra di dialogo. Ora, scegli più scuro dal menu a discesa per il soggetto è sotto rilevamento nella finestra di dialogo delle impostazioni di rilevamento. Per il contrasto scuro durante il rilevamento, impostare il numero più piccolo su 33 e il numero più grande su 153.

Quindi, fai clic su Salva modifiche in basso a destra. Ora, conferma che quel software sta tracciando con successo gli animali, al contrario di ombre o detriti. Fare clic sul pulsante di riproduzione nella finestra di dialogo di controllo della riproduzione e regolare i numeri per il contrasto scuro in base alle esigenze.

Assicurati di salvare tutte le regolazioni apportate. Il software è ora impostato per raccogliere i dati dal video, quindi il compito successivo è quello di tracciare i pesci in ogni prova. Innanzitutto, scegli l'acquisizione sotto l'opzione di configurazione dalla barra degli strumenti di Esplora esperimenti a sinistra dello schermo.

Quindi, fai clic su Monitora la prossima prova pianificata nella finestra di dialogo delle impostazioni di acquisizione e verifica che le impostazioni corrette di prova, video e arena siano tutte visualizzate nelle impostazioni nella finestra di dialogo delle impostazioni di acquisizione. Quindi, selezionare l'opzione di rilevamento determina la velocità nella finestra di dialogo di controllo dell'acquisizione. Fare clic sul pulsante con il cerchio verde racchiuso in un quadrato bianco per iniziare il processo di acquisizione.

Ripetere questo processo fino a quando tutte le prove non sono state tracciate. Ora, gli oggetti tracciati che sono i pesci possono essere analizzati. Innanzitutto, fai clic su Profili dati sotto l'opzione di analisi dalla barra degli strumenti di Esplora esperimenti a sinistra dello schermo.

Quindi, scegli l'ora sotto l'opzione di annidamento nella barra degli strumenti dei componenti. Nell'impostazione Seleziona intervallo di tempo traccia nella finestra di dialogo del tempo, regolare il valore a su due minuti e fare clic su OK. Quindi, trascinare la casella nidificata tra la casella iniziale e la casella del risultato nell'area dei profili dati sul lato destro dello schermo.

Dalla barra degli strumenti di Esplora esperimenti a sinistra dello schermo, guarda sotto l'opzione di analisi e fai clic su Profilo di analisi. Quindi, nella barra degli strumenti delle variabili dipendenti, sotto la velocità di clic della direzione distanza e tempo. Fare clic su Aggiungi e sotto l'intestazione Distanza e tempo nella barra degli strumenti delle variabili dipendenti fare clic su Distanza spostata.

Quindi, fai clic su Aggiungi nella finestra di dialogo della distanza spostata e sotto l'intestazione del comportamento individuale nella barra degli strumenti delle variabili dipendenti, fai clic su movimento. Nella finestra di dialogo del movimento, guarda sotto l'intestazione del filtro anomalo e regola l'intervallo di media su uno. Quindi, sotto l'intestazione di soglia, regolare la velocità di avvio a due punti zero zero e regolare la velocità di arresto a un punto sette cinque.

Sotto l'opzione Calcola statistiche per intestazione, seleziona entrambe le caselle per lo spostamento e per il non movimento. Quindi, fai clic su Aggiungi e sotto l'opzione dei risultati nella barra degli strumenti di esplorazione degli esperimenti a sinistra dello schermo fai clic su output dell'analisi. Ora, fai clic su calcola.

Una volta calcolate le variabili dipendenti, fai clic su Esporta nella parte superiore dello schermo. Scegliere la cartella di destinazione dalla finestra di dialogo di esportazione dell'output dell'analisi e selezionare Excel dal menu a discesa del tipo di file. Quindi, fai clic su OK.

Infine, fai clic su salva esperimento nella scheda del file nella parte superiore dello schermo. Chiudere il software di tracciamento digitale. Importa i dati in un foglio di calcolo e analizzali utilizzando un pacchetto software di analisi statistica commerciale.

Dopo appena 72 ore di esposizione a varie concentrazioni di rame, due giorni dopo la schiusa lo storione ha mostrato molte anomalie osservabili. C'è stato un evidente impatto sul comportamento di nuoto. I dati video hanno aiutato a definire questa compromissione comportamentale.

In ulteriori test, lo storione a 30 giorni dalla schiusa si è dimostrato sensibile all'esposizione al rame per 96 ore. La velocità di nuoto, il tempo trascorso in movimento e la distanza percorsa sono diminuiti significativamente con l'aumento delle concentrazioni di rame. Anche i percorsi di nuoto sono stati ridotti con l'aumento delle concentrazioni di rame.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare il comportamento in un test di tossicità. Questa tecnica può fornire ai gestori ambientali un mezzo per utilizzare criteri comportamentali definiti per documentare il danno ambientale e guidare il ripristino. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di essere coerenti quando si registrano le osservazioni comportamentali.

Altri comportamenti, come l'alimentazione e l'aggressività, possono essere quantificati seguendo questa procedura al fine di rispondere a ulteriori domande sugli impatti a lungo termine dell'esposizione ai contaminanti sulla sopravvivenza.