Name: Lisolamento di regioni genomiche specifici e lidentificazione di molecole da Associated enChIP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Scopri la tecnica enChIP per isolare regioni genomiche specifiche e identificare proteine e RNA associati. Questo metodo consente di studiare la regolazione trascrizionale ed epigenetica con elevata precisione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da Takeda Science Foundation (TF); la Fondazione Asahi Glass; Memorial Foundation Uehara (HF); il Kurata Memorial Hitachi Fondazione Scienza e Tecnica (TF e HF); Grant-in-Aid per giovani scienziati (B) (# 25.830.131), Grant-in-Aid per la ricerca scientifica (C) (# 15K06895) (TF); e Grant-in-Aid per la ricerca scientifica su &#39;Trascrizione Cycle&#39; settori innovativi (# 25.118.512 &amp; # 15H01354), Grant-in-Aid per la ricerca scientifica (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid per la ricerca esplorativa ( # 26650059) e &#39;Genome Support&#39; (# 221S0002) (HF) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia del Giappone.

1. Progettazione di Engineered molecole di DNA-binding Riconoscere il Target Locus <ol><li> Per enChIP utilizzando complessi CRISPR, utilizzare lo strumento web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) per identificare sequenze candidato bersaglio gRNA nella regione genomica di interesse descritto come precedentemente 18. Questo strumento web riporta 23 bp siti genomici della forma 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;all&#39;interno della regione di destinazione. </li><li> Sintetizzare un gBlock compresa la sequenza del promotore U6 e la sequenza di 5&#39;-N 20 in 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;utilizzando servizi commerciali (vedi Figura 2) 19,20. Ai fini subcloning, includere preposti per enzimi di restrizione al di fuori del gBlock. </li><li> Inserire il gBlock in un vettore adeguato come descritto in precedenza 16. Diversi vettori retrovirali per gBlocks sono disponibili (vedi Materiali). </li><li> Per enChIP utilizzando proteine ​​TAL, progettare proteine ​​TAL riconoscendo la target loci. Generare plasmidi che codificano per proteine ​​TAL che utilizzano i servizi commerciali. Genera vettori di espressione contenenti le proteine ​​TAL fusi con una o più variabili come 3 × FLAG come descritto in precedenza 15. </li></ol> 2. Istituzione di cellule per l&#39;analisi enChIP <ol><li> Esprimere 3 × FLAG-dCas9 e il gRNA (procedura basata CRISPR-) oppure 3 × FLAG-TAL (TAL procedura a base di proteine) nelle cellule per essere analizzato come descritto in precedenza 14-17. <ol><li> Utilizzare trasfezione transiente se l&#39;efficienza di trasfezione è alta. Un vettore di espressione contenente 3 × FLAG-dCas9 e il promotore CMV è disponibile (vedi Materiali). </li><li> Considerare l&#39;istituzione di trasformanti stabili con metodi convenzionali se l&#39;efficienza di trasfezione transiente è bassa. In aggiunta ai suddetti vettori retrovirali per gBlock, vettori retrovirali di 3 × FLAG-dCas9 sono disponibili (vedi Materiali). </li></ol></li><li&gt; Conferma l&#39;espressione del 3xFLAG-dCas9 o proteine ​​3xFLAG-TAL nelle cellule trasfettate mediante analisi immunoblot usando un anticorpo anti-FLAG (Ab) come descritto in precedenza 14-17. Nota: L&#39;espressione di queste proteine ​​con tag può anche essere confermata mediante colorazione intracellulare con anticorpi anti-FLAG-FITC e una successiva analisi FACS. Un protocollo per la colorazione intracellulare può essere scaricato dal nostro sito internet (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). </li><li> Conferma espressione del gRNA dalla tecnica standard RT-PCR. </li><li> Per l&#39;identificazione quantitativa di proteine ​​che interagiscono con la regione genomica di interesse, prendere in considerazione l&#39;uso di un sistema di etichettatura isotopo stabile da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) analisi combinata con enChIP (enChIP-SILAC). Nota: supporto per l&#39;analisi SILAC possono essere acquistati da fornitori commerciali. SILAC è potente nel rilevare interazioni specifiche. <ol><li> Cellule di coltura in SILAC medio pesante. Preparare cellule culturosso in mezzo luce SILAC come controllo negativo. Utilizzare almeno 5 × 10 7 cellule per mezzo SILAC (pesante o leggero). Per l&#39;etichettatura efficiente, aggiungere sia L-lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 nei media SILAC pesanti. Nota: Almeno cinque divisioni cellulari sono necessari per le proteine ​​di etichette. <ol><li> Per esempio, la cultura umana cellule fibrosarcoma HT1080 esprimono stabilmente 3xFLAG-dCas9 e un gRNA a 37 ° C e 5% di CO 2 in DMEM media per la SILAC e siero fetale bovino dializzato con lisina-2HCl più L-Arginina-HCl (medio chiaro) o 13 C 6 L-lisina-2HCl più 13 C 6 15 N 4 L-arginina-HCl (medio pesante) (vedi Materiali) 16. Aggiungere 50 mg di leggera o pesante L-lisina-2HCl e L-arginina-HCl in 500 ml di terreno. </li><li> Cellule trypsinize e replate prima che diventino confluenti modo che le cellule mantengono growt esponenzialeh. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. La reticolazione di Celle con formaldeide <ol><li> Per le cellule in coltura in sospensione, trasferimento 2 × 10 7 cellule che esprimono proteine ​​3xFLAG-TAL o 3xFLAG-dCas9 più gRNA e sospendere in 30 ml di terreno di coltura normale in una provetta da centrifuga da 50 ml. Quando si utilizzano più celle, aumentare i volumi e le quantità di reagenti proporzionalmente. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule coltivate in terreno pesante o leggero medio (5 x 10 7 cellule ciascuno) e dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule. </li><li> Aggiungere 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di sospensione cellulare (concentrazione finale 1%) e incubare a 37 ° C per 5 min. Per le cellule aderenti, correggere direttamente le cellule in coltura con l&#39;aggiunta di 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di terreno di coltura. </li><li> Fermare la reticolazione con l&#39;aggiunta di 3,1 ml di 1,25 M soluzione di glicina (concentrazione finale 127 mm), eincubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in un flacone di scarico adeguato. <ol><li> Per le cellule aderenti, staccare le cellule con un raschietto cellulare e raccolto in un tubo da 50 ml, e raccogliere le cellule, come descritto in questo passaggio. </li><li> Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule staccate coltivati ​​in terreno pesante o media luce (5 x 10 7 cellule ciascuno), dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule e raccogliere le cellule come descritto in questo passo. </li></ol></li><li> Lavare il pellet con 30 ml di PBS due volte per provetta. Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in uno spreco appropriata bottle.Handle rifiuti formaldeide secondo le linee guida sulla sicurezza chimica. Le cellule fissate possono essere congelati e conservati a -80 ° C. </li></ol> 4. Preparazione di cromatina (per 2 x 107 cellule) <ol><li> Sospendere le cellule fissate in 10 ml di tampone di lisi cellulare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, e 1 × inibitori della proteasi) e incubare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante. </li><li> Sospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi nucleare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, 0,5% lauroylsarcosine, e inibitori della proteasi 1x). Incubare in ghiaccio per 10 minuti e vortice ogni 2-3 minuti. </li><li> Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante. </li><li> Lavare il pellet in 10 ml di PBS. Il pellet (frazione cromatina) può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido. </li></ol> 5. Sonicazione di cromatina (a 2 x 10 7 cellule) <ol><li> Sospendere la frazione cromatina in 800 ml dimodificato tampone di lisi 3 (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% sodio desossicolato, 0,1% SDS, e 1x inibitori delle proteasi) e trasferire in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Sonicare la cromatina utilizzando un sonicatore (vedi Materiali) e le seguenti condizioni: Uscita: 3; dovere: 100% (continuo); e il tempo libero. Eseguire 10-18 cicli di sonicazione per 10 sec e raffreddamento in ghiaccio per 20 sec. Per evitare un eccessivo riscaldamento, incubare i campioni in ghiaccio per 2 minuti ogni 5-6 cicli. Per evitare la formazione di schiuma, mantenere la posizione della punta della sonda sonicazione 0,5 cm sopra il fondo della provetta. </li><li> Centrifugare il campione a (16.000 xg a 4 ° C per 10 min) e trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 ml. La cromatina sonicato può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido. </li></ol> 6. Valutazione di cromatina frammentazione <ol><li> Mescolare 10 ml di cromatina frammentata con 85 ml di acqua distillata. </li><li> Aggiungere 4 ml5 M di NaCl e incubare a 65 ° CO / N. </li><li> Aggiungere 1 ml di 10 mg / ml RNasi A e incubare a 37 ° C per 45 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ml di 1 M Tris (pH 6,8), e 1 ml di 20 mg / ml proteinasi K, e incubare a 45 ° C per 1,5 ore. </li><li> Separati 10 microlitri del campione mediante elettroforesi in gel di agarosio all&#39;1% che non contiene coloranti colorazione come SYBR Green. </li><li> Macchia il gel per valutare la distribuzione delle lunghezze della cromatina frammentata. Le condizioni che generano una lunghezza media di 0,5-2 kbp (range di 0,2-4 kb) sono raccomandati. </li><li> Purificare il DNA da campioni rimanenti mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato come DNA di ingresso per stimare le rese di analisi enChIP (vedi 8.11). </li></ol> 7. Preparazione di Dynabeads Coniugato con anticorpi (per 2 x 10 7 cellule) <ol><li> Prepare due provette da 1,5 ml, uno per pre-compensazione utilizzando IgG normale mouse e l&#39;altra per l&#39;incubazione con l&#39;anticorpo anti-FLAG Ab. Aggiungere 150 ml di proteine ​​sfere magnetiche G-coniugato (vedi Materiali) ad ogni provetta. </li><li> Porre i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando. </li><li> Sospendere le perline in 1 ml di PBS contenente 0,01% Tween-20 (PBS-T). Porre i tubi su un supporto magnetico e attendere per 2 min. Eliminare il surnatante pipettando, e quindi ripetere il passaggio. </li><li> Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T contenente 0,1% BSA. </li><li> Aggiungere 15 mg di IgG di topo normale o anti-FLAG Ab e ruotare a 4 ° CO / N. </li><li> Spin down brevemente, quindi posizionare i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando. </li><li> Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T. Invertire più volte campione e spin down brevemente. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere per 3 minuti, poi scartare il surnatante pipettando. Ripetere il lavaggioaltre due volte con PBS-T (totale di tre fasi di lavaggio). </li></ol> 8. Immunoprecipitazione della cromatina (a 2 x 10 7 cellule) <ol><li> Mescolare la cromatina frammentata preparato in 5.3) (circa 800 ml) con un quinto del volume (circa 200 ml) di tampone di lisi 3 modificato contenente 5% Triton X-100 (concentrazione finale di 1% Triton X-100). </li><li> Aggiungere la soluzione cromatina al tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugate con IgG normale del mouse sono stati preparati. Ruotare a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. </li><li> Trasferire il surnatante nel tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugati con anti-FLAG Ab sono stati preparati. Ruotare a 4 ° CO / N. </li><li> Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando. </li><li> Sospendere le perline in 1 ml di tampone salino basso (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) e ruotare a 4 ° C per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando e ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Lavare le perline con tampone di sali (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) due volte. </li><li> Lavare le perline con tampone LiCl (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% sodio desossicolato, e inibitori della proteasi 1x) due volte. </li><li> Lavare le perline con TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% inibitori IGEPAL CA-630, e 1x proteasi) una volta. </li><li> Sospendere le perline in 200 ml di tampone di eluizione (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% IGEPAL CA-630, inibitori della proteasi 1x e 500 mcg / ml 3 × FLAG peptide) e incubare a 37 ° C per 20 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e ripetere il Elution passo. </li><li> Purificare DNA da piccola porzione (ad esempio, 5%) dell&#39;eluato mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato per PCR con primer specifici imposta per stimare le rese di enChIP analisi confrontando con DNA ingresso preparata al punto 6.7 come descritto in precedenza 14,16. </li></ol> 9. SDS-PAGE, colorazione, e analisi spettrometrica di massa <ol><li> Mescolare l&#39;eluato (400 microlitri) con 1 ml di 2-propanolo, 50 ml di 3M acetato di sodio (pH 5,2), e 5 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Precipitare la cromatina a -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugare il campione (16.000 xg a 4 ° C per 30 min) e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare di nuovo (16.000 xg a 4 ° C per 10 min). Eliminare il surnatante completamente pipettando. </li><li> Sospendere il pellet in 40 ml di tampone 2x campione (125 mM Tris (pH 6,8), il 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% di saccarosio, e 0,004% blu di bromofenolo). Vortex per 5 minuti per sciogliere completamente il pellet, e poi incubare a 100 ° C per 30 minuti per denaturare le proteine ​​e invertire la reticolazione. </li><li> Per SDS-PAGE, eseguire 40 ml di campione sul gel finché il colorante raggiunge 1 cm sotto il pozzo. Nota: Usiamo solitamente 4-20 gel% di pendenza, ma altri gel% può essere utilizzato. </li><li> Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue o macchia d&#39;argento. </li><li> Tagliare il gel in cinque pezzi (2 mm) di altezza. </li><li> Eseguire la digestione gel e spettrometria di massa come descritto in precedenza 13-16. </li><li> Per gli esperimenti SILAC con 5 x 10 7 cellule ciascuna (totale di 1 x 10 8 cellule), sospendere pellet dagli iniziali cinque tubi in 40 ml di tampone 2x campione (non è necessario scalare). </li></ol> 10. Purificazione di RNA e l&#39;RNA-Seq Analisi <ol><li> Per purificare l&#39;RNA dopo enChIP, aggiungere 5 U / ml di RNase Inhibitor (seMateriali e) a tutte le soluzioni tampone, tranne modificato lysis buffer 3 e il tampone di eluizione, a cui aggiungere 40 U / ml di RNasi Inhibitor. </li><li> Mescolare l&#39;eluato (400 ml) con 16 ml di NaCl 5 M e incubare a 65 ° C per 2 ore. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente acido-guanidinio-base-fenolo (vedi Materiali) al campione. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 5-15 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e RT. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 ml e aggiungere 5 ml di p-bromoanisole. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Centrifugare il campione per 10 minuti a 12.000 xg e RT. </li><li> Trasferire il surnatante (circa 1 ml) in un nuovo tubo 2 ml e aggiungere 1 ml di 2-propanolo. Capovolgere la provetta e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Caricare il composto su una colonna in un kit di purificazione dell&#39;RNA (vedi Materiali). Centrifugare colonna per 1 min a 12.000 × g e RT. </li><li> lavaggiola colonna con 400 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali). </li><li> Aggiungere 80 ml di DNasi I cocktail (miscela di 5 ml di DNasi I (1 U / ml), 8 ml di 10 × DNasi I tampone di reazione, 3 ml di acqua priva di RNasi DNase /, e 64 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione dell&#39;RNA (vedi Materiali)) per la colonna. Incubare il campione a 37 ° C per 15 minuti, quindi si centrifuga per 30 sec a 12.000 xg e RT. </li><li> Lavare la colonna con 400 ml di RNA prelavaggio tampone in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali) due volte. </li><li> Eluire l&#39;RNA con 50 ml di acqua / RNasi-free DNasi. L&#39;RNA eluito può essere utilizzato per il sequenziamento RNA. </li></ol>

<ol><li>Zhang, X. Y., Horz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+highly+purified+satellite+DNA+containing+chromatin+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse.</a> Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).</li>
<li>Workman, J. L., Langmore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoprotein+hybridization%3A+a+method+for+isolating+specific+genes+as+high+molecular+weight+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemstry%22%5BJournal%5D)">Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin.</a> Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).</li>
<li>Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+active+genes+containing+CAG+repeats+by+DNA+strand+invasion+by+a+peptide+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).</li>
<li>Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+primate+satellite+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of primate satellite chromatin.</a> Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).</li>
<li>Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+specific+chromatin+segments+from+chromosomal+loci+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast.</a> Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).</li>
<li>Ghirlando, R., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+studies+on+defined+heterochromatin+fragments+support+a+30-%C2%B5m+fiber+having+six+nucleosomes+per+turn%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn.</a> J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Hoshino, A., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+chromatin+immunoprecipitation%3A+a+method+for+isolating+specific+genomic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions.</a> J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+idenification+of+insulator+components+by+insertional+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation.</a> PLoS One. 6, e26109(2011).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+specific+genomic+regions+by+insertional+chromatin+immunoprecipitation+%28iChIP%29+with+a+second-generation+tagged+LexA+DNA-binding+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biosci.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain.</a> Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+biochemical+epigenetics+%2F+chromatin+biochemistry+by+insertional+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Biochem%22%5BJournal%5D)">Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation.</a> ISRN Biochem. 2013, 913273(2013).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+specific+genomic+regions+retaining+molecular+interactions+by+the+iChIP+system+using+recombinant+exogenous+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins.</a> BMC Mol. Biol. 15, 26(2014).</li>
<li>Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+the+Thy28-MYH9+axis+in+B+cell-specific+expression+of+the+Pax5+gene+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells.</a> PLoS One. 10, (2015).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+proteins+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+%28enChIP%29+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).</li>
<li>Fujita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+telomere-associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+%28enChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP).</a> Sci. Rep. 3, 3171(2013).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+associated+with+an+IFN%CE%B3-responsive+promoter+by+a+retroviral+expression+system+for+enChIP+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR.</a> PLoS One. 9, e103084(2014).</li>
<li>Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-coding+RNAs+associated+with+telomeres+using+a+combination+of+enChIP+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing.</a> PLoS One. 10, e0123387(2015).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Esvelt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Cas9+proteins+for+RNA-guided+gene+regulation+and+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing.</a> Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).</li>
<li>Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+characteristics+of+off-target+sites+bound+by+the+Cas9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease.</a> Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).</li>
<li>Cencic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protospacer+adjacent+motif+%28PAM%29-distal+sequences+engage+CRISPR+Cas9+DNA+target+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage.</a> PLoS One. 9, 109213(2014).</li>
<li>O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+analysis+of+Cas9+binding+specificity+using+ChIP-seq+and+targeted+sequence+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).</li>
<li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shelterin%3A+the+protein+complex+that+shapes+and+safeguards+human+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres.</a> Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).</li>
</ol>

Gli autori hanno depositato un brevetto su enChIP (Nome del brevetto: "Metodo per isolare specifiche regioni genomiche utilizzando molecole leganti il DNA che riconoscono sequenze di DNA endogene"; Numero di brevetto: PCT/JP2013/74107). H.F. è membro dell'Advisory Board di Addgene.

Qui, descriviamo la purificazione di specifiche regioni genomiche utilizzando molecole ingegnerizzate che legano il DNA come il sistema CRISPR e le proteine TAL, e l'identificazione di proteine e RNA legati a queste regioni genomiche. Il legame di molecole ingegnerizzate che legano il DNA al genoma può influenzare la struttura della cromatina, compreso il posizionamento dei nucleosomi, e può abrogare le funzioni genomiche, come descritto negli esperimenti di interferenza CRISPR21. Per evitare questi potenziali effetti aberranti, proponiamo linee guida specifiche per la scelta delle regioni genomiche target. In primo luogo, per evitare la potenziale inibizione del reclutamento delle RNA polimerasi e dei fattori di trascrizione, nonché l'interruzione del posizionamento dei nucleosomi attorno al sito di inizio della trascrizione, le regioni target per l'analisi delle regioni del promotore dovrebbero essere diverse centinaia di coppie di basi a monte di (5' a) il sito di inizio della trascrizione. Al contrario, quando si analizzano regioni genomiche con confini distinti, come enhancer e silenziatori, le regioni genomiche che sono direttamente giustapposte a queste regioni possono essere prese di mira perché è meno probabile che il legame di molecole che legano il DNA ingegnerizzate influenzi le loro funzioni. Inoltre, è meglio evitare di utilizzare regioni bersaglio che sono conservate tra specie diverse, perché importanti molecole leganti il DNA spesso si legano a regioni evolutivamente conservate e l'inibizione del loro legame potrebbe interrompere le funzioni delle regioni genomiche bersaglio. A questo proposito, è sempre necessario verificare che la funzione della regione genomica target sia mantenuta nelle cellule stabilite utilizzate per le analisi enChIP. Poiché è possibile testare facilmente più gRNA ed è noioso e costoso generare più versioni di proteine TAL o zinc-finger riconoscendo diverse regioni genomiche target, l'enChIP che utilizza CRISPR è più vantaggioso di enChIP che utilizza altre proteine.
È stato dimostrato che dCas9 si lega ai siti fuori bersaglio, sebbene l'affinità con tali siti possa essere più debole di quella con i siti target22-25. Esistono diversi modi per gestire la contaminazione delle molecole legate a quei siti fuori bersaglio. In primo luogo, si raccomanda l'uso di diversi, almeno due, gRNA diversi. Quelle molecole comunemente osservate in enChIP che utilizzano gRNA distinti sarebbero veri positivi. In secondo luogo, il confronto di diverse condizioni per l'enChIP sarebbe efficace nell'annullare la contaminazione di molecole non specifiche e di molecole legate a siti fuori bersaglio. Esempi di questi set di confronto potrebbero essere (i) stimolazione (-) e (+), o (ii) diversi tipi di cellule come le cellule T rispetto alle cellule B. Infine, l'analisi quantitativa del legame delle molecole candidate dovrebbe essere eseguita per confermare il loro legame specifico ai siti bersaglio. È preferibile preparare cellule che esprimono solo dCas9 ma non gRNA come controllo negativo.
Utilizzando le analisi enChIP, siamo stati in grado di identificare con successo una serie di molecole note e nuove che interagiscono con specifiche regioni genomiche (Tabelle 1-3)14-17. Tuttavia, questa tecnica non è riuscita a rilevare alcune altre proteine note che interagiscono con queste regioni. Ad esempio, STAT1 si associa con il promotore IRF-1 dopo la stimolazione con IFNγ8, ma la nostra analisi enChIP-SILAC non ha rilevato STAT1 come proteina indotta a interagire con questa regione genomica16. Inoltre, nell'analisi enChIP-MS dei telomeri, non abbiamo rilevato proteine shelterine costituite da TRF-1 e TRF-215, che hanno dimostrato di interagire con i telomeri26. Ci sono alcune potenziali ragioni per queste discrepanze. In primo luogo, la stechiometria di legame di Stat1 al promotore IRF-1 potrebbe essere molto bassa. È ragionevole che enChIP-MS, incluso enChIP-SILAC, rilevi proteine che sono più abbondantemente associate alle regioni genomiche bersaglio; Pertanto, l'analisi di più cellule potrebbe essere necessaria per rilevare queste proteine. L'aumento della sensibilità degli strumenti per la SM contribuirebbe anche all'individuazione efficiente di proteine con basso legame stechiometrico. In secondo luogo, alcune proteine, tra cui Stat1 e shelterine, potrebbero essere bersagli difficili per le analisi della SM. In terzo luogo, nella nostra analisi delle proteine leganti i telomeri15, le proteine 3×FLAG-TAL che riconoscono i telomeri (3×FN-Tel-TAL) potrebbero aver bloccato il legame delle shelterine ai telomeri in modo competitivo.
In contrasto con la relativa difficoltà di rilevare i fattori di trascrizione che si legano a specifiche regioni genomiche utilizzando enChIP, abbiamo identificato con successo regolatori epigenetici come gli enzimi di modificazione degli istoni utilizzando le analisi di enChIP. Il successo di questa tecnica può essere dovuto al fatto che i regolatori epigenetici si legano a un'ampia gamma di regioni genomiche; quindi, sono disponibili più proteine per regione genomica per la SM. Poiché i regolatori epigenetici sono sempre più riconosciuti come bersagli importanti per i farmaci contro malattie intrattabili come il cancro, enChIP sarebbe uno strumento utile per l'identificazione di bersagli farmacologici epigenetici.

È necessaria l&#39;identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni genomiche quali la trascrizione e la regolazione epigenetica. Sebbene siano state sviluppate diverse tecniche per l&#39;analisi biochimica di specifiche regioni genomiche 1-7, non sono ampiamente utilizzati in questa fase causa dei loro problemi intrinseci quali applicazione limitata (ad esempio, solo per numero alta copy loci o loci con ripetizioni) e troppo tempo e gli sforzi necessari. Al fine di effettuare analisi biochimica di specifiche regioni genomiche facilmente, abbiamo sviluppato due tecnologie specifiche locus cromatina (chip), vale a dire inserzionale Chip (iChip) 8-13 e ingegnerizzato DNA-binding ChIP molecola-mediata (enChIP) 14-17 . In iChip, un luogo di interesse è contrassegnati con l&#39;inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina di legame al DNA esogeno, come LexR. Il locus è quindi isolato da purificazione per affinità con la proteina DNA-binding tag. In enChIP, ingegnerizzati molecole che legano il DNA, come le proteine ​​zinc-finger, (TAL) proteine ​​attivatore-come trascrizione, e cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) complessi, vengono utilizzate per contrassegnare un luogo di interesse (Figura 1). Successivamente, la regione genomica è isolato dalla purificazione per affinità delle molecole DNA-binding targhetta. Uno dei vantaggi di enChIP sopra iChip è che l&#39;inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina legante il DNA esogeno-non è necessario. Targeting di loci usando complessi CRISPR costituiti da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 (dCas9) e una guida RNA (gRNA) è molto più facile che prendere di mira di queste regioni a iChip o enChIP utilizzando TAL e zinco-finger proteine. Qui, descriviamo un protocollo step-by-step per enChIP combinata con spettrometria di massa e RNA sequencing (RNA-Seq) per identificare locus-Associaproteine ​​e RNA ted, rispettivamente.

<table><tbody><tr><td>Servizio di sintesi gBlock,</td> Life <td>Technologies</td>, <td>Sintesi genica di GeneArt</td><td></td></tr><tr>,<td>servizio di sintesi gBlock,</td><td>IDT (Integrated DNA Technologies)</td><td>gBlocks, Frammenti Genici:</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-neo</td>, <td>Addgene</td><td>51128</td><td></td></tr>, <tr><td>pSIR-GFP,</td><td>Addgene</td><td>51134</td><td></td></tr>, <tr><td>pSIR-DsRed-Express2</td>, <td>Addgene</td><td>51135</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-hCD2</td><td>Addgene</td><td>51143</td><td></td></tr><tr><td>Servizio di sintesi TAL</td><td>Life Technologies</td><td>GeneArt Precision TALs</td><td></td></tr><tr><td>3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1</td><td>Addgene</td><td>47948</td><td></td></tr><tr><td>3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-puro</td><td>Addgene</td><td>51240</td><td></td></tr><tr><td>3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-IG</td><td>Addgene</td><td>51258</td><td></td></tr><tr><td>3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-I2</td><td>Addgene</td><td>51259</td><td></td></tr><tr><td>3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-neo</td><td>Addgene</td><td>51260</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 Ab</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coniugato anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium per SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89985</td><td>Altri medium possono essere acquistati da Life Technologies</td></tr><tr><td>Dialyzed FBS per SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89986</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina-2HCl per SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89987</td><td>Per Mezzo leggero</td></tr><tr><td>L-Arginina-HCl per SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89989</td><td>Per Mezzo leggero</td></tr><tr><td>L-Lisina-2HCl, 13C6 per SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89988</td><td>Per Mezzo pesante</td></tr><tr><td>L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 per SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89990</td><td>Per Mezzo pesante</td></tr><tr><td>Completo, mini, Senza EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4693159</td><td></td></tr><tr><td>Disgregatore ad ultrasuoni UD-201</td><td>Tomy Seiko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChIP DNA Clean & Concentratore</td><td>Zymo Research</td><td>D5205</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads-Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>DB10004</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase Inibitore</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Isogen II</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Un componente di un sistema nanoLC-MS/MS per l'analisi</td></tr><tr>MS<td>nanoLC</td><td>Advance, Michrom Bioresources</td><td></td><td>Un componente di un sistema nanoLC-MS/MS per l'analisi MS</td></tr><tr><td>Autocampionatore HTC-PAL</td><td>CTC Analytics</td><td></td><td>Un componente di un sistema nanoLC-MS/MS per l'analisi MS</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da associated enchip

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

L'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse è necessaria per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni di queste regioni. Per consentire l'identificazione non distorta di molecole che interagiscono con una specifica regione genomica di interesse, abbiamo recentemente sviluppato la tecnica ingegnerizzata di immunoprecipitazione della cromatina mediata da molecole leganti il DNA (enChIP). Qui, descriviamo come utilizzare enChIP per isolare specifiche regioni genomiche e identificare le proteine e gli RNA associati. In primo luogo, una regione genomica di interesse viene marcata con una proteina simile all'attivatore di trascrizione (TAL) o con un complesso di brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate costituito da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 e da un RNA guida. Successivamente, la cromatina viene reticolata e frammentata mediante sonicazione. Il locus marcato viene quindi immunoprecipitato e la reticolazione viene invertita. Infine, le proteine o gli RNA associati alla cromatina isolata vengono sottoposti rispettivamente ad analisi di spettrometria di massa o di sequenziamento dell'RNA. Questo approccio consente l'identificazione di proteine e RNA associati a una regione genomica di interesse.

Complessivamente, 1-30% del bersaglio regioni genomiche può essere purificato usando enChIP. Figura 3 include dati rappresentativi che mostrano le rese di enChIP le analisi di targeting telomeri e il promotore del interferone (IFN) regolamentazione factor-1 (IRF-1) gene. Come esempi di risultati tipici, tabella 1 elenca le proteine ​​associate al IRF-1 promotore in maniera IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC, Tabella 2 elenca le proteine-telomeri legame individuati dalla enChIP combinata con la spettrometria di massa (enChIP-MS) , e Tabella 3 elenca le RNA associati a telomeri identificate da enChIP-RNA-Seq. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica enChIP. enChIP utilizzando CRISPR (A, B) e TAL (C, D, E </forte è mostrato&gt;). Un luogo di interesse è etichettato con le molecole di DNA-binding ingegnerizzati, come una proteina TAL o il sistema CRISPR costituito da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 (DCA) e RNA guida (gRNA). Le interazioni molecolari sono fissati con formaldeide o altri reticolanti, se necessario. Successivamente, la cromatina fisso è frammentata mediante ultrasuoni o digestione enzimatica. Le regioni genomiche taggati vengono purificati dalla purificazione di affinità. Infine, reticolazione è invertita, e le molecole che interagiscono (regioni genomiche, RNA e proteine) sono identificati mediante sequenziamento di nuova generazione e la spettrometria di massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53478/53478fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig2.jpg" /> Figura 2. Sequenza di gBlock. Il promotore U6 (in nero), il G nucleotide brima la sequenza di guida (in blu), viene mostrata la sequenza di guida (gRNA distanziatore) (in rosso), la sequenza di ponteggio (in verde), e la sequenza di terminazione (in arancione). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig3.jpg" /> Figura 3. I rendimenti di analisi enChIP rappresentante. Ingressi (A) percentuale per l&#39;obiettivo di IRF-1 locus e la non bersaglio Sox2 locus. Ingressi (B) percentuali per i telomeri bersaglio e non bersaglio gamma-satelliti. Le cifre sono state adattate e modificato da precedenti pubblicazioni 15,16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorie </td><td> Proteine </td></tr><tr><td> Trascrizione </td><td> DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo omologo, PURβ, attivato RNA polimerasi II trascrizionale attivatore p15, BTF3, Myb vincolanteproteina 1A </td></tr><tr><td> Histone deacetilazione, componenti corepressor </td><td> RBBP4, PA2G4, TBL3 </td></tr><tr><td> Acetiltrasferasi </td><td> Proteine ​​arginina N-metiltransferasi 1 </td></tr><tr><td> DNA topoisomerasi </td><td> DNA topoisomerasi 2α </td></tr><tr><td> Istoni </td><td> Histone H2A.Z, istone H3.2 </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Esempi di proteine ​​associate con la IRF-1 promotore umano in modo IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente 16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorie </td><td> Proteine </td></tr><tr><td> Proteine ​​telomeri legame mammiferi </td><td> PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 </td></tr><tr><td> Telomere-biproteine ​​nding nel lievito o altri organismi </td><td> IMP4 </td></tr><tr><td> Le proteine ​​che interagiscono con telomeri vincolante proteine ​​[proteina telomeri legame associato] </td><td> DNA polimerasi α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] </td></tr><tr><td> Le proteine ​​localizzando a heterochromatin </td><td> BEND3 </td></tr><tr><td> Le proteine ​​che regolano segnali epigenetici </td><td> KDM5C </td></tr><tr><td> Le proteine ​​le cui mutazioni influenzare la funzione dei telomeri </td><td> Α DNA polimerasi (POLA1), hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutammato-cisteina ligasi, glutaredossina, SMRC1 </td></tr></tbody></table> Tabella 2:. Esempi di proteine ​​associate con telomeri del mouse identificate da enChIP-MS La tabella è stata adapted da una pubblicazione precedente 15. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorie </td><td> RNA </td></tr><tr><td> Componenti della telomerasi </td><td> TERC, RMRP </td></tr><tr><td> Telomeric RNA </td><td> Terras </td></tr><tr><td> scaRNAs </td><td> Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 </td></tr><tr><td> H / ACA snoRNAs </td><td> Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a </td></tr><tr><td> C / D snoRNAs </td><td> Snord17, Snord15a, Snord118 </td></tr><tr><td> lncRNA </td><td> Neat1 </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Esempi di RNA associati a telomeri del mouse identificate da enChIP-RNA-Seq La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente 17..

L'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse è necessaria per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni di queste regioni. Questo protocollo descrive le procedure per eseguire l'imunoprecipitazione ingegnerizzata della cromatina mediata da molecole leganti il DNA (enChIP) per l'identificazione di proteine e RNA associati a una specifica regione genomica.

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare una regione genomica specifica mantenendo le interazioni molecolari, al fine di identificare le molecole che interagiscono con tale regione genomica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo delle funzioni genomiche, come la trascrizione e la regolazione epigenetica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'identificazione diretta delle molecole che interagiscono con una regione genomica specifica.La procedura sarà dimostrata da Toshitsugu Fujita, un professore associato del mio laboratorio. Seguendo il protocollo testuale, progettare le molecole leganti il DNA di interesse. Ciò comporta la generazione della sequenza gBlock di interesse e il suo inserimento in un retrovirus, ad esempio, per produrre l'RNA guida complessato con tre FLAG-dCas9.In alternativa, è possibile generare tre proteine FLAG-TAL che riconoscono la sequenza bersaglio. Successivamente, infettare le cellule con il retrovirus preparato seguendo il protocollo indicato nel testo. Confermare l'espressione delle molecole leganti il DNA ingegnerizzate e stabilire la linea cellulare.Ora, procedere con l'incrocio dei legami cellulari mediante formaldeide. Sospendere 20 milioni di cellule trasfettate in 30 millilitri di mezzo di coltura normale e aggiungere 810 microlitri di formaldeide al 37% per ottenere una concentrazione finale dell'1%. Incubare la miscela per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, arrestare la reazione di cross-linking aggiungendo 3,1 millilitri di glicina 1,25 molare.Lasciare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti prima di procedere. Successivamente, centrifugare il tubo delle cellule a 300 G per cinque minuti in una centrifuga refrigerata. Rimuovere con attenzione il soprannatante e lavare il pellet cellulare in 30 millilitri di PBS mediante mescolamento e centrifugazione.Eseguire due lavaggi con PBS. Se necessario, il pellet lavato di cellule fissate può essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Proseguire quindi raccogliendo la cromatina dalle cellule.Sospendili in 10 millilitri di buffer di lisi e incuba sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, utilizzando una centrifuga refrigerata, raccogli le cellule e scarta con attenzione il soprannatante. A questo punto, sospendi il pellet cellulare nel buffer di lisi nucleare e incuba sul ghiaccio per 10 minuti.Ogni pochi minuti durante l'incubazione, vortexare brevemente la miscela. Nuovamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. A questo punto, lavare il pellet con 10 millilitri di PBS ed eliminare la soluzione di lavaggio con un'ulteriore centrifugazione.Questo produce la frazione di cromatina e, se desiderato, può essere congelata rapidamente e conservata a meno 80 gradi Celsius. Procedere sospendendo il pellet di cromatina in 800 microlitri di buffer di lisi modificato tre e trasferire la sospensione in un tubo più piccolo da 1,5 millilitri. Ora, accendere una sonda per sonicazione al livello tre di potenza con ciclo continuo.Per frammentare la cromatina, eseguire manualmente cicli alternati di 10 secondi di sonificazione e 20 secondi sul ghiaccio. Ogni 5° o 6° ciclo, estendere la fase sul ghiaccio a due minuti per evitare il surriscaldamento del campione. Ripetere questo ciclo di sonificazione da 10 a 18 volte, mantenendo la punta della sonda sollevata dal fondo del tubo per evitare la formazione di schiuma nel campione.Dopo la sonificazione, raccogliere il campione mediante una rapida centrifugazione refrigerata. Successivamente, trasferire il surnatante contenente la cromatina frammentata in un nuovo tubo e scartare il pellet. Consultare il protocollo testuale per sapere come valutare la frammentazione.Per preparare l'immunoprecipitazione, innanzitutto coniugare gli anticorpi ai Dynabeads. Questa immunoprecipitazione è proporzionata a campioni derivati da 20 milioni di cellule. Aggiungere un volume pari a 1/5 di tampone di lisi modificato tre con Triton X-100 alla cromatina frammentata per ottenere una concentrazione finale di 1% di Triton.Successivamente, aggiungere la miscela alle microsferette magnetiche coniugate con IgG murina normale. Incubare la reazione per un'ora su un agitatore rotante in refrigerazione. Successivamente, attirare le microsferette dalla soluzione per tre minuti su un supporto magnetico.Quindi, raccogliere il soprannatante. Trasferire il soprannatante nel tubo contenente le microsfere magnetiche coniugate con anticorpi anti-FLAG. Incubare questa reazione di coniugazione tutta la notte su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius.Il mattino seguente, applicare un magnete al tubo per tre minuti per raccogliere le perle. Quindi, aspirare il soprannatante e scartarlo. A questo punto, lavare le perle.Sospendere le perline in un millilitro di tampone a basso contenuto salino e incubare per cinque minuti su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, isolare le perline mediante magnetizzazione e scartare il soprannatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio con il tampone a basso contenuto salino un'altra volta.Utilizzando la stessa tecnica, eseguire altri due lavaggi con tampone ad alto contenuto salino. Continuare utilizzando il metodo per lavare le perle due volte con tampone al cloruro di litio. Infine, lavare le perle con TBS-IGEPAL CA-630 una sola volta.Dopo i sette passaggi di lavaggio, sospendere le perle in 200 microlitri di tampone di eluizione e incubarle a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, attirare le perle mediante magnetizzazione e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo. Ripetere questo passaggio di eluizione per aumentare i rendimenti.Quindi, purificare circa il 5% del DNA per stimarne il rendimento. Iniziare mescolando la maggior parte dell'eluito in una reazione di precipitazione. Precipitare la cromatina per tutta la notte a meno 20 gradi Celsius.Il giorno successivo, centrifugare il campione e scartare il soprannatante. Lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e ripetere la centrifugazione per 10 minuti. Quindi, scartare il soprannatante e sospendere il pellet in 40 microlitri di tampone di campionamento 2x.Ora, agitare il sospensione mediante vortex per cinque minuti completi. Successivamente, incubare a 100 gradi Celsius per 30 minuti per denaturare e invertire il cross-linking. Dopo l'ebollizione, caricare 40 microlitri del campione su un gel SDS-PAGE.Di solito si utilizza un gradiente dal quattro al 20%. Far correre il gel fino a quando il colorante non ha percorso un centimetro al di sotto del pozzetto. Successivamente, colorare il gel e tagliarlo in cinque pezzi di circa 2 millimetri di lunghezza.Diluire la proteina dai frammenti di gel e utilizzarla per l'analisi con spettrometria di massa. La purificazione dell'RNA, seguita dall'analisi di sequenziamento, è descritta nel protocollo testuale. Complessivamente, fino al 10% delle regioni genomiche bersaglio può essere purificato utilizzando l'enChIP.Qui vengono mostrati i rendimenti delle analisi mirate alla regione promotore del gene IRF-01 rispetto al locus non specifico Sox2. Un altro esempio è il confronto tra i telomeri bersaglio e il locus non specifico di gamma-satellite. L'analisi enChIP con SILAC ha identificato diverse proteine associate al promotore di IRF-1 in maniera specifica per l'interferone gamma.Sono stati inoltre identificati proteine leganti i telomeri mediante enChIP abbinato a spettrometria di massa. Il sequenziamento dell'RNA tramite enChIP è stato successivamente utilizzato per identificare gli RNA associati ai telomeri. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi della trascrizione e della regolazione epigenetica per esplorare tali meccanismi in diversi sistemi biologici.

isolation-specific-genomic-regions-identification-associated

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine ​​che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

In questo video, dimostriamo la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine su regioni specifiche del DNA genomico delle cellule precursori degli oligodendrociti attraverso l'immunoprecipitazione selettiva di frammenti di cromatina legati alle proteine. Questo metodo aiuta a studiare l'interazione di diverse proteine regolatrici, compresi i fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione genica.

Immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine bersaglio sul DNA genomico

In questo articolo video descrive un metodo microarray basato in vitro per determinare gli obiettivi del gene e siti di legame per due regolatori di risposta del sistema dei componenti.

DNA purificato per affinità Chip (DAP-chip) metodo per determinare obiettivi del gene per batterica, due sistemi di regolamentazione dei componenti

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere una risoluzione vicina alla coppia di basi delle interazioni proteina-DNA. Questo si ottiene mediante trattamento esonucleasico di frammenti di DNA arricchiti selettivamente mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-exo) seguita da sequenziamento ad alto rendimento.

Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Qui, presentiamo un protocollo per la selezione in vitro di repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) con un'efficienza di silenziamento alta, a lungo termine, stabile, on-target e bassa attività a livello di genoma, off-target. Questo flusso di lavoro consente di ridurre un repertorio iniziale e complesso di ETR candidati a un breve elenco, adatto per un'ulteriore valutazione in contesti terapeuticamente rilevanti.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

La tecnica iChip si avvale di un dispositivo di isolamento in situ semplice ed economico che aumenta i tassi di scoperta di nuovi microrganismi dal suolo. Nuovi microrganismi possono essere utilizzati per ulteriori studi relativi al microbioma del suolo o alla scoperta di prodotti naturali, tra le altre applicazioni.

Isolamento dei microrganismi del suolo con la tecnologia iChip

Un metodo ChIRP basato su UV per identificare interazioni dirette lncRNA-proteina.

Un metodo ChIRP a base di UV per l'identificazione verificabile di proteine che interagiscono direttamente con lncRNA: dalle cellule coltivate al testicolo del topo

Scopri la tecnica enChIP per isolare regioni genomiche specifiche e identificare proteine e RNA associati. Questo metodo consente di studiare la regolazione trascrizionale ed epigenetica con elevata precisione.

L'isolamento di regioni genomiche specifici e l'identificazione di molecole da Associated enChIP

Esplora altri video