Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di controllare il potenziale della membrana cellulare in seguito alla stimolazione mediante impulsi di luce visibile. Il processo di fototrasduzione è mediato da un polimero coniugato sensibile alla luce. Questo metodo fornisce un nuovo strumento nel campo delle tecnologie in quanto rappresenta una valida alternativa ai metodi esistenti come l'optogenetica e la stimolazione termica per il controllo ottico dell'attività delle cellule viventi.

I principali vantaggi di questa tecnica sono la pronta integrabilità con qualsiasi tipo di elettrofisiologo, la risoluzione speciale e temporale potenzialmente elevata, riducono l'invasività. Inoltre, permette di evitare un trasferimento genico richiesto dall'optogenetica. Il nostro metodo è descritto qui per la fotostimolazione di colture cellulari in vitro.

Ma potrebbe anche aprire interessanti opportunità per applicazioni in vivo. A dimostrare la procedura saranno Caterina Bossio e Susana Vaquero Morata a post-doc dei nostri laboratori con background rispettivamente in chimica biologica e fisica. Per iniziare, preparare una soluzione del polimero coniugato sensibile alla luce mescolando P3HT e PCBM in clorobenzina a una concentrazione relativa di uno a uno.

Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico per almeno quattro ore a 60 gradi Celsius. Successivamente, pulire i vetrini rivestiti di ossido di indio e stagno con bagni consecutivi di 10 minuti di acqua deionizzata, acetone e isopropanolo in un sonicatore. Asciugare i vetrini di copertura con una pistola ad azoto, quindi trattare i substrati con un detergente al plasma.

Una volta pulita, posizionare la slitta sul mandrino di una spincoater, con il lato rivestito in ITO rivolto verso l'alto. Quindi, aggiungere 150 microlitri della soluzione P3HT PCBM al vetrino e rivestire il campione. Dopo che lo spincoater è stato rifinito, rimuovere il campione e utilizzare un tampone per camera bianca imbevuto di acetone per pulire il retro del substrato.

Sterilizzare i substrati fotoattivi mettendoli in un contenitore coperto resistente al calore e riscaldandoli a 120 gradi Celsius per due ore. Quindi trasferire i campioni in una cappa sterile e lasciarli raffreddare. Da questo punto in poi, mantenere la sterilità dei campioni.

Posizionare i substrati fotoattivi in una piastra a sei pozzetti. Data l'idrofobicità dello strato polimerico coniugato, creare un pozzetto di polidimetilsilossano per fissare il campione e confinare le soluzioni come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, posizionare i substrati fotoattivi nei pozzetti della piastra e coprire l'intera superficie di ciascun campione con 500-750 microlitri di una soluzione di due milligrammi per litro di fibronectina in PBS.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere la soluzione di fibronectina, quindi lavare i substrati una volta con due millilitri di PBS. Innanzitutto, aggiungere un volume totale da 750 a 1.000 microlitri di terreno di coltura completo per pozzetto.

Quindi, piastrate 15.000 cellule AGK293 per centimetro quadrato di substrato fotoattivo in ciascun pozzetto. Quindi, incubare le cellule per 24-48 ore. Le cellule possono essere facilmente coltivate sui substrati fotoattivi, a condizione che venga depositato uno strato di adesione adeguato, come la fibronectina.

Per iniziare, preparare sia la soluzione extracellulare che quella intracellulare come descritto nel protocollo di testo allegato. Sterilizzare le soluzioni facendole passare attraverso un filtro da 0,2 micron. Quindi, preriscaldare la soluzione extracellulare mettendola in un bagnomaria a 37 gradi Celsius.

Inoltre, riempire una siringa da un millilitro con la soluzione intracellulare e dotarla di un ago calibro 34. Mantenere la soluzione intracellulare a contatto con il ghiaccio per evitare la degradazione dell'ATP. Quindi, prelevare un substrato rivestito di cellule dall'incubatore e rimuovere con cura il PDMS.

Quindi rimuovere il terreno di coltura con una pipetta di vetro e sciacquare lentamente il campione con una soluzione extracellulare per evitare il distacco delle cellule. Aggiungere tre millilitri di soluzione extracellulare a ciascun pozzetto e quindi trasferire la piastra nel portacampioni della stazione di elettrofisiologia. Una volta posizionato, posizionare l'elettrodo di riferimento nel pozzetto da testare.

Quindi, preparare una micropipetta di vetro fresca per patch clamp utilizzando un estrattore per micropipette. Riempire metà della pipetta con la soluzione intracellulare. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la pipetta patch in prossimità della membrana cellulare selezionata.

Durante il posizionamento, applicare una sovrapressione sulla pipetta per evitare che lo sporco si attacchi al puntale. Con la pipetta a pochi micron sopra la cellula, iniziare ad abbassare la pipetta verso la membrana cellulare controllando la resistenza della pipetta sul software di controllo dei patch. Quando la resistenza della pipetta aumenta di circa un megaohm, rimuovere la sovrapressione e applicare un'aspirazione delicata per formare il gigaseal tra la pipetta e la membrana cellulare.

Quindi, applicare un potenziale negativo di 40 millivolt negativi alla pipetta per stabilizzare la tenuta. Compensare la transitorietà capacitiva dovuta alla capacità della pipetta con i relativi comandi sull'amplificatore di patch e/o sul software di controllo patch. Applicare un impulso di aspirazione breve e intenso alla pipetta per rompere la membrana e consentire l'accesso elettrico al citoplasma cellulare.

Quindi, impostare l'amplificatore patch in modalità pinza amperometrica in modo che non venga iniettata corrente nella cella. In modalità current clamp, tracciare il potenziale della membrana cellulare e attendere alcuni minuti affinché si stabilizzi. Una volta stabile, applicare il protocollo di illuminazione desiderato alla cella illuminando la membrana fotoattiva sotto la cella con una luce compresa tra 450 e 600 nanometri.

Registra l'effetto della luce sul potenziale di membrana. Brevi impulsi di luce di circa 10-20 millisecondi provocano una depolarizzazione transitoria della cellula, mentre con un'illuminazione prolungata nell'ordine di centinaia di millisecondi si osserva un'iperbolizzazione fino a quando la luce non viene spenta. La stimolazione ottica delle cellule mediata dai substrati fotoattivi può provocare effetti diversi sulla membrana cellulare, a seconda della durata dello stimolo luminoso.

Un picco veloce, come quello mostrato qui, è seguito da una depolarizzazione transitoria dell'ordine di decine di millisecondi. Per brevi impulsi di luce quando la luce è spenta, si osserva un comportamento opposto. Questi segnali sono stati attribuiti a una variazione della capacità della membrana dovuta al riscaldamento locale in seguito all'assorbimento della luce.

Per un'illuminazione prolungata, la depolarizzazione iniziale si trasforma in un'iperpolarizzazione cellulare. Questo fenomeno ha ancora una volta un'origine termica, ma in questo caso è correlato a una variazione del potenziale di equilibrio della membrana dovuta a una variazione delle conducibilità del canale ionico indotta dall'aumento della temperatura. È importante notare che questa tecnica è abbastanza flessibile e può essere adattata alle esigenze particolari di un esperimento specifico, ad esempio modificando il polimero fototossico, il processo di fabbricazione o il protocollo di illuminazione.

Tuttavia, prima di modificare il protocollo, è necessario verificare le proprietà importanti del polimero attivo come la sua biocompatibilità, l'idoneità al processo di sterilizzazione, la stabilità elettrochimica e temporale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare un'interfaccia ibrida tra polimeri connettivi e cellule viventi e di come usarla per il controllo ottico dell'attività cellulare. Crediamo che questa tecnica prometta anche di diventare uno strumento complementare nelle neuroscienze per le indagini in vitro e anche di aprire una nuova prospettiva per le applicazioni in vivo.

Per perfezionare il protocollo, tuttavia, è necessario uno sforzo forte e congiunto da parte di scienziati dei materiali e neuroscienziati, fisici e medici.