Name: Quantificare Pesce Nuoto Comportamento in risposta allesposizione acuta acquosa di rame utilizzando Computer Assisted Video e Digital Image Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Scopri come quantificare il comportamento di nuoto dello storione bianco esposto al rame usando l'analisi video digitale. Questo metodo ecotossicologico fornisce indicatori precoci di tossicità per la conservazione acquatica.

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Ringraziamo il personale del Ramo Ecologia, Ramo Tossicologia e Ramo Chimica Ambientale dell'U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center per l'assistenza tecnica e analitica. Finanziamento fornito in parte da Teck American Incorporated attraverso un accordo con l'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (USEPA) Regione 10 con fondi forniti da USEPA all'US Geological Survey (USGS) attraverso il Department of Interior Central Hazmat Fund.

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Qualsiasi uso di nomi commerciali, aziendali o di prodotti è solo a scopo descrittivo e non implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

Cambiamenti nel comportamento a causa di esposizione a un contaminante sono spesso utilizzati come endpoint per la tossicità sub-letali, ma possono essere difficili da misurare. In generale, le risposte comportamentali sono misurati con osservazioni visive e analisi manuale dei dati che richiede un sacco di tempo per elaborare. Tuttavia, con l&#39;avanzare della tecnologia, i metodi per quantificare l&#39;attività di nuoto si sono concentrati sull&#39;utilizzo di videografia 18 e analisi del movimento o il software di monitoraggio digitale che riduce il tempo di elaborazione e di analisi. Durante l&#39;analisi del video catturato dati, quantificare le variabili di nuoto manualmente sarebbe stato molto tempo quindi l&#39;uso di registrazioni di dati video e software di monitoraggio pesce fornito un modo più efficace ed efficiente per analizzare il comportamento di storione nuoto. Anche se la procedura ha evidenziato il nuoto comportamento di un pesce, la personalizzazione di altri organismi come anfibi e invertebrati acquatici richiederebbero semplici modifiche. A seconda di cosa Punto finale comportamentalets sono affrontati, sistemi di progettazione e di telecamere sperimentali possono essere sviluppate per l&#39;utilizzo con qualsiasi pacchetto software di monitoraggio disponibile in commercio. Il metodo è dimostrata utilizzando rame disciolto, ma è applicabile ad altri contaminanti o caratteristiche come la temperatura o il contenuto di ossigeno acquosi. I protocolli sviluppati e presentati in questo documento utilizzato un semplice videocamera digitale come dispositivo di registrazione. I file digitali possono essere facilmente trasferiti su un computer e caricati al software di analisi del movimento. I metodi sono costantemente modificato e perfezionato per semplificare il processo di quantificazione. È indispensabile che la qualità video sia in alta definizione in modo che il software di analisi per identificare ogni singolo pesce per il monitoraggio. Qualsiasi sfondo che non contrasta con il pesce può causare problemi quando si cerca di elaborare i file di dati. Un altro problema comune con due video tracking tridimensionale è individui che identificanoquando i percorsi si incrociano nuoto. Questo può essere corretto manualmente identificando ogni pesce durante la traversata percorso e che collega i segmenti di percorso all&#39;interno del software. In alternativa, l&#39;attività totale può essere determinata da ciascuna camera di replica come media gruppo. Diverse camere individuali con ognuno contenente un pesce possono essere girati nello stesso campo visivo per calcolare i movimenti di singoli pesci. Attualmente abbiamo aggiornato per utilizzare una serie di telecamere di sorveglianza in testa sopra le camere di esposizione che sono collegati a un dispositivo di registrazione video digitale ad alta definizione (HD-DVR). Tuttavia, l&#39;uso di qualsiasi sistema di telecamere in grado di registrare ad alta definizione MPEG-4 video funzionerà. L&#39;HD-DVR può essere impostato per registrare in un momento specifico e programmato per un massimo di 7 giorni. Questo hands-off approccio automatizzato permette la cattura di diversi video contemporaneamente di mantenere la coerenza minimizzando disturbi esterni che potrebbero compromettere comportamento dei pesci. Il siste HD-DVRms sono collegati ad una rete interna così il trasferimento di file è relativamente semplice. Mentre il sistema di telecamere automatizzato è una tecnica molto migliorata per quantificare il comportamento di nuoto, è ancora utile per effettuare osservazioni visive per servire come informazioni di supporto aggiuntive per documentare deterioramento del comportamento durante i test di tossicità. C&#39;è una lunga storia della letteratura che documentano il comportamento dei pesci alterato derivante dall&#39;esposizione a metalli risalenti ai primi anni del 1960 19,20,21. Il rame ha dimostrato di causare cambiamenti nei livelli di attività, come ipoattività a persico sole 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) e le variazioni delle locomotoria e l&#39;attività di alimentazione della trota di ruscello 23 (Salvelinus fontinalis). Almeno alcuni novellame contare sul loro senso dell&#39;olfatto per rilevare ed evitare i predatori, e rame-indotta chemosensory privazione può avere un impatto comportamenti legati al rilevamento di sostanze chimiche di allarme 24,25,26 </sup&gt;. L&#39;epitelio olfattivo è danneggiata a causa di esposizione di rame che ciò pregiudichi meccanismi sensoriali che potrebbe tradursi in disorientamento, evitamento del comportamento, l&#39;alimentazione ridotta e tutti gli altri comportamenti che sono guidate da all&#39;olfatto 27. Questi comportamenti alterati erano coerenti con quanto osservato durante le esposizioni. Il comportamento di nuoto di storione bianco è stato notevolmente influenzato durante l&#39;esposizione subletale a concentrazioni di rame acquose .. Questi risultati illustrano come il comportamento è influenzato a concentrazioni subletali di rame e può essere usata come indicatore di stress tossici. L&#39;analisi basato il video si è rivelato efficace nel quantificare il comportamento di nuoto e serviva anche come qualitativa documentazione visiva dei gravi impatti sulla storione esposti al rame. Il software di analisi è anche in grado di quantificare altri vari endpoint comportamentali. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per una lista. Il sistema di esposizione può essere modificato per indirizzare ciascun endpointmodalità in tempo reale e può essere utilizzato per quantificare le differenze di comportamento associato all&#39;esposizione a vari contaminanti di interesse. L&#39;uso di endpoint di comportamento nella ricerca tossicologica acquatico è sempre più impiegato e dovrebbe essere considerato al momento di valutare gli effetti dei contaminanti perché la funzione del comportamento adattivo è cruciale nella determinazione del danno ambientale 9. Gli impatti dei contaminanti ambientali per il comportamento dei pesci è spesso soggettiva e impegnativo soprattutto quando si tratta di endpoint subletali in assenza di metodi standard .. Nuoto attività quantificato utilizzando questi metodi possono essere rigorosamente monitorati, è non distruttivo con il minimo stress per l&#39;organismo e può essere ripetuto. Nuoto comportamento è un indice valido e coerente di tossicità subletale che dovrebbe essere incorporato in protocolli di prova ad ampliare la sensibilità dei test di tossicità standard di 5.

Capire come l&#39;esposizione contaminante può influenzare il comportamento a volte è molto difficile e soggettiva. Comportamento è tipicamente definito come una serie di attività palesi, osservabili, corpo intero che operano attraverso il sistema nervoso centrale e consentono un organismo di sopravvivere, crescere e riprodursi. Cambiamenti nel comportamento a causa di esposizione a una sostanza tossica sono tra gli indicatori più sensibili di stress ambientale spesso tra 10-100 volte più sensibile rispetto alla sopravvivenza 1. La maggior parte di questi studi ha esaminato il nuoto attività, ventilazione e del comportamento alimentare di 2,3,4 pesci. Nuoto attività è la più utilizzata endpoint subletali determinare un cambiamento comportamentale in risposta ad un contaminante nel test di tossicità 5. variabili nuoto includono la frequenza e la durata del movimento, la velocità e la distanza percorsa, la frequenza e l&#39;angolo di giri, la posizione nella colonna d&#39;acqua e il modello di nuoto. Il nuoto è l&#39;attivitàuna misura efficace di comportamento di nuoto nel valutare la sensibilità di una sostanza tossica sulla base dei criteri proposti nel capitolo 9 da Rand 6 nei fondamenti del libro di Aquatic Toxicology. Questo documento presenta uno studio tossicologico come un esempio di come la tossicità del rame di storione bianco presto la vita allo stadio (Acipenser transmontanus) nelle varie fasi di sviluppo precoce in acqua solo esposizioni relative al storione comportamento di nuoto è stato valutato e illustra i metodi per quantificare il nuoto comportamento. In studi precedenti, le risposte comportamentali avversi sono stati evidenti con esordio precoce durante i primi giorni di esposizioni acute e croniche di rame e sono diventati progressivamente più grave lungo la durata dell&#39;esposizione e 7,8,9 concentrazione. L&#39;entità e la tempistica di insorgenza di queste risposte comportamentali sono suscettibili sufficienti a limitare la sopravvivenza a lungo termine e quindi sono fonte di preoccupazione date le implicazioni per recruitment fallimento 10. Per interpretare accuratamente il significato di questa sensibilità ai metodi e procedure esposizione metallici sono stati sviluppati per quantificare l&#39;andamento temporale e l&#39;entità di disturbi comportamentali relativi alle concentrazioni di rame. protocolli di test per la funzione del comportamento e lo sviluppo sono stati stabiliti analizzando campioni di video generali di storione in camere di esposizione. I video campioni forniti valutazione qualitativa di sviluppo e di funzione tra i trattamenti di rame durante il periodo di esposizione. Comportamento e riparo in cerca di attività sono state valutate durante le esposizioni a concentrazioni di rame acquose per determinare il tempo necessario per effettuare e per caratterizzare la sequenza temporale di deterioramento che colpisce in cerca di rifugio, letargia, il nuoto coordinazione, equilibrio, e la respirazione. Inoltre, registrazioni video sono state fatte di storione subsampled da ciascuna replica allo scopo di documentare quantitativamente acti nuoto spontaneavità. Questi endpoint inclusi misure di durata o il tempo trascorso in movimento, il nuoto la velocità e la distanza percorsa 5,11 utilizzando un pacchetto software per l&#39;analisi di immagini digitali disponibili in commercio. Questo software definisce il contorno di ciascuna immagine all&#39;interno di un campo di vista e da questa, definisce il centroide per ogni immagine. Il software quindi in grado di monitorare la posizione di ciascun baricentro in un fotogramma per fotogramma successione per determinare i percorsi di movimento. Questo studio ha rispettato tutte le sezioni applicabili delle Regole Definitive dei regolamenti Animal Welfare Act (9 CFR) e con tutte le linee guida istituzionali per il trattamento umano degli organismi di prova durante la coltura e la sperimentazione. Al termine dello studio, tutti i pesci sono stati eutanasia secondo le linee guida appropriate, come approvato dal Comitato Istituzionale cura e l&#39;uso di animali per la US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

<table><tbody><tr><td>rame II solfato pentaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>contaminante di preoccupazione distributore di</td></tr><tr><td>siringhe</td><td>Hamilton MicroLab serie</td><td></td> 600 <td>apparecchio per picchiare chimico 2</td></tr><tr><td>L contenitore volumetrico per palloni</td><td></td><td></td> per <td>contenere la soluzione madre</td></tr><tr><td>24-1,5 L barattoli di</td><td></td><td></td> vetro <td>camera di prova per 2 dph storioni</td></tr><tr><td>videocamera</td><td>Sony Handycam Software di tracciamento digitale HDR-CX550V</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Noldus Ethovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor a schermo</td><td></td><td></td><td></td>piatto da 3-17"</tr><tr><td>24 telecamere di sorveglianza</td><td>Modello CL101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi</td><td></td><td></td><td></td>di registrazione digitale a 3-16 canali</tr><tr><td>Misuratore di ossigeno disciolto</td><td>Misuratore di pH YSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Orion 940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonda di ph</td><td>Orion&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr>contatore <td></td><td></td><td></td><td>di ammoniaca</td></tr><tr><td>sonda di ammoniaca</td><td>Pompa</td> di ricircolo dell'acqua dell'unità di refrigerazione Orion <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificare pesce nuoto comportamento in risposta all&#39;esposizione acuta acquosa di rame utilizzando computer assisted video e digital image analysis

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

Le risposte comportamentali degli organismi acquatici ai contaminanti ambientali possono essere precursori di altri effetti come la sopravvivenza, la crescita o la riproduzione. Tuttavia, queste risposte possono essere sottili e la misurazione può essere impegnativa. Utilizzando lo storione bianco giovane (Acipenser transmontanus) con esposizioni al rame, questo articolo illustra le tecniche utilizzate per quantificare le risposte comportamentali utilizzando l'analisi di immagini digitali e video assistita da computer. In studi precedenti, sono state osservate gravi compromissioni del comportamento di nuoto tra lo storione bianco in fase precoce di vita durante l'esposizione acuta e cronica al rame. Il comportamento degli storioni è stato rapidamente compromesso e nella misura in cui la sopravvivenza sul campo sarebbe stata messa a repentaglio, poiché i pesci sarebbero stati spazzati a valle o prontamente catturati dai predatori. Gli obiettivi di questa indagine erano illustrare i protocolli per quantificare l'attività di nuoto durante una serie di esposizioni acute al rame per determinare il tempo di effetto durante lo sviluppo della fase iniziale della vita e per comprendere il significato di queste risposte relative alla sopravvivenza di questi pesci vulnerabili nelle prime fasi della vita. Poiché la mortalità si trova in un continuum temporale, determinare quando il rame influisce per la prima volta sulla capacità di nuotare ci aiuta a comprendere le implicazioni per gli effetti a livello di popolazione. Le tecniche utilizzate sono facilmente adattabili a disegni sperimentali con altri organismi e fattori di stress.

Elaborazione manuale dei dati osservazionali hanno mostrato anomalie visive per cento un aumento di concentrazione di rame aumentando dopo appena 72 ore di esposizione avviato con il post portello di due giorni (DPH) storione (Figura 2). I video campioni documentati estrema impatto dell&#39;esposizione rame sul comportamento storione nuoto (Video 2) e aiutato nella definizione della compromissione comportamentale come risultato. In un altro esempio, storione al 30 DPH dimostrato sensibile all&#39;esposizione di rame con una 96 ore concentrazione media effetto letale (LC50) di 40,3 mg / L in base ai solo la mortalità. Tuttavia, quando gli endpoint comportamentali subletali di perdita di equilibrio e di immobilizzazione sono inclusi insieme con la mortalità le sensibilità aumenta con una concentrazione stimata a 96 ore effetto mediana (CE50) che vanno 2,4-5,0 mg / L. Documentazione video catturati questi effetti subletali e ulteriormente validati osservazioni umani di anomalie comportamentali registratidurante l&#39;esposizione. L&#39;uso di software di monitoraggio digitale ha ridotto il tempo di post-elaborazione in modo significativo quando si analizza l&#39;attività di nuoto. Pesce velocità di nuoto, il tempo trascorso in movimento, e la distanza percorsa tutti significativamente diminuita (Figura 3) con la concentrazione di rame in aumento. Percorsi nuoto sono stati ridotti all&#39;aumentare della concentrazione di rame (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig1.jpg" /> Figura 1:.. Computer screenshot di un modello di foglio di calcolo utilizzato per determinare test di concentrazione della soluzione di preparazione chimica magazzino per i test di tossicità diluitore è stato determinato utilizzando un modello di foglio sulla base di una concentrazione target <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2:. Impostazione Diluitore e disegno sperimentale Vari vita stadi di storione bianco sono stati esposti al rame. La dimensione del diluitore utilizzato per le esposizioni è stato selezionato in base alle dimensioni del pesce. (A) di storione Vita in anticipo allo stadio sono stati esposti con un piccolo setup diluitore e (b) più vecchie vita stadi storione sono stati esposti con una grande messa a punto diluitore. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig3.jpg" /> Figura 3: Nuoto risultati di comportamento da un storione bianco precoce vita stadi (Acipenser transmontanus) l&#39;esposizione di rame 72 ore (a partire da 30 giorni dopo il portello [DPH] pesce). Endpoint attività natatoria (a) la durata del movimento fra 30 dph storione bianco; (B) la velocità di nuoto; e (c </forte distanza&gt;) mosso è diminuita con l&#39;aumentare della concentrazione di rame tra storione bianco esposto per 96 ore. L&#39;asterisco indica una differenza significativa dal controllo, le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig4.jpg" /> Figura 4: I risultati di uno storione bianco precoce vita stadi (Acipenser transmontanus) 96 l&#39;esposizione di rame ore (a partire da due giorni dopo il portello [DPH] pesce) Surviving storione bianco a 2 dph esporre la perdita di equilibrio e immobilizzazione dopo 72 ore di una. esposizione 96 ore con l&#39;aumentare della concentrazione di rame. L&#39;asterisco indica una differenza significativa dal controllo, le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig5.jpg" /> Figura 5: Esempio di nuoto percorso deriva da un storione bianco precoce vita stadi (Acipenser transmontanus) l&#39;esposizione di rame a 96 ore (fissando con 30 giorni dopo il portello [DPH] pesce). percorsi di nuoto di storione digitalizzati utilizzando il software di monitoraggio digitale da (a) replica di controllo (n = 5 pesce) e (b) da un trattamento ad alta (50 ug / L) replicando (n = 3 pesci) dopo un&#39;esposizione a 96 ore. Si noti il numero di percorsi di nuoto non rappresenta il numero di pesci presenti nella camera a causa di alcuni pesci erano inattivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Parametro quantificabile </td><td> Parametri osservazionali </td></tr><tr><td> Velocità </td><td> Letargia / iperattività </td></tr><tr><td> distanza percorsa </td><td> Perdita di equilibrio </td></tr><tr><td> Durata del tempo trascorso nella zona </td><td> Spasmi / tremori / a testagiù </td></tr><tr><td> Zona di transizione-numero di volte organismo si muove tra le zone selezionate </td><td> Posizione nella colonna d&#39;acqua </td></tr><tr><td> Intenzione di andare a punto calcola la deviazione del percorso dell&#39;animale verso un punto di interesse </td><td> La respirazione (veloce / lento) </td></tr><tr><td> Intestazione calcola il titolo del punto selezionato corpo </td><td> Colorazione </td></tr><tr><td> Girare l&#39;angolo-differenza di voce tra due campioni </td><td> occultamento </td></tr><tr><td> Velocità angolare-calcolato dividendo l&#39;angolo di svolta per l&#39;intervallo di campionamento </td><td></td></tr><tr><td> Meandro calcolato dividendo l&#39;angolo turno dal distanza percorsa. Usato per confrontare trasformare in animali in movimento a velocità diverse </td><td></td></tr><tr><td> Il tempo trascorso in movimento </td><td></td></tr><tr><td> Mobility stato calcola la durata per cui l&#39;intera area rilevato come animale sta cambiando, anche se il centpunto ER rimane la stessa </td><td></td></tr><tr><td> Rotazione-una rotazione viene completato quando il punto selezionato corpo ha un angolo di giro cumulativo di 360 °. Attiva nella direzione opposta inferiore alla soglia vengono ignorati. </td><td></td></tr><tr><td> Mobility continuo calcola la percentuale della mobilità per l&#39;intera area dell&#39;animale rilevato, anche se il punto centrale rimane lo stesso. </td><td></td></tr><tr><td> Distanza tra i soggetti-calcola la distanza tra tutti gli attori ed i ricevitori selezionati </td><td></td></tr><tr><td> Proximity-calcola la durata per cui l&#39;attore è o non è in prossimità del ricevitore </td><td></td></tr><tr><td> movimento relativo </td><td></td></tr><tr><td> pesata movimento-La Rete movimento del attore (positivo) e da (negativo) il ricevitore, ponderata con la distanza tra loro </td><td></td></tr><tr><td> movimento ponderata da-moveme<html> nt dell&#39;attore dal ricevitore, ponderata con la distanza tra loro. </td><td></td></tr><tr><td> movimento ponderata to circolazione dell&#39;attore al ricevitore, ponderata con la distanza tra loro </td><td></td></tr><tr><td> Controllo di prova periodo di dichiarazione tra due eventi degli elementi di controllo di prova, o all&#39;interno di un elemento </td><td></td></tr><tr><td> Controllo di prova evento-momento in cui un evento all&#39;interno di un elemento è stato definito nel controllo di prova si verifica. </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Endpoint comportamentali quantificati attraverso software di monitoraggio digitale Questi endpoint può essere utilizzato su individui o gruppi e servono anche come una lista per i controlli di osservazione visiva delle alterazioni del comportamento durante l&#39;esposizione. <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie1.jpg" /> /www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi &quot;&gt; Video 1:. visiva definizione di comportamento anomalo esibito da interessata storione bianco (clic destro per il download) un elenco di controllo di osservazione giornaliera è stata utilizzata per documentare le anomalie The. perdita di equilibrio e immobilizzazione erano le anomalie più frequenti osservati durante le esposizioni. Modificato da Calfee et al. 7 <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video2.avi">Video 2: documentazione di Visual evidenziando un esempio di comportamento bianco storioni nuoto. (Clic destro per il download)</a> l&#39;attività di nuoto storione bianco è stato notevolmente ridotto con l&#39;esposizione a concentrazioni di rame in aumento. Lo storione raffigurato in questo video sono da un controllo, medio basso, e un&#39;elevata trattamento al termine di rame acquosa 96 hresposizione. Sebbene la storione bianco fosse ancora vivo è evidente il pesce sono stati notevolmente compromessa nei trattamenti rispetto ai controlli. Modificato da Calfee et al. 7

Misurare l&#39;impatto dei contaminanti ambientali sul comportamento del pesce è spesso soggettiva e impegnativo soprattutto quando si tratta di endpoint subletali. Descriviamo metodi tra cui la tecnologia video per quantificare il comportamento di nuoto della vita fase iniziale bianco storione (Acipenser transmontanus) durante e dopo 96 ore esposizioni acute a varie concentrazioni di rame.

Quantificare Pesce Nuoto Comportamento in risposta all&#39;esposizione acuta acquosa di rame utilizzando Computer Assisted Video e Digital Image Analysis

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come quantificare le risposte comportamentali dello storione bianco a un'esposizione sub-letale al rame in soluzione acquosa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ecotossicologia, ad esempio in che modo l'esposizione sub-letale a contaminanti influisce sul comportamento natatorio dei pesci. Questo metodo può fornire informazioni importanti per la conservazione dello storione bianco.È inoltre facilmente applicabile ad altre specie di pesci, anfibi e invertebrati. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la risposta è altamente sensibile, fornisce un'indicazione precoce della tossicità ed è rilevante per la sopravvivenza dell'organismo. Inizialmente, questo metodo potrebbe risultare impegnativo se l'operatore non ha familiarità con le misurazioni comportamentali.La procedura sarà dimostrata dalla mia coautrice Holly Puglis. Per prima cosa, preparare due litri di solfato rameico pentaidrato di grado reagente in soluzione acquosa. Successivamente, equilibrare il sistema di diluizione e i serbatoi di esposizione.Posizionare il tubo di aspirazione del dispenser automatico a siringa nel flacone della soluzione madre. Successivamente, impostare il volume di prelievo della pompa automatica su un millilitro e accendere il diluente. Il sistema prepara una serie di diluizioni al 50% composta da cinque concentrazioni e un controllo.Tramite un divisore a quattro vie, queste soluzioni vengono erogate alle quattro camere di esposizione replicate. Successivamente, accendere la pompa del refrigeratore impostata per mantenere il bagno d'acqua a 15 gradi Celsius. Ora, utilizzando il timer automatico sul diluitore, impostarlo in modo che cicli ogni 30 minuti.Il livello dell'acqua nei serbatoi è mantenuto da un tubo di scarico. Preparare le camere di esposizione praticando un foro di quattro centimetri sul lato e coprendo il foro con una rete in acciaio inossidabile da 30 micron. Assicurarsi di scegliere camere di esposizione che contengano almeno un litro di acqua ogni 10 grammi di pesce.Ad esempio, uno storione bianco di 89 giorni pesa circa 373 milligrammi e può quindi essere testato in una camera quadrata di 28 centimetri per 13,5 centimetri per 25 centimetri. All'inizio, a metà e al termine di un esperimento, prelevare campioni di 24 millilitri della soluzione di prova per l'analisi chimica. Utilizzare cannucce prelevatrici collegate a siringhe di plastica.Sostituire la cannuccia con un filtro in polietersolfone da zero virgola quattro cinque micron e dispensare quattro millilitri di acqua di prova attraverso il filtro. Smaltire questa acqua. Successivamente, filtrare i restanti 20 millilitri di acqua in una bottiglia di polietilene pulita con acido.Acidificare il campione con acido nitrico 16 molare fino a raggiungere l'1% in volume. Questi campioni possono quindi essere conservati fino a tre mesi. Una volta confermate le esposizioni sperimentali, allestire tre storioni in ciascuna camera di prova replicata per un totale di circa 172 milligrammi di pesce per litro di camera.Raccogliere lo storione utilizzando una rete non abrasiva e trasferirlo in un piccolo secchio. In totale, sono necessari 144 pesci per raccogliere dati da sei soluzioni di prova. Durante l'esposizione di 96 ore, non nutrire i pesci.Devono essere effettuate osservazioni quotidiane costanti per valutare mortalità e comportamenti anomali. Il momento migliore della giornata per farlo è la mattina, e idealmente l'osservatore dovrebbe essere all'oscuro delle condizioni del test. La perdita di equilibrio è definita come l'incapacità del pesce di mantenere una posizione eretta all'interno della colonna d'acqua.L'immobilit&agrave; &egrave; definita come l'incapacit&agrave; dei pesci di muoversi o nuotare se non stimolati. Registrare anche eventuali altre anomalie, come letargia, iperattivit&agrave;, aumenti o diminuzioni della frequenza respiratoria, cambiamenti di colore, tremori, spasmi, addomi gonfi, posizione nella colonna d'acqua e qualsiasi altro schema anomalo di nuoto. I pesci morti devono essere sempre rimossi immediatamente.Ogni giorno, misurare anche i livelli di ossigeno disciolto mediante un misuratore portatile su due campioni d'acqua. Al termine dell'esposizione di 96 ore, registrare video per l'analisi del comportamento natatorio. Posizionare l'area di prova all'interno di un serbatoio di esposizione.Assicurarsi di scegliere un'arena di prova sufficientemente grande da permettere ai pesci di nuotare liberamente. Direttamente sopra ciascuna arena di prova, posizionare una videocamera portatile su un treppiede. Ora, tra i pesci trattati, selezionare casualmente fino a tre sopravvissuti.Trasferire tre esemplari nell'arena di prova utilizzando una piccola rete a maglie. Lasciare che i pesci si ambientino nell'arena per circa 30 minuti. Mentre i pesci si stanno ambientando, mettere a fuoco l'immagine, ridurre al minimo le distorsioni da riflessi causate dal movimento dell'acqua e massimizzare il contrasto dei pesci rispetto allo sfondo, regolando la visuale in modo che il pesce non sia ostruito.Dopo aver abituato il pesce, avviare la registrazione e acquisire due minuti di dati video. Al termine della ripresa, eutanasia il pesce e smaltirlo. Dopo aver convertito i file video nel formato richiesto dal software di analisi digitale, aprire il software di tracciamento e selezionare un nuovo esperimento predefinito nell'opzione crea un nuovo esperimento presente nella schermata principale.Compilare i campi richiesti e premere ok. Quindi, andare nell'opzione impostazioni dell'esperimento sotto configurazione e selezionare file video come sorgente video. Impostare il numero di aree su uno.Impostare il numero di soggetti per arena a tre. Successivamente, selezionare il rilevamento del punto centrale tra le caratteristiche tracciate e scegliere le unità desiderate. Ora, nella sezione configurazione, selezionare l'opzione elenco prove e fare clic su aggiungi video nella parte superiore dello schermo.Scegliere l'ordine alfabetico dalla finestra di dialogo. Fare clic su Sfoglia. Accedere alla cartella in cui si trovano i video, evidenziare i file pertinenti e fare clic su Apri.Ora che i file video sono stati selezionati, procedere a definire l'ambito dell'esperimento nel software. Innanzitutto, fare clic su aggiungi variabile nella parte superiore dello schermo e inserire concentrazione nel campo dell'etichetta. Inserire concentrazione di rame in microgrammi per litro nel campo della descrizione.Successivamente, selezionare "numerico" dall'elenco a discesa per il tipo. Fare clic sulla casella dei valori predefiniti e scegliere l'opzione "definire valori individuali" dalla finestra di dialogo. Inserire le concentrazioni utilizzate per l'esperimento, cliccando su "aggiungi" dopo l'inserimento di ciascun numero.Quindi, deselezionare l'opzione "consenti altri valori" e fare clic su OK. Scegliere "prova" dal menu a discesa nella casella ambito. Inserire la concentrazione appropriata per ciascuna prova nelle caselle fornite.Fare clic su "aggiungi variabile" nella parte superiore dello schermo. Inserire "replicato" nella casella dell'etichetta. Inserire "numero di replicato" nella casella della descrizione.Scegliere "numerico" dall'elenco a discesa per il tipo. Successivamente, fare clic sulla casella dei valori predefiniti e selezionare l'opzione "definisci valori individuali" dalla finestra di dialogo. Inserire uno, due, tre e quattro, e deselezionare l'opzione "consenti altri valori".Quindi, fare clic su OK. Ora, scegliere l'opzione prova dal menu a discesa nella casella dell'ambito. Inserire il numero di replica appropriato per ogni prova.Il passo successivo consiste nel configurare gli spazi dell'arena. Iniziare selezionando le impostazioni dell'arena nella scheda di configurazione e assegnare al primo set il nome di prova uno. Nella finestra di dialogo, selezionare l'opzione acquisisci immagine di sfondo e fare clic su sfoglia.Individuare il file video del primo tentativo e fare clic su "apri". Dopo che il video appare, fare clic su "acquisisci" nella finestra di dialogo per l'acquisizione dell'immagine di sfondo. Successivamente, fare clic sull'icona del cerchio bianco in prossimità della parte superiore dello schermo, sotto le impostazioni dell'arena, e regolare il cerchio in modo che delimiti l'area di nuoto.Quindi, fare clic sull'icona della scala di calibrazione nelle impostazioni dell'arena. Utilizzare un movimento di clic-mantenuto-trascinamento per selezionare lo spazio dell'arena. Ora, nella casella della distanza reale, sotto la distanza di calibrazione, inserire 10,5.Quindi, fare clic su OK. Se necessario, regolare la linea di calibrazione in modo che copra l'intero diametro dell'arena circolare. Fare clic sull'opzione convalida impostazioni arena nella finestra delle impostazioni dell'arena e risolvere eventuali problemi nelle impostazioni non convalidate.Ora, ripetere questo processo fino a quando tutte le aree sono state definite per ogni prova. Successivamente, impostare i parametri di rilevamento dei pesci. Per prima cosa, scegliere le impostazioni di rilevamento nell'opzione di configurazione presente nella barra degli strumenti dell'esperimento, situata sul lato sinistro dello schermo.Quindi, selezionare la sottrazione dinamica dal menu a discesa in corrispondenza di "metodo" nella finestra di dialogo delle impostazioni di rilevamento. Inoltre, scegliere un colore di riempimento per ogni soggetto nella sezione identificazione dei soggetti all'interno della finestra di dialogo. Successivamente, selezionare "scegli video" e individuare il video relativo alla prova uno.Nelle impostazioni di rilevamento, in una finestra di dialogo, compilare la casella della frequenza di campionamento sotto video con cinque virgola nove nove quattro uno. Nella stessa casella, fare clic su impostazioni per l'opzione immagine di riferimento nel rilevamento. Quindi, fare clic sull'opzione avvia apprendimento C nella finestra di dialogo dell'immagine di riferimento.Una volta che l'immagine nella finestra di dialogo dell'immagine di riferimento appare senza animali, fare clic su "usa immagine di riferimento dinamica" nelle impostazioni di acquisizione all'interno della finestra di dialogo e chiudere questa finestra. Ora, scegliere "più scuro" dal menu a discesa per "soggetto è" in rilevamento, nella finestra di dialogo delle impostazioni di rilevamento. Per il contrasto scuro in rilevamento, impostare il numero più piccolo a 33 e il numero più grande a 153.Quindi, fare clic su "Salva modifiche" in basso a destra. A questo punto, verificare che il software stia effettivamente tracciando gli animali, anziché ombre o detriti. Fare clic sul pulsante di riproduzione nella finestra di dialogo del controllo di riproduzione e regolare i valori di contrasto scuro secondo necessità.Assicurarsi di salvare tutte le modifiche effettuate. Il software è ora configurato per raccogliere dati dal video, quindi il passo successivo consiste nel tracciare il pesce in ogni prova. Per prima cosa, selezionare l'acquisizione nell'opzione di configurazione presente nella barra degli strumenti dell'esploratore dell'esperimento a sinistra dello schermo.Successivamente, fare clic su "traccia il prossimo test pianificato" nella finestra di dialogo delle impostazioni di acquisizione e verificare che il test, il video e le impostazioni dell'arena corretti siano tutti visualizzati nelle impostazioni della finestra di dialogo delle impostazioni di acquisizione. Quindi, selezionare l'opzione di rilevamento che determina la velocità nella finestra di dialogo di controllo dell'acquisizione. Fare clic sul pulsante con il cerchio verde racchiuso in un quadrato bianco per avviare il processo di acquisizione.Ripetere questo processo fino a quando tutti i tentativi sono stati tracciati. Ora è possibile analizzare gli oggetti tracciati, ovvero i pesci. Per prima cosa, fare clic su profili dei dati sotto l'opzione di analisi nella barra degli strumenti dell'esploratore dell'esperimento a sinistra dello schermo.Quindi, selezionare il tempo nell'opzione di nidificazione presente nella barra degli strumenti dei componenti. Nella finestra di dialogo del tempo, sotto l'impostazione dell'intervallo di tempo della traccia da selezionare, regolare il valore "a" a due minuti e fare clic su OK. Successivamente, trascinare la casella di nidificazione tra la casella iniziale e la casella dei risultati nell'area dei profili dati situata sul lato destro dello schermo.Dalla barra degli strumenti dell'esploratore dell'esperimento a sinistra dello schermo, cercare sotto l'opzione di analisi e fare clic su profilo di analisi. Quindi, nella barra degli strumenti delle variabili dipendenti, sotto l'intestazione distanza e tempo, fare clic su velocità. Fare clic su aggiungi e, nella barra degli strumenti delle variabili dipendenti, sotto l'intestazione distanza e tempo, fare clic su distanza percorsa.Quindi, fare clic su "aggiungi" nella finestra di dialogo relativa alla distanza percorsa e, nella barra degli strumenti delle variabili dipendenti sotto l'intestazione "comportamento individuale", fare clic su "movimento". Nella finestra di dialogo del movimento, cercare l'intestazione "filtro degli outlier" e regolare l'intervallo di mediazione a uno. Successivamente, sotto l'intestazione "soglia", regolare la velocità iniziale a due virgola zero zero e la velocità di arresto a uno virgola sette cinque.Sotto l'intestazione "calcola statistiche", selezionare entrambe le caselle per oggetti in movimento e non in movimento. Quindi, fare clic su aggiungi e, nell'opzione risultati sulla barra degli strumenti dell'esploratore dell'esperimento a sinistra dello schermo, fare clic su output dell'analisi. Ora, fare clic su calcola.Dopo aver calcolato le variabili dipendenti, fare clic su esporta nella parte superiore dello schermo. Scegliere la cartella di destinazione dalla finestra di dialogo di esportazione dell'output dell'analisi e selezionare Excel dal menu a discesa del tipo di file. Quindi, fare clic su ok.Infine, fare clic su "salva esperimento" nella scheda file in alto nella schermata. Chiudere il software di tracciamento digitale. Importare i dati in un file di foglio elettronico e analizzarli utilizzando un pacchetto software commerciale per l'analisi statistica.Dopo soli 72 ore di esposizione a diverse concentrazioni di rame, gli storioni di due giorni dopo la schiusa hanno mostrato numerose anomalie osservabili. Si è verificato un evidente impatto sul comportamento natatorio. I dati video hanno contribuito a definire questo deficit comportamentale.In ulteriori test, gli storioni a 30 giorni dalla schiusa si sono dimostrati sensibili alle esposizioni di rame di 96 ore. La velocità natatoria, il tempo trascorso in movimento e la distanza percorsa sono tutti significativamente diminuiti con l'aumento delle concentrazioni di rame. Anche i percorsi di nuoto sono stati ridotti con l'aumento delle concentrazioni di rame.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come quantificare il comportamento in un test di tossicità. Questa tecnica può fornire ai responsabili della gestione ambientale un mezzo per utilizzare criteri basati sul comportamento al fine di documentare i danni ambientali e guidare il ripristino. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di essere coerenti durante la registrazione delle osservazioni comportamentali.Altri comportamenti, come l'alimentazione e l'aggressività, possono essere quantificati seguendo questa procedura al fine di rispondere ad ulteriori domande sugli effetti a lungo termine dell'esposizione a contaminanti sulla sopravvivenza.

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