Name: Un approccio semi-automatico di preparare anticorpi cocktail per lanalisi immunofenotipica di Human sangue periferico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Scopri un metodo semi-automatizzato per preparare cocktail di anticorpi destinati all'immunofenotipazione del sangue periferico umano. Questa tecnica riduce la variabilità sperimentale e migliora l'accuratezza della pipettatura rispetto alla preparazione manuale.

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Ringraziamo Hannah Puzas per l'assistenza nella progettazione e configurazione del sistema, e Kevin Khovananth per la consulenza tecnica. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da The Hearst Foundations e dalla Providence Portland Medical Foundation.

<ol><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Craig, F. E., Foon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+for+hematologic+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms.</a> Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).</li>
<li>Johansson, U., Bloxham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+the+use+of+multicolour+flow+cytometry+in+the+diagnosis+of+haematological+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms.</a> Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).</li>
<li>Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TruCount+Absolute-Count+Tubes+for+Determining+CD4+and+CD8+Cell+Numbers+in+Human+Immunodeficiency+Virus-Positive+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults.</a> Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).</li>
<li>Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%2C+immunology%2C+and+HIV+infection%3A+Three+decades+of+strong+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions.</a> Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).</li>
<li>Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Major+Peripheral+Blood+Leukocyte+Populations+for+Multicenter+Clinical+Trials+Using+a+Whole+Blood+Phenotyping+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay.</a> J. Vis. Exp. (67), e4302(2012).</li>
<li>Streitz, M., Miloud, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+whole+blood+immune+phenotype+monitoring+for+clinical+trials%3A+panels+and+methods+from+the+ONE+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Res%22%5BJournal%5D)">Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study.</a> Transplant. Res. 2 (1), 17(2013).</li>
<li>Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+whole+blood+phenotyping+assay+for+enumeration+of+peripheral+blood+leukocyte+populations+in+multicenter+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials.</a> J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).</li>
<li>Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+I+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).</li>
<li>O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+II+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).</li>
<li>Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+quality+control+of+immunophenotyping+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).</li>
<li>Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+for+flow+cytometric+immunophenotyping%3A+a+report+from+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases%2C+Division+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS.</a> Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).</li>
<li>Biancotto, A., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+human+immunome%3A+the+complexity+of+comprehensive+leukocyte+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).</li>
<li>Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+costimulation+in+antibody+deficiencies%3A+ICOS+and+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency.</a> Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).</li>
<li>Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare-Event+Analysis+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Med%22%5BJournal%5D)">Rare-Event Analysis in Flow Cytometry.</a> Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).</li>
<li>Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dimensional+flow+cytometry+for+comprehensive+leukocyte+immunophenotyping+%28CLIP%29+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).</li>
<li>Villanova, F., Di Meglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Lyoplate+Based+Flow+Cytometry+and+Computational+Analysis+for+Standardized+Immunological+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery.</a> PloS One. 8 (7), e65485(2013).</li>
<li>BD biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Optimizing+Experiments+Using+BD+Horizon+Brilliant+Polymer+Conjugates%22">Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates</a>. , (2014).</li>
<li>Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+a+Phospho-STAT5+Staining+Procedure+for+Flow+Cytometry+for+Application+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery.</a> J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).</li>
<li>Hasan, M., Beitz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+and+standardized+cytometric+procedures+for+multi-panel+and+multi-parametric+wholeblood+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping.</a> Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+harmonizing+flow+cytometry+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+immunol%22%5BJournal%5D)">A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials.</a> Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).</li>
</ol>

YK, ILG, TLM, WLM, DPH, e KSB: Non sono in competizione interessi finanziari. ANT è un dipendente di Beckman Coulter, Inc. La pubblicazione di questo articolo il video è sponsorizzato da Beckman Coulter, Inc.

Immunofenotipizzazione di sangue periferico è di fondamentale importanza per ottenere intuizioni risposte individuali a immunoterapia. La sfida consiste nel test di standardizzazione per controllare esperimento-to-esperimento variabilità 1,14. Una fonte di variabilità risiede nella manipolazione umana di campioni. Pertanto, è concepibile che l&#39;automazione parziale o totale del campione di trasformazione faciliterà una drastica riduzione esperimento a esperimento variabilità 1,14. In questo protocollo, riportiamo il nostro sforzo di successo per ridurre al minimo la variabilità del test con l&#39;introduzione di un gestore di liquido automatizzato dotato di lettore di codici a barre 2D per la colorazione del campione in tutto immunofenotipizzazione sangue. Nel disegno, il nostro metodo è versatile e può monitorare altri sottoinsiemi immuni con l&#39;aggiunta di ulteriori &quot;Cocktails base&quot; per definirli. Tali sottogruppi includono cellule T helper, le cellule T regolatorie, cellule B, le cellule NK, cellule dendritiche, monociti e (manoscritto inpreparazione) 18. Abbiamo adattato i pannelli di anticorpi raccomandati del consorzio con l&#39;introduzione di ulteriori marcatori 1. popolazioni cellulari sono stati identificati utilizzando &quot;Cocktail Base&quot; coniugato con fluorocromi con emissione minimo nella brillante viola 421 (BV421), ficoeritrina (PE), e allophycocyanin (APC) rilevatori, come abbiamo voluto riservare questi canali per il rilevamento di antigeni inducibile. Questa funzione non solo garantisce la sensibilità più alta per monitorare lo stato di attivazione delle cellule del sistema immunitario, ma consente anche una sistemazione flessibile di nuovi marcatori di attivazione come questi tre fluorocromi sono più frequentemente coniugati con anticorpi contro marcatori inducibile. Pertanto, il nostro metodo non è adatto solo per la preparazione di cocktail per tutta la immunofenotipizzazione sangue, ma è utile anche per la colorazione altri campioni, tra cui cellule mononucleari del sangue periferico e le cellule recuperate dai tessuti disaggregati (ad esempio, tumori). intro di successoproduzione del nostro metodo richiede una particolare attenzione ai passi in preparazione labware e programmazione ed esecuzione del metodo. Preparazione dei tubi di codici a barre 2D comprende l&#39;etichettatura con etichette leggibili e il trasferimento degli anticorpi ai tubi designati. Per evitare l&#39;introduzione di errori, si consiglia di fare questo con due persone. Ogni volta che cambia i fogli di calcolo, gli investigatori dovrebbero verificare se il metodo funziona correttamente. La scelta di adeguati metodi di dispensazione durante la programmazione assicura il trasferimento del liquido di successo. LLS consente pipettaggio senza ottenere detriti precipitati dal fondo dei tubi di anticorpi, per il quale usiamo o P50 o suggerimenti conduttivi P200. LLS non può essere una buona opzione per le punte P1000 come LLS è più sensibile con punte P1000 e, a volte falsamente innescato da presenza di bolle. Heights di definizione da laboratorio devono essere regolati per ogni strumento potrebbe verificarsi come non ottimale trasferimento di liquidi, ad esempio, se non c&#39;è abbastanza spazio tra il bordo di puntee il fondo dei tubi. Come mostrato in Figura 12, se il &quot;cocktail Base&quot; e / o &quot;Attivazione cocktail&quot; non sono in agitazione bene, può causare macchie subottimale. Abbiamo pensato di usare i reagenti liofilizzati per la colorazione delle cellule come un approccio alternativo per ridurre la variabilità connessi con il reagente di erogazione 19. Tuttavia, coniugati polimerici di coloranti viola brillanti sono noti per interagire gli uni con gli altri segnali non specifici che causano. Come tale, l&#39;aggiunta di più di due coniugati polimerici (ad esempio, BV421 e BV650 etc.) in reagenti liofilizzati possono provocare la segnalazione non specifico (ad esempio, l&#39;aumento del segnale BV650 sfondo in BV421 + popolazione) 20. Inoltre, i reagenti liofilizzati mancano di flessibilità per l&#39;inclusione nuova colorazione. Essi sono di solito più costosi e richiedono un ordine all&#39;ingrosso. Per queste ragioni, abbiamo scelto di utilizzare il gestore liquido automatizzato dotato di tubi di codici a barre 2D. Anche se tfiocchi tempo per impostare e comporta un investimento iniziale per l&#39;acquisto dello strumento, a lungo andare questi fattori saranno compensate da un aumento della produttività e la riproducibilità dei saggi. In effetti, alcuni gruppi precedentemente segnalato il successo dell&#39;integrazione del gestore liquido automatizzato nel flusso di lavoro di immunofenotipizzazione o applicazioni simili 21,22. soluzioni automatizzate per l&#39;analisi di citometria a flusso sono disponibili da fonti commerciali (FACS SPA III, Automated cocktail Preparazione Workstation, e FlowStainer) anche. Questo indica inoltre vi è un grande bisogno per la preparazione di cocktail automatizzata per immunofenotipizzazione. Dopo aver imparato questa tecnica, prevediamo che lo sviluppo di completamente automatizzato immunofenotipizzazione sangue intero ridurrà ulteriormente la variabilità esperimento a esperimento e potrebbe fare tutta la immunofenotipizzazione sangue realizzabile anche in un ambiente 23 trial clinico multicentrico. Abbiamo già iniziato a utilizzare un lyse erah assistente per automatizzare le fasi di lisi e lavaggio. Prevediamo inoltre che la determinazione automatica del volume di anticorpo nei tubi di codici a barre 2D e l&#39;inseguimento di erogazione del reagente migliorerà notevolmente l&#39;inventario di anticorpi ed il controllo di qualità nostro metodo, rispettivamente.

Immunofenotipizzazione di sangue periferico umano determina cambiamenti quantitativi e qualitativi in sottoinsiemi di cellule immunitarie 1. Esso permette di comprendere meglio i meccanismi di azione e di resistenza, la scoperta di biomarcatori predittivi aiuti, e facilita lo sviluppo di immunoterapie combinazione. Pertanto, la convalida e la standardizzazione di immunofenotipizzazione è una zona di notevole interesse per i ricercatori accademici, laboratori clinici, e le industrie. Anche se immunofenotipizzazione di sangue periferico con metodi citometria di flusso è attualmente utilizzato per la gestione clinica delle neoplasie ematologiche 2,3 e virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) 4,5, immunofenotipizzazione affidabile di sangue periferico per le richieste di immunoterapia considerazioni specifiche per la convalida e la standardizzazione perché richiede una più ampia copertura su sottoinsiemi di cellule del sistema immunitario e l&#39;attivazione / recettori inibitori 1,6-8. succeimmunofenotipizzazione ssful richiede un&#39;attenta standardizzazione per ridurre al minimo esperimento-to-esperimento variabilità legate alla configurazione dello strumento e la procedura di colorazione delle cellule 9,10. Mentre la standardizzazione delle impostazioni dello strumento per la citometria di flusso è ben definito per affrontare il primo problema 9,11,12, non è ancora chiaro come ridurre al minimo la variabilità legate alla colorazione delle cellule senza limitare la copertura di sottoinsiemi di cellule immunitarie e il loro stato di attivazione. Poiché il numero di antigeni da rilevare aumenta, così fa anche la possibilità di errore e variabilità causa ottimale erogazione di reagente e la contaminazione incrociata. Metodi per l&#39;analisi phenoptypic di sangue intero anticoagulato sono stati stabiliti alla fine del 1980 per l&#39;uso in test di laboratorio clinico. Questi stessi metodi servono le esigenze del laboratorio di ricerca per la preparazione del campione. Soprattutto, i cocktail di anticorpi utilizzati nel laboratorio clinico sono tipicamente meno complesse e avaOTTIMIZZARE LE OPPORTUNITÀ pre-titolato e pre-miscelato dal produttore. È necessario solo un unico trasferimento del cocktail di anticorpi pre-miscelato. Nell&#39;impostazione di ricerca, cocktail di anticorpi di 10-16 anticorpi sono tipici. Ogni cocktail deve essere convalidato per la stabilità dal laboratorio o preparato fresco prima di ogni test. Preparazione più cocktail di anticorpi per un campione potrebbe comportare la dispensazione di 50-80 singoli anticorpi, un compito che è sia noioso e soggetto a errori. Automazione di preparazione di cocktail ha diversi vantaggi rispetto preparazione di cocktail manuale come il minor numero di errori, una maggiore precisione di pipettaggio, e forse anche diminuito gli sprechi di reagente. Qui, si segnala il successo di un gestore di liquido automatizzato dotato di un (2D) lettore di codice a barre bidimensionale nel processo di cella-colorazione immunofenotipizzazione per ridurre al minimo la variabilità legate alla preparazione del campione.

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>Citometro a flusso</td>NXp Span-8 Stazione di <td></td></tr><tr><td>lavoro per l'automazione di laboratorio&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31839</td><td>Stazione di lavoro per l'automazione di laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Inserto, Provetta, 11 mm, Bianco, per Provette Microfughe da 1,5 ml (confezione da 25)</td><td>Coltro Beckman</td><td>373696</td><td>Accessorio per Provette a 24 posizioni per provette Microfuge.</td></tr><tr><td>Kit LLS</td><td>Beckman Coulter</td><td>719262</td><td>Fissare la parte inferiore del ponte nella stazione di lavoro per l'automazione del laboratorio per consentire il rilevamento del livello del liquido</td></tr><tr><td>Rack per tubi a 24 posizioni</td><td>Beckman Coulter</td><td>373661</td><td>Rack per tubi per contenere provette microfuge per cocktail di anticorpi o sangue</td></tr><tr><td>SACCHETTI PER AUTOCLAVE A RISCHIO BIOLOGICO 12 x 24 POLLICI ROSSO</td><td>LabMart</td><td>M111416</td><td>Sacchetti per autoclave monouso per la stazione di lavoro</td></tr> <tr><td>per l'automazione del laboratorioLettore di codici a barre 2D ad alta velocità VisionMate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1850</td><td>Lettore di codici a barre 2D</td></tr><tr><td>Tappatore/decapsulatore portatile a 8 canali con tappo a vite</td><td>Thermo Scientific</td><td>4105MAT</td><td>Per decapsulare e tappare provette con codici a barre 2D&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-335</td><td>Per la preparazione di cocktail o l'invio di campioni di sangue alla stazione di lavoro per l'automazione di laboratorio</td></tr><tr><td>CoolRack XT CFT24</td><td>biocision</td><td>BCS-534</td><td>Per contenere le provette.</td></tr><tr><td>Provette ambrate con tappo a vite a matrice da 1,0 ml in rack</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741AMB</td><td>Provette con codice a barre 2D per la conservazione di anticorpi fluorescenti coniugati con colorante</td></tr><tr><td>Puntali Biomek Span-8 P1000, conduttivi, presterili con barriera, 1.025 e micro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>987925</td><td>Suggerimenti per la workstation di automazione di laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Puntali Biomek Span-8 P50, conduttivi, pre-sterili con barriera, 50 & micro; l (Confezione da 10 rack)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01091</td><td>Suggerimenti per workstation di automazione di laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Puntali Biomek Span-8 P250, conduttivi, pre-sterili con barriera (confezione da 10 rack)</td><td>Beckman Coulter</td><td>394627</td><td>punte per workstation di automazione di laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACS Soluzione di lisi 10x Concentrato</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Lisi dei globuli rossi</td></tr><tr><td>Falcon Provette in polistirene a fondo tondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td>Provette per campioni</td></tr><tr><td>Anti-CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0038-42</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD4 PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>341654</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-TCRgd BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564156</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-TCRab BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563825</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD8 APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-CCR7 PE-CF594 BD Biosciences</td><td></td><td>562381</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD45RA PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337167</td><td>Pannello di cellule T effettrici (base)</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562804</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD278 (ICOS) Pe BD</td><td>Biosciences</td><td>557802</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD38 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340439</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD279(PD1) BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562516</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD357(GITR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5875-42</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD137(41BB) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550890</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD69 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562884</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD314 (NKG2D) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557940</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>Anti-CD134 (OX40) APC</td><td>BioLegend</td><td>350008</td><td>Pannello di cellule T effettrici (attivazione)</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Provette per la raccolta del sangue in plastica con eparina di sodio: Tappo convenzionale</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Per la raccolta del sangue</td></tr><tr><td>Albumina, siero bovino, frazione V, grado RIA ed ELISA</td><td>EMD Millipore</td><td>126593</td><td>Per tampone di lavaggio</td></tr><tr><td>a flusso Azide di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>Per tampone di lavaggio a flusso</td></tr><tr><td>Eparina, sale sodico</td><td>Affimetrix</td><td>16920</td><td>Per tampone di lavaggio a flusso</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS), 1x, con calcio, magnesio, senza rosso fenolo</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30588.02</td><td>Per tampone di lavaggio a flusso</td></tr></tbody></table>

un approccio semi-automatico di preparare anticorpi cocktail per l&#39;analisi immunofenotipica di human sangue periferico

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunofenotipizzazione di sangue periferico da flusso determina citometria a cambiamenti dello stato di frequenza e l&#39;attivazione dei leucociti periferici durante la malattia e il trattamento. Essa ha il potenziale per prevedere l&#39;efficacia terapeutica e di identificare nuovi target terapeutici. Tutta la colorazione del sangue utilizza il sangue non manipolata, che riduce al minimo gli artefatti che possono verificarsi durante la preparazione del campione. Tuttavia, tutta la colorazione sangue deve essere fatto sul sangue raccolto di recente per garantire l&#39;integrità del campione. Inoltre, è meglio preparare un cocktail di anticorpi nello stesso giorno per evitare la potenziale instabilità del tandem-coloranti e prevenire l&#39;interazione tra reagenti coloranti viola brillanti. Pertanto, tutta macchie di sangue richiede un&#39;attenta standardizzazione per il controllo di variabilità intra ed inter-sperimentale. Qui riportiamo dispiegamento di un gestore di liquido automatizzato dotato di (2D) lettore di codice a barre bidimensionale in un processo standard di rendere gli anticorpicocktail Y per citometria a flusso. Anticorpi sono stati trasferiti in provette 2D codice a barre disposte in un formato a 96 pozzetti e il loro contenuto compilato in un database. Il gestore liquido potrebbe quindi individuare le fiale di anticorpi fonte facendo riferimento a nomi di anticorpi all&#39;interno del database. Il nostro metodo eliminato coordinamento noioso per il posizionamento di tubi di anticorpi di origine. Ha fornito versatilità che consente all&#39;utente di cambiare facilmente qualsiasi numero di dati nel processo di erogazione di anticorpi come anticorpo specifico da usare, il volume e la destinazione modificando il database senza riscrivere scripting nel metodo software per ciascun test. Un proof of concept esperimento ha raggiunto una precisione eccezionale saggio inter e intra, dimostrano la preparazione replica di un 11-colore, il flusso 17-anticorpo citometria a test. Queste metodologie sono aumentate throughput complessivo di citometria a flusso saggi e facilitato la preparazione quotidiana delle complesse cocktail di anticorpi necessari per il feno dettagliatacaratterizzazione typic di sangue periferico non coagulato appena raccolti.

L'immunofenotipizzazione del sangue intero è indispensabile per monitorare il sistema immunitario umano. Tuttavia, il numero di reagenti necessari e l'instabilità di fluorocromi specifici nei cocktail premiscelati richiedono la preparazione quotidiana dei reagenti. Qui dimostriamo che la preparazione semi-automatica del cocktail di anticorpi coloranti aiuta a stabilire un'immunofenotipizzazione affidabile riducendo al minimo la variabilità nella dispensazione del reagente.

Un approccio semi-automatico di preparare anticorpi cocktail per l&#39;analisi immunofenotipica di Human sangue periferico

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

L'obiettivo generale di questo protocollo semi-automatizzato di preparazione di cocktail di anticorpi con colorazione è quello di stabilire un metodo di immunofenotipizzazione affidabile per ridurre al minimo la variabilità dell'erogazione dei reagenti. Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo dell'immunomonitoraggio, come ad esempio: come controllare la variabilità intra e inter-sperimentale derivante dalla dispensazione dei reagenti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'automazione della preparazione del cocktail aumenta l'accuratezza del pipettaggio, riducendo al contempo gli errori della preparazione manuale del cocktail. A dimostrare la procedura sarà Iliana Gonzalez, un tecnico del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, applicare etichette leggibili all'uomo sulle provette con codice a barre 2D. Successivamente, trasferire l'intero contenuto di ogni flaconcino di anticorpi nelle apposite provette con codice a barre 2D corrispondenti, facendo attenzione a evitare bolle. Quando gli anticorpi sono stati trasferiti, utilizzare il lettore di codici a barre 2D per leggere le provette. Quindi, crea un foglio di calcolo contenente i nomi degli anticorpi e le letture dei codici a barre e salva il foglio di calcolo come file di valori separati da virgole. A questo punto, avvia il lettore di codici a barre 2D e quindi il gestore automatico di liquidi. Per adescare le siringhe del manipolatore automatico di liquidi, in Strumento, selezionare Home Tutti gli assi.Verificare che nessuna delle siringhe contenga bolle d'aria visibili. Quando le siringhe sono innescate, aprire i metodi per preparare il cocktail di base e il cocktail di attivazione nel software di gestione automatica dei liquidi. Quindi, posizionare le provette per microfuge nelle provette per microfuge per il cocktail di base e il cocktail di attivazione, in base al numero di cocktail di base e di attivazione da preparare. Utilizzare lo schema di configurazione dello strumento come riferimento per posizionare i rack per tubi sul ponte. Posizionare il serbatoio del tampone nella sezione appropriata del ponte e utilizzare un decapsulatore con tappo a vite a otto canali per decapsulare le provette con codice a barre 2D contenenti gli anticorpi. Per evitare la contaminazione incrociata, posizionare ciascun tappo in un vassoio porta tappi man mano che vengono rimossi, per mantenere i tappi nell'ordine appropriato. Quindi posizionare i puntali del filtro P50 LLS, i puntali del filtro P200 LLS, i puntali P1000 e il rack per provette Matrix da 1 ml sul ponte nelle posizioni appropriate. Fare clic sull'icona di avvio per avviare il metodo. Quando viene visualizzata la finestra popup, verificare che tutti gli elementi sul deck corrispondano allo schema di configurazione dello strumento per il metodo. Se tutto è in posizione, fare clic su OK. Il manipolatore automatico di liquidi trasferirà il tampone dal serbatoio ai tubi di microfuga. Il rack per provette Matrix da 1 ml passerà al lettore di codici a barre 2D e i codici a barre verranno letti. Quando tutti i codici a barre sono stati letti, fare clic su OK nella finestra popup per iniziare il trasferimento degli anticorpi. Al termine del trasferimento, utilizzare il decapsulatore con tappo a vite a otto canali per richiudere le provette con codice a barre 2D e riportare le provette a 4

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Immunologia e Infezioni

Questo video descrive una tecnica di immunodosaggio che utilizza microsfere magnetiche fluorescenti accoppiate con diversi antigeni per rilevare simultaneamente vari isotipi di anticorpi in un campione di siero. Il test è utile per comprendere la sieroconversione durante un'infezione o dopo la vaccinazione.

Saggio Immunobead Multianalita: una tecnica di immunodosaggio basata sul flusso per la rilevazione concomitante di più sottotipi di anticorpi in un campione di siero umano

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Valutazione funzionale delle cellule B secernenti anticorpi mediante saggio ELISpot

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Un test di citometria a flusso per identificare sottogruppi di cellule immunitarie nelle cellule mononucleate del sangue periferico

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Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

Un metodo semplice ma efficace che si avvale di nanoparticelle magnetiche per rilevare e arricchire le cellule B antigene-reattiva per l'analisi funzionale e fenotipica è descritto.

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

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Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.

Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

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Metodo di screening a singola cellula per la selezione e il recupero di anticorpi con specifiche desiderate da popolazioni di cellule di memoria umana b arricchite

Scopri un metodo semi-automatizzato per preparare cocktail di anticorpi destinati all'immunofenotipazione del sangue periferico umano. Questa tecnica riduce la variabilità sperimentale e migliora l'accuratezza della pipettatura rispetto alla preparazione manuale.

Un approccio semi-automatico di preparare anticorpi cocktail per l'analisi immunofenotipica di Human sangue periferico

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