L'isolamento di regioni genomiche specifici e l'identificazione di molecole da Associated enChIP

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare una regione genomica specifica mantenendo le interazioni molecolari, al fine di identificare le molecole che interagiscono con tale regione genomica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo delle funzioni genomiche, come la trascrizione e la regolazione epigenetica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'identificazione diretta delle molecole che interagiscono con una regione genomica specifica.

La procedura sarà dimostrata da Toshitsugu Fujita, un professore associato del mio laboratorio. Seguendo il protocollo testuale, progettare le molecole leganti il DNA di interesse. Ciò comporta la generazione della sequenza gBlock di interesse e il suo inserimento in un retrovirus, ad esempio, per produrre l'RNA guida complessato con tre FLAG-dCas9.

In alternativa, è possibile generare tre proteine FLAG-TAL che riconoscono la sequenza bersaglio. Successivamente, infettare le cellule con il retrovirus preparato seguendo il protocollo indicato nel testo. Confermare l'espressione delle molecole leganti il DNA ingegnerizzate e stabilire la linea cellulare.

Ora, procedere con l'incrocio dei legami cellulari mediante formaldeide. Sospendere 20 milioni di cellule trasfettate in 30 millilitri di mezzo di coltura normale e aggiungere 810 microlitri di formaldeide al 37% per ottenere una concentrazione finale dell'1%. Incubare la miscela per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, arrestare la reazione di cross-linking aggiungendo 3,1 millilitri di glicina 1,25 molare.

Lasciare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti prima di procedere. Successivamente, centrifugare il tubo delle cellule a 300 G per cinque minuti in una centrifuga refrigerata. Rimuovere con attenzione il soprannatante e lavare il pellet cellulare in 30 millilitri di PBS mediante mescolamento e centrifugazione.

Eseguire due lavaggi con PBS. Se necessario, il pellet lavato di cellule fissate può essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Proseguire quindi raccogliendo la cromatina dalle cellule.

Sospendili in 10 millilitri di buffer di lisi e incuba sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, utilizzando una centrifuga refrigerata, raccogli le cellule e scarta con attenzione il soprannatante. A questo punto, sospendi il pellet cellulare nel buffer di lisi nucleare e incuba sul ghiaccio per 10 minuti.

Ogni pochi minuti durante l'incubazione, vortexare brevemente la miscela. Nuovamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. A questo punto, lavare il pellet con 10 millilitri di PBS ed eliminare la soluzione di lavaggio con un'ulteriore centrifugazione.

Questo produce la frazione di cromatina e, se desiderato, può essere congelata rapidamente e conservata a meno 80 gradi Celsius. Procedere sospendendo il pellet di cromatina in 800 microlitri di buffer di lisi modificato tre e trasferire la sospensione in un tubo più piccolo da 1,5 millilitri. Ora, accendere una sonda per sonicazione al livello tre di potenza con ciclo continuo.

Per frammentare la cromatina, eseguire manualmente cicli alternati di 10 secondi di sonificazione e 20 secondi sul ghiaccio. Ogni 5° o 6° ciclo, estendere la fase sul ghiaccio a due minuti per evitare il surriscaldamento del campione. Ripetere questo ciclo di sonificazione da 10 a 18 volte, mantenendo la punta della sonda sollevata dal fondo del tubo per evitare la formazione di schiuma nel campione.

Dopo la sonificazione, raccogliere il campione mediante una rapida centrifugazione refrigerata. Successivamente, trasferire il surnatante contenente la cromatina frammentata in un nuovo tubo e scartare il pellet. Consultare il protocollo testuale per sapere come valutare la frammentazione.

Per preparare l'immunoprecipitazione, innanzitutto coniugare gli anticorpi ai Dynabeads. Questa immunoprecipitazione è proporzionata a campioni derivati da 20 milioni di cellule. Aggiungere un volume pari a 1/5 di tampone di lisi modificato tre con Triton X-100 alla cromatina frammentata per ottenere una concentrazione finale di 1% di Triton.

Successivamente, aggiungere la miscela alle microsferette magnetiche coniugate con IgG murina normale. Incubare la reazione per un'ora su un agitatore rotante in refrigerazione. Successivamente, attirare le microsferette dalla soluzione per tre minuti su un supporto magnetico.

Quindi, raccogliere il soprannatante. Trasferire il soprannatante nel tubo contenente le microsfere magnetiche coniugate con anticorpi anti-FLAG. Incubare questa reazione di coniugazione tutta la notte su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius.

Il mattino seguente, applicare un magnete al tubo per tre minuti per raccogliere le perle. Quindi, aspirare il soprannatante e scartarlo. A questo punto, lavare le perle.

Sospendere le perline in un millilitro di tampone a basso contenuto salino e incubare per cinque minuti su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, isolare le perline mediante magnetizzazione e scartare il soprannatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio con il tampone a basso contenuto salino un'altra volta.

Utilizzando la stessa tecnica, eseguire altri due lavaggi con tampone ad alto contenuto salino. Continuare utilizzando il metodo per lavare le perle due volte con tampone al cloruro di litio. Infine, lavare le perle con TBS-IGEPAL CA-630 una sola volta.

Dopo i sette passaggi di lavaggio, sospendere le perle in 200 microlitri di tampone di eluizione e incubarle a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, attirare le perle mediante magnetizzazione e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo. Ripetere questo passaggio di eluizione per aumentare i rendimenti.

Quindi, purificare circa il 5% del DNA per stimarne il rendimento. Iniziare mescolando la maggior parte dell'eluito in una reazione di precipitazione. Precipitare la cromatina per tutta la notte a meno 20 gradi Celsius.

Il giorno successivo, centrifugare il campione e scartare il soprannatante. Lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% e ripetere la centrifugazione per 10 minuti. Quindi, scartare il soprannatante e sospendere il pellet in 40 microlitri di tampone di campionamento 2x.

Ora, agitare il sospensione mediante vortex per cinque minuti completi. Successivamente, incubare a 100 gradi Celsius per 30 minuti per denaturare e invertire il cross-linking. Dopo l'ebollizione, caricare 40 microlitri del campione su un gel SDS-PAGE.

Di solito si utilizza un gradiente dal quattro al 20%. Far correre il gel fino a quando il colorante non ha percorso un centimetro al di sotto del pozzetto. Successivamente, colorare il gel e tagliarlo in cinque pezzi di circa 2 millimetri di lunghezza.

Diluire la proteina dai frammenti di gel e utilizzarla per l'analisi con spettrometria di massa. La purificazione dell'RNA, seguita dall'analisi di sequenziamento, è descritta nel protocollo testuale. Complessivamente, fino al 10% delle regioni genomiche bersaglio può essere purificato utilizzando l'enChIP.

Qui vengono mostrati i rendimenti delle analisi mirate alla regione promotore del gene IRF-01 rispetto al locus non specifico Sox2. Un altro esempio è il confronto tra i telomeri bersaglio e il locus non specifico di gamma-satellite. L'analisi enChIP con SILAC ha identificato diverse proteine associate al promotore di IRF-1 in maniera specifica per l'interferone gamma.

Sono stati inoltre identificati proteine leganti i telomeri mediante enChIP abbinato a spettrometria di massa. Il sequenziamento dell'RNA tramite enChIP è stato successivamente utilizzato per identificare gli RNA associati ai telomeri. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi della trascrizione e della regolazione epigenetica per esplorare tali meccanismi in diversi sistemi biologici.