L'isolamento di regioni genomiche specifici e l'identificazione di molecole da Associated enChIP
20 gennaio 2016
L'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse è necessaria per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni di queste regioni. Questo protocollo descrive le procedure per eseguire l'imunoprecipitazione ingegnerizzata della cromatina mediata da molecole leganti il DNA (enChIP) per l'identificazione di proteine e RNA associati a una specifica regione genomica.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare una specifica regione genomica che mantiene le interazioni molecolari per l'identificazione di molecole che interagiscono con la regione genomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo delle funzioni genomiche come la trascrizione e la regolazione epigenetica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione diretta delle molecole che interagiscono con una specifica regione genomica.
A dimostrare la procedura sarà Toshitsugu Fujita, un assistente professore del mio laboratorio. Seguendo il protocollo di testo, ingegnerizzare le molecole leganti il DNA di interesse. Ciò comporta la generazione della sequenza gBlock di interesse e il suo inserimento in un retrovirus, ad esempio per produrre l'RNA guida complessato con tre FLAG-dCas9.
In alternativa, è possibile generare tre proteine FLAG-TAL che riconoscono la sequenza bersaglio. Quindi, seguendo il protocollo di testo, infettare le cellule con il retrovirus preparato. Confermare l'espressione delle molecole ingegnerizzate che legano il DNA e stabilire la linea cellulare.
A questo punto, procedete reticolando le cellule con la formaldeide. Sospendere 20 milioni di cellule trasfettate in 30 millilitri di terreno di coltura normale e aggiungere 810 microlitri di formaldeide al 37% per una concentrazione finale dell'1%Incubare la miscela per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, uccidere la reazione di reticolazione aggiungendo 3,1 millilitri di glicina molare da 1,25
.Lasciare riposare le celle a temperatura ambiente per 10 minuti prima di procedere. Quindi, centrifugare la provetta cellulare a 300 G per cinque minuti in una centrifuga refrigerata. Scartare con cura il surnatante e lavare il pellet cellulare in 30 millilitri di PBS mediante miscelazione e centrifugazione.
Eseguire due lavaggi PBS. Se necessario, il pellet lavato delle celle fisse può essere conservato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Proseguendo, raccogli la cromatina dalle cellule.
Sospendeteli in 10 millilitri di tampone di lisi e incubateli su ghiaccio per 10 minuti. Quindi, utilizzando una centrifuga refrigerata, raccogliere le celle e scartare con cura il surnatante. Ora, sospendere il pellet cellulare nel tampone di lisi nucleare e incubarlo sul ghiaccio per 10 minuti.
Ogni pochi minuti durante l'incubazione agitare brevemente la miscela. Anche in questo caso, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Ora, lava il pellet con 10 millilitri di PBS e rimuovi la soluzione di lavaggio con un'altra centrifugazione.
Questo produce la frazione di cromatina e, se lo si desidera, può essere congelata in flash e conservata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Procedere sospendendo il pellet di cromatina in 800 microlitri di tampone di lisi modificato tre e trasferire la sospensione in una provetta più piccola da 1,5 millilitri. Ora, accendi una sonda sonica al livello tre di potenza con servizio continuo.
Per frammentare la cromatina, passare manualmente da 10 secondi di sonicazione a 20 secondi su ghiaccio. Ogni 5° o 6° ciclo, estendere la fase di ghiaccio a due minuti in modo che il campione non si surriscaldi. Eseguire questo ciclo di sonicazione da 10 a 18 volte, mantenendo la punta della sonda fuori dal fondo del tubo per evitare la formazione di schiuma sul campione.
Dopo la sonicazione, raccogliere il campione con una centrifugazione refrigerata veloce. Quindi, trasferire il surnatante contenente la cromatina frammentata in un nuovo tubo e scartare il pellet. Vedere il protocollo di testo su come valutare la frammentazione.
Per prepararsi all'immunoprecipitazione, coniugare prima gli anticorpi a Dynabeads. Questa immunoprecipitazione viene scalata a campioni derivati da 20 milioni di cellule. Aggiungere 1/5 del volume del tampone di lisi modificato tre con Triton X-100 alla cromatina frammentata per ottenere una concentrazione finale dell'1% di Tritone.
Successivamente, aggiungere il composto alle sfere magnetiche coniugate alle normali IgG di topo. Incubare la reazione per un'ora su un rotatore con refrigerazione. Successivamente, attira le perle dalla soluzione per tre minuti su un supporto magnetico.
Quindi, raccogli il surnatante. Trasferire il surnatante nel tubo di biglie magnetiche coniugate agli anticorpi anti-FLAG. Esegui questa reazione di coniugazione durante la notte su un rotatore a quattro gradi Celsius.
La mattina dopo, applica un magnete al tubo per tre minuti per raccogliere le perline. Quindi, pipettare il surnatante ed eliminarlo. Ora, lavate le perline.
Sospendeteli in un millilitro di tampone a basso contenuto di sale e incubateli per cinque minuti su un rotatore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, isolare la magnetizzazione delle perle e scartare il surnatante. Ripetere ancora una volta questa fase di lavaggio con un tampone a basso contenuto di sale.
Utilizzando la stessa tecnica, eseguire altri due lavaggi utilizzando un tampone ad alto contenuto di sale. Continuare a utilizzare il metodo per lavare due volte le perle nel tampone di cloruro di litio. Infine, lavare le perline con TBS-IGEPAL CA-630 solo una volta.
Dopo le sette fasi di lavaggio, sospendere le perle in 200 microlitri di tampone di eluizione e incubarle a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, attirare le perle mediante magnetizzazione e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo. Ripetere questa fase di eluizione per aumentare le rese.
Quindi, purificare circa il 5% del DNA per stimare la resa. Inizia mescolando la maggior parte dell'eluato in una reazione di precipitazione. Far precipitare la cromatina durante la notte a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.
Il giorno successivo, centrifugare il campione ed eliminare il surnatante. Sciacquare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e ripetere la centrifugazione per 10 minuti. Quindi, scartare il surnatante e sospendere il pellet in 40 microlitri di tampone campione 2x.
Ora, fai oscillare la sospensione per cinque minuti interi. Quindi, incubarlo a 100 gradi Celsius per 30 minuti per denaturare e invertire la reticolazione. Dopo l'ebollizione, far scorrere 40 microlitri di campione su un gel SDS-PAGE.
Di solito viene impiegato un gradiente dal quattro al 20%. Esegui il gel fino a quando il colorante non viaggia un centimetro sotto il pozzo. Quindi, colora il gel e taglialo in cinque pezzi lunghi circa 2 millimetri.
Diluire la proteina dai pezzi di gel e utilizzarla per l'analisi della spettrometria di massa. La purificazione dell'RNA, seguita dall'analisi del sequenziamento, sono trattate nel protocollo di testo. Complessivamente, fino al 10% delle regioni genomiche target può essere purificato utilizzando enChIP.
Qui si vedono i risultati delle analisi mirate alla regione del promotore del gene IRF-1 rispetto al locus Sox2 non specifico. Un altro esempio è il targeting dei telomeri rispetto al locus gamma-satellite non specifico. enChIP SILAC ha identificato diverse proteine associate al promotore IRF-1 in modo specifico per l'interferone gamma.
Le proteine leganti i telomeri sono state identificate anche mediante enChIP combinato con la spettrometria di massa. Il sequenziamento dell'RNA enChIP è stato quindi utilizzato per identificare gli RNA associati ai telomeri. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trascrizione e della regolazione epigenetica per esplorare tali meccanismi in vari sistemi biologici.
Panoramica
Questo protocollo delinea la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina mediata da molecole di legame al DNA ingegnerizzate (enChIP) per identificare proteine e RNA associati a specifiche regioni genomiche. Fornisce una metodologia dettagliata per isolare le interazioni molecolari cruciali per comprendere le funzioni genomiche.
Componenti Principali dello Studio
Area di Scienza
- Genomica
- Epigenetica
- Biologia Molecolare
Contesto
- Comprendere le interazioni molecolari con le regioni genomiche è essenziale per chiarire i meccanismi regolatori.
- enChIP permette l'identificazione diretta delle molecole che interagiscono con specifiche aree genomiche.
- Questo metodo è applicabile negli studi di trascrizione e regolazione epigenetica.
- Migliora la capacità di studiare funzioni genomiche complesse.
Obiettivo dello Studio
- Isolare regioni genomiche specifiche e identificare le molecole interagenti.
- Fornire un metodo affidabile per studiare la regolazione trascrizionale ed epigenetica.
- Dimostrare efficacemente la tecnica enChIP.
Metodi Utilizzati
- Ingegnerizzazione di molecole di legame al DNA utilizzando sequenze gBlock e retrovirus.
- Cross-linking delle cellule e isolamento della cromatina.
- Fratturazione della cromatina mediante sonicazione.
- Esecuzione dell'immunoprecipitazione con anticorpi coniugati.
Risultati Principali
- Isolamento riuscito della cromatina da cellule trasfettate.
- Identificazione di proteine e RNA associati a specifiche regioni genomiche.
- Dimostrazione di efficace purificazione delle regioni genomiche target utilizzando enChIP.
- Stima della resa mediante analisi di spettrometria di massa.
Conclusioni
- enChIP è uno strumento potente per studiare le interazioni molecolari in siti genomici specifici.
- Il metodo fornisce informazioni sulla regolazione trascrizionale ed epigenetica.
- Può essere utilizzato per varie applicazioni nella ricerca genomica.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
enChIP enables direct, unbiased identification of proteins and RNAs interacting with specific genomic regions, supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach enhances predictive confidence by linking genomic loci to functional molecular interactions in transcription and epigenetic regulation. It provides a scalable method for early discovery biology to inform portfolio triage and reduce late-stage biological risk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying direct molecular interactors of genomic regions of interest.
- Operational Value: Enables functional target validation through unbiased proteomic and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying pathway context and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromatin inputs for downstream molecular interaction screening.
- Operational Value: Standardizes isolation of specific genomic regions with quantifiable yield (up to 10% purification efficiency).
- Scalability: Supports platform reuse across loci (e.g., promoters, telomeres) using TAL or CRISPR-dCas9 engineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage genomic findings to disease-relevant mechanisms via associated molecule identification.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned follow-up through mass spectrometry or RNA sequencing of isolated complexes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical target prioritization by revealing context-specific interactors (e.g., interferon gamma-specific IRF-1 associations).
Pipeline & Workflow Integration
enChIP fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing molecular interaction data that bridges genomic annotation and functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating genomic regions while preserving native molecular interactions.
- Screening: Generates assay-ready chromatin fractions for interaction profiling with chemical or genetic perturbations.
- Analytics: Enables quantitative comparison of associated molecules across conditions via mass spec or RNA-seq readouts.
- Translational Research: Connects genomic loci to phenotypic mechanisms through identified proteins and RNAs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for locus-specific interactome mapping across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genomic function studies through direct interactor identification.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized isolation of tagged genomic regions using antibody-based immunoprecipitation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target mechanism early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on molecular context of genomic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to engineer TAL or gBlock-CRISPR DNA-binding molecules.
- Needs access to sonication equipment, magnetic separation tools, and downstream analytics (mass spec, RNA-seq).
- Demands cross-team standardization for epitope tagging (e.g., FLAG) and antibody conjugation workflows.
- Must account for chromatin accessibility and epitope efficiency across diverse genomic regions and cell types.
- Practical limitation: Efficiency depends on successful tagging and expression of engineered DNA-binding molecules in target cells.
