Name: Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri come controllare l'attività elettrica delle cellule viventi mediante stimolazione ottica con polimeri coniugati sensibili alla luce. Questo metodo non invasivo offre un'alternativa all'optogenetica per la ricerca in neuroscienza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro è stato sostenuto dall'UE attraverso il progetto FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italia (sovvenzioni GGP12033 e GGP14022), Fondazione Cariplo (ID sovvenzione 2013-0738).

1. Preparazione di substrati fotoattivi <ol><li> Preparare una P3HT: soluzione PCBM (1: 1 w / w) in clorobenzene ad una concentrazione di 20 g P3HT / L. Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico per almeno 4 ore a 60 ° C. Consideriamo un volume di 150 ml di soluzione per ciascun substrato da preparare. </li><li> Pulire vetrini ITO rivestite (R s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, spessore 170 micron), con bagni consecutivi di acqua deionizzata, acetone e isopropanolo in un sonicatore (10 min per ogni passo). Asciugare il coprioggetto con una pistola di azoto. Mettere i campioni in un pulitore di plasma a 100 W di potenza per 10 min. </li><li> Depositare un film sottile dello strato attivo sui substrati puliti tramite spin-coating. <ol><li> Con una punta di diamante, tagliare un vetrino da microscopio, (spessore ≈ 1 mm) per le stesse dimensioni laterali dei substrati rivestiti ITO-. Rimuovere il P3HT: soluzione PCBM dalla piastra e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Impostare un due steps programma di spin-coater: i) 30 sec a 800 rpm; ii) 30 sec a 1.600 giri al minuto. Posizionare il vetrino sul mandrino dello spin-verniciatore e avviare il vuoto per risolvere il problema. Mettere una goccia di acetone sul vetrino e quindi il substrato pulito, con il lato ITO rivestito rivolto verso l&#39;alto. Avviare la rotazione di spin-coater per sbarazzarsi di acetone in eccesso. </li><li> Mettere 150 ml di P3HT: soluzione PCBM sui substrati e riprendere lo spin-coater (usare lo stesso protocollo descritto in 1.3.2). </li><li> Dopo lo spin-verniciatore ha finito, rimuovere il campione e staccare con cura il substrato rivestito dal vetrino. Pulire la parte posteriore del substrato con un tampone camera bianca immerso in acetone. Nota: I substrati fotoattivi possono essere conservati per alcuni giorni in una scatola buia fino all&#39;uso. Per periodi più lunghi, tenerli in un cassetto portaoggetti con gas inerte. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di coltura cellulare e Elettrofisiologia Solutions <ol><li> Preparare il terreno di coltura completo (CGM) perCellule HEK-293: Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) termicamente inattivati, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Sterilizzare il mezzo con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione extracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 135 NaCl, KCl 5.4, 5 HEPES, 10 glucosio, 1.8 CaCl 2, 1 MgCl 2. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione intracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 12 KCl, 125 K-gluconato, 1 MgCl 2, 0.1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Si noti che l&#39;ATP-Na 2 è sensibile al calore e aggiungerlo scorso. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron, aliquota in 1 ml provette e conservare a -20 ° C. </li></ol> 3. placcatura cellule HEK-293sui substrati attivi <ol><li> Posizionare il substrato fotoattivi in ​​un bicchiere di vetro rivestito con alluminio o una piastra di Petri chiusa e messo in stufa a 120 ° C per 2 ore per la sterilizzazione. Da questo momento in poi, eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili. Mettere i campioni in una cappa sterile e lasciarli raffreddare. </li><li> Coat substrato fotoattivi con uno strato di adesione per ridurre l&#39;idrofobicità superficiale e di promuovere l&#39;adesione cellulare. <ol><li> Posizionare i substrati attivi in ​​una capsula di Petri P35 o un piatto pozzetti 6. Data l&#39;idrofobicità dello strato polimero coniugato, fare un polidimetilsilossano (PDMS) e fissare il campione e confinare le soluzioni. <ol><li> Mescolare PDMS e catalizzatore in 10: 1 proporzione con una bacchetta di vetro per ottenere un impasto viscoso. </li><li> Versare l&#39;impasto in una piastra multipozzetto 6, erogazione quantità sufficiente a coprire la metà di ciascun pozzetto. </li><li> Attendere PDMS polimerizzazione a temperatura ambiente. </li><li> Tagliare il PDMS curati in mezzo per obtaining una forma quadrata della stessa dimensione del campione di polimero. </li><li> Sterilizzare il PDMS pozzetti per immersione in una miscela etanolo-acqua 70% per almeno 30 min. </li></ol></li><li> Se si utilizza bene le PDMS, graffiare lo strato fotoattivo lungo tutto il bordo del pozzetto con pinzette a punta, in modo da evitare il distacco dello strato intero quando si rimuovono le PDMS bene dopo coltura cellulare. </li><li> Coprire l&#39;intera superficie di ciascun campione con una soluzione di fibronectina (2 mg / L in PBS). Un volume tra 500-750 microlitri per campione è di solito sufficiente se un PDMS pozzo viene utilizzato (chiaro superficie del pozzetto: 15x15 mm 2). Senza le PDMS oltre, sono necessarie per immergere completamente il campione di circa 2 ml di soluzione di fibronectina; prestare attenzione che il substrato non galleggia durante l&#39;aggiunta della soluzione. Incubare i campioni a 37 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Rimuovere la soluzione fibronectina con una pipetta di vetro e lavare una volta con 2 ml di PBS. </li></ol></li><li> Plate cellule HEK-293 sui campioni fibronectina trattata ad una densità di 15.000 cellule / cm 2 in terreno di coltura completo. Utilizzare un volume di 750-1,000 ml di CGM per ciascun campione se un PDMS bene è utilizzato, altrimenti 2-3 ml di CGM sono necessari. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24-48. </li></ol> 4. ottico Stimolazione protocollo e misurazioni elettrofisiologiche <ol><li> Mettere la soluzione extracellulare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per thermalize; scongelare la soluzione intracellulare, metterlo in una siringa da 1 ml con un ago calibro 34 e tenerlo a contatto con il ghiaccio per evitare il degrado della ATP. </li><li> Prendete un substrato cellulare rivestito dal termostato, togliendo con cura il PDMS bene se presente. Rimuovere il terreno di coltura con una pipetta di vetro e risciacquare il campione con una soluzione extracellulare. Procedete lentamente per evitare il distacco delle cellule. </li><li> Mettere il dispositivo nel campione-titolare della stazione di elettrofisiologia con solutio extracellularen e l&#39;elettrodo di riferimento. Preparare micropipette di vetro freschi per patch-clamp con un estrattore (resistenza ideale è nel range 2-4 MW). Riempire la metà della pipetta con la soluzione intracellulare e montarlo sul micromanipolatore. </li><li> Cercare una cellula sana di patch sul dispositivo. Per evitare eccitazione indesiderato del substrato fotoattivi, utilizzare illuminazione IR per l&#39;imaging, ponendo un filtro passa-lunghezza d&#39;onda (ad esempio, un taglio di lunghezza d&#39;onda λ = 750 nm può essere utilizzato per i polimeri che assorbono nel visibile) davanti dell&#39;illuminatore microscopio. </li><li> Patch la cella selezionata e applicare il protocollo desiderato per la stimolazione ottica fornendo luce per il campione attraverso il percorso di fluorescenza di eccitazione del microscopio (Figura 1). Una descrizione dettagliata del protocollo patch-clamp può essere trovato in riferimento 20. <ol><li> Posizionare la pipetta di patch in prossimità della membrana cellulare con un manipolatore micrometrica. Durante il posizionamento, applicare overpressure alla pipetta per evitare incollamenti sporcizia sulla punta. La pipetta deve essere pochi micron sopra la cella. </li><li> Avviare abbassando la pipetta verso la membrana cellulare controllando la resistenza pipetta sul software di controllo patch. Quando la resistenza pipetta è aumentata di circa 1 MW, rimuovere la sovrapressione dalla pipetta durante l&#39;applicazione di una aspirazione delicata, per formare la gigaseal fra la pipetta e la membrana cellulare (cioè, la resistenza misurata deve aumentare a valori superiori a 1 GΩ) . </li><li> Applicare un potenziale negativo per la pipetta vicino alla cella di attesa potenziale di riposo (per HEK293 cella un potenziale di -40 mV possono essere utilizzati) per contribuire a stabilizzare la tenuta. Compensare i transitori capacitivi causa delle capacità di pipetta con i comandi relativi sull&#39;amplificatore cerotto e / o il software di controllo patch. </li><li> Rompere la membrana per consentire l&#39;accesso elettrico al citoplasma cella applicando un impulso di breve e intensa aspirazionealla pipetta. Impostare l&#39;amplificatore patch clamp modalità corrente (I = 0, cioè, senza corrente iniettata nella cellula) per monitorare il potenziale di membrana cellulare. Attendere pochi minuti per vedere se il potenziale cella è stabile. </li><li> Applicare il protocollo illuminazione desiderata per la cella e registrare l&#39;effetto sul potenziale di membrana. Nota: L&#39;illuminazione può essere consegnato al campione sia dal basso o dall&#39;alto, a seconda dell&#39;architettura microscopio. <ol><li> Selezionare una lunghezza d&#39;onda di eccitazione che viene ben assorbita dal materiale attivo; per il P3HT: PCBM miscela, una lunghezza d&#39;onda nell&#39;intervallo 450-600 nm può essere utilizzato. Densità photoexcitation adatti sono nell&#39;intervallo 10-100 mW / mm 2. Nota: impulsi brevi di luce (sotto 10-20 msec) risultato in una depolarizzazione transitoria della cellula, mentre con illuminazione prolungata (centinaia di millisecondi o impulsi più lunghi) una iperpolarizzazione sostenuta si osserva fino a quando la luce è spenta. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Alivisatos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotools+for+Neuroscience+and+Brain+Activity+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping.</a> ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).</li>
<li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).</li>
<li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+Light+on+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Shedding Light on Living Cells.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+semiconductors+for+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Organic semiconductors for artificial vision.</a> J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).</li>
<li>Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic-based+tristimuli+colorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organic-based tristimuli colorimeter.</a> Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509(2007).</li>
<li>Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+Organic+Electronics+in+Biology%3A+Materials+and+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroGrid%3A+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).</li>
<li>Campana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+Recording+with+Conformable+Organic+Electrochemical+Transistor+Fabricated+on+Resorbable+Bioscaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold.</a> Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).</li>
<li>Bonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lysinated+Thiophene-Based+Semiconductor+as+a+Multifunctional+Neural+Bioorganic+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2015).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+organic+transistor+structure+for+bidirectional+stimulation+and+recording+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons.</a> Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).</li>
<li>Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rise+of+Organic+Bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Rise of Organic Bioelectronics.</a> Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).</li>
<li>Pires, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+by+electrical+stimulation+using+a+cross-linked+PEDOT+substrate%3A+Expanding+the+use+of+biocompatible+conjugated+conductive+polymers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Gen.+Subjects%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering.</a> BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+bioorganic+interface+for+neuronal+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation.</a> Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymer+optoelectronic+interface+restores+light+sensitivity+in+blind+rat+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas.</a> Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+of+Whole-Cell+Conductance+in+Primary+Rat+Neocortical+Astrocytes+Mediated+by+Organic+Semiconducting+Thin+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films.</a> Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).</li>
<li>Martino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cellular+stimulation+in+functional+bio-polymer+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces.</a> Sci. Rep. 5 (8911), (2015).</li>
<li>Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+solid-liquid+polymer+photodiode+for+the+bioenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment.</a> Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501(2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+Neuroscience.+Patch+Clamp+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+Studies+of+Functionalized+Regioregular+Poly%283-hexylthiophene%29+Layers+for+Sensing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications.</a> Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).</li>
<li>Bellani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+P3HT%2FOxygen+Charge+Transfer+Complex+Identification+in+Thin+Films+Exposed+to+Direct+Contact+with+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+neural+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of neural tissue in vivo.</a> Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).</li>
<li>Duke, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+selective+suppression+of+neural+activity+with+infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Transient and selective suppression of neural activity with infrared light.</a> Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Passaggi critici del protocollo riportato in vitro per stimolazione ottica di cellule riguardano principalmente la scelta del polimero fotosensibile, i parametri di sterilizzazione termica, l&#39;intensità e la durata di stimoli luminosi. A P3HT: film sottile PCBM stato selezionato qui, dal momento che garantisce una buona stabilità temporale e elettrochimica. Tuttavia, si dovrebbe notare che non tutti i polimeri fotosensibili in grado di offrire prestazioni analogici, 22 più specificamente su illumi...

La possibilità di manipolare l&#39;attività cellulare con una risoluzione spaziale e temporale preciso rappresenta una strategia fondamentale nella ricerca neuroscientifica e nel trattamento di disturbi neurologici e psichiatrici. 1 metodi tradizionali si basano sulla stimolazione elettrica delle cellule utilizzando elettrodi posizionati in prossimità o in contatto con il sistema mirato, 2 che può essere di diversa complessità (singola cellula, rete cellulare, sezioni di cervello, in vivo tessuti cerebrali). Nel secolo scorso, l&#39;uso di patch-clamp, metallo e elettrodi substrato integrato hanno fornito un quadro dettagliato della fisiologia e fisiopatologia dei singoli neuroni e dei meccanismi di funzionamento delle reti neurali. Tuttavia, la stimolazione elettrica soffre di importanti limitazioni. Il primo è legato a una risoluzione spaziale generalmente scarsa a causa delle dimensioni fisiche degli elettrodi e la loro geometria fissa, che non può essere facilmente adattatoa sistemi organizzati complessi come i tessuti biologici. Inoltre, i problemi relativi alla impedenza elettrodi e di cross-talk tra sistemi di stimolazione e di registrazione possono deteriorare il rapporto finale segnale-rumore delle misurazioni. 3 D&#39;altra parte, l&#39;uso di luce per stimolazione può contribuire a superare molte limitazioni dell&#39;approccio elettrico. Prima di tutto, offre spaziale senza precedenti (&lt;1 um) e risoluzione temporale (&lt;1 msec), rendendo possibile bersaglio specifici tipi cellulari o anche compartimenti sub-cellulari. Inoltre è altamente non invasiva poiché evita qualsiasi contatto fisico con il tessuto di interesse e districa stimolazione da registrazione. Inoltre, sia l&#39;intensità della luce e lunghezza d&#39;onda può essere regolata con precisione e possono essere applicati protocolli di stimolazione così diverse. 3,4 Tuttavia, la maggior parte delle cellule animali non presentano alcuna sensibilità specifica alla luce. Diverse strategie per stimulatio ottican sono stati quindi proposti, sia sfruttando mediatori molecolari fotosensibili nelle vicinanze o all&#39;interno delle cellule, o utilizzando un dispositivo fotoattivi collocato esternamente, vicino alla cella. La prima categoria si riferisce a meccanismi endogeni come la stimolazione tramite (IR) di luce visibile o infrarossa, così come l&#39;uso di composti photoisomerizable / photocleavable o l&#39;espressione genetica di attuatori molecolari fotosensibili (optogenetics). Quest&#39;ultima categoria comprende tecniche di stimolazione esogena ottenuta con l&#39;uso di nano / micro-particelle inorganiche o substrati di silicio fotoconduttori. 5 Tuttavia, tutti questi sistemi hanno lati luminosi e svantaggi. In particolare, l&#39;assorbimento endogena di cellule nel visibile è debole e non affidabile, e la generazione contemporanea di specie reattive dell&#39;ossigeno può essere dannoso per la cella. In generale, IR viene utilizzato per indurre il riscaldamento termico locale dovuto all&#39;assorbimento di acqua, ma il coefficiente di estinzione dell&#39;acqua è piccola, richiedendo così strong luce infrarossa (da decine a centinaia di W / mm 2) che è difficile da trasportare via ottica microscopio standard e può comportare problemi di sicurezza per le applicazioni in-vivo. D&#39;altra parte, foto-commutabile ingabbiamento composti hanno un&#39;azione limitata tempo e spesso richiedono la luce UV che è difficile da trasportare a causa della penetrazione tissutale limitata. Inoltre essi soffrono di problemi di diffusione dei composti attivati ​​su fotolisi fuori dell&#39;area illuminata. Infine, gli strumenti optogenetic hanno permesso agli scienziati di indirizzare sottopopolazione cellulare specifico e sotto-scompartimenti e stanno rapidamente emergendo come una delle tecnologie chiave nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, l&#39;inserimento di un segmento di DNA esogeno tramite un vettore virale solleva importanti problemi di sicurezza, soprattutto in vista di adozione su pazienti umani. 5,6 Per queste ragioni, la ricerca di nuovi materiali e dispositivi in grado di cellula manipolazione ottica è un argomento estremamente caldo. Recentemente, un romanzo, è stato proposto approccio basato sull&#39;uso di polimeri coniugati fotosensibili, in grado di trasdurre efficientemente uno stimolo ottico in una modulazione di cellula attività elettrica. La stimolazione delle cellule da Polymer fotoeccitazione (CSPP) tecnica sfrutta molte caratteristiche chiave di abilitazione tipico di semiconduttori organici: sono intrinsecamente sensibili alla luce nel campo del visibile, 7 sono biocompatibili, morbida e adattabile e la loro flessibilità meccanica permette un&#39;interfaccia intima con tessuti sia in vitro e in vivo 8-10. Oltre a questo, possono essere facilmente funzionalizzati per meglio adattarsi all&#39;interfaccia con cellule viventi, e per consentire l&#39;eccitazione specifico, sondando e sentendo capacità. 11,12 Inoltre, essi sostengono elettronica e trasporto ionico, che li rende ideali per la combinazione dell&#39;elettronica annuncio biologia. 13,14 interessante, possono lavorare in modalità fotovoltaico, evitando la necessità di applicare una polarizzazione esterna fo la stimolazione ottica cella efficiente. 15 L&#39;affidabilità della tecnica CSPP è già stata dimostrata in diversi sistemi, compresi i neuroni primari, 15,16 astrociti, 17 linee di cellule secondarie 18 e tessuti retinici espiantati. 16 In questo lavoro, tutti i passi necessari per fabbricare un biopolimero sensibile alla luce interfaccia 19 per la stimolazione ottica di sistemi in vitro sono descritte in dettaglio. Come caso di studio, una miscela fotovoltaico organico prototipo di regione-regolare poli (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), che funge da donatore di elettroni, e fenil estere-C61-butirrico acido-metile (PCBM), in qualità di accettore di elettroni è impiegato. Poiché il sistema biologico, sono utilizzati embrionali umane di rene (HEK-293) le cellule. Viene fornito un esempio di un protocollo fotostimolazione con la relativa registrazione dell&#39;attività delle cellule tramite misurazioni elettrofisiologiche. La piattaforma descrittaè tuttavia di validità generale, e può essere facilmente esteso per l&#39;uso di altri polimeri coniugati (regolando correttamente il processo di soluzione preparazione ei parametri di deposizione), diversi tipi di cellule (modificando adeguatamente il protocollo coltura cellulare, placcatura procedura e il tempo richiesto per la semina e la proliferazione delle cellule), e diversi protocolli di stimolazione (lunghezza d&#39;onda della luce, frequenza stimoli e durata, densità fotoeccitazione).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>Substrati rivestiti ITO</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>clorobenzene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>alcool isopropilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>celle</td><td>HEK LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati polimeri

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Le interfacce ibride tra semiconduttori organici e tessuti viventi rappresentano un nuovo strumento per applicazioni in vitro e in vivo. In particolare, i polimeri coniugati mostrano diverse proprietà ottimali come substrati per sistemi biologici, come una buona biocompatibilità, eccellenti proprietà meccaniche, una tecnologia di lavorazione economica e facile e la possibilità di deposizione su substrati leggeri, sottili e flessibili. Questi materiali sono stati impiegati per interfacce cellulari come sonde neurali, transistor per l'eccitazione e la registrazione dell'attività neurale, biosensori e attuatori per il rilascio di farmaci. Recenti esperimenti hanno anche dimostrato la possibilità di utilizzare polimeri coniugati per la modulazione completamente ottica dell'attività elettrica delle cellule. Sono stati riportati diversi casi di studio in vitro, tra cui reti neuronali primarie, astrociti e cellule della linea secondaria. Inoltre, è stato dimostrato che la fototrasduzione del segnale mediata da polimeri organici ripristina la sensibilità alla luce nelle retine degenerate, suggerendo che questi dispositivi potrebbero essere utilizzati per protesi retiniche artificiali in futuro. Nel complesso, i polimeri coniugati sensibili alla luce rappresentano un nuovo approccio per la modulazione ottica dell'attività cellulare.
In questo lavoro, vengono descritti tutti i passaggi necessari per fabbricare un'interfaccia bio-polimero per l'eccitazione ottica delle cellule viventi. La funzione dell'interfaccia attiva è quella di trasdurre lo stimolo luminoso in una modulazione del potenziale di membrana cellulare. Come caso di studio, utile per gli studi in vitro, viene utilizzato un film sottile di politiofene come strato funzionale che assorbe la luce, e le cellule del rene embrionale umano (HEK-293) vengono impiegate come componente biologico dell'interfaccia. Vengono forniti esempi pratici di controllo efficace del potenziale di membrana cellulare dopo stimolazione con impulsi luminosi di diversa durata. In particolare, è dimostrato che sia gli effetti depolarizzanti che quelli iperpolarizzanti sulla membrana cellulare possono essere raggiunti a seconda della durata dello stimolo luminoso. Il protocollo riportato è di validità generale e può essere facilmente esteso ad altri preparati biologici.

Le cellule possono essere facilmente coltivate su P3HT: substrati PCBM, a condizione che uno strato di adesione è depositato adatto (come la fibronectina utilizzato nel passaggio 3.2 del protocollo descritto). P3HT: PCBM picchi di assorbimento ottico nella parte verde dello spettro visibile; tuttavia altri polimeri coniugati fotosensibili possono essere selezionati, secondo la gamma d&#39;onda fotostimolazione preferita (figura 2). Biocompatibilità di questi substrati è ...

Viene descritto un metodo per la stimolazione dell'attività elettrica di colture cellulari in vitro con luce visibile, basato sull'uso di polimeri semiconduttori organici.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

L'obiettivo generale di questo metodo è controllare il potenziale della membrana cellulare mediante stimolazione con impulsi di luce visibile. Il processo di fototrasduzione è mediato da un polimero coniugato sensibile alla luce. Questo metodo fornisce un nuovo strumento nel campo delle tecnologie, in quanto rappresenta un'alternativa valida ai metodi esistenti, come l'optogenetica e la stimolazione termica, per il controllo ottico dell'attività delle cellule vive.I principali vantaggi di questa tecnica sono l'agevole integrazione con qualsiasi tipo di elettrofisiologo, la potenzialmente elevata risoluzione spaziale e temporale e la ridotta invasività. Inoltre, consente di evitare un trasferimento genico necessario nell'optogenetica. Il nostro metodo è descritto qui per la foto-stimolazione di colture cellulari in vitro.Ma potrebbe aprire anche interessanti opportunità per applicazioni in vivo. A dimostrare la procedura saranno Caterina Bossio e Susana Vaquero Morata, due ricercatrici post-dottorato dei nostri laboratori con background rispettivamente in biologia e chimica fisica. Per iniziare, preparare una soluzione del polimero coniugato fotosensibile mescolando P3HT e PCBM in clorobenzene a una concentrazione relativa uno a uno.Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico per almeno quattro ore a 60 gradi Celsius. Successivamente, pulire le lamelle di vetro rivestite con ossido di indio e stagno mediante bagni consecutivi di acqua deionizzata, acetone e isopropanolo di 10 minuti ciascuno in un sonicatore. Asciugare le lamelle con una pistola a azoto e quindi trattare i substrati con un pulitore al plasma.Dopo averlo pulito, posizionare il vetrino sul portacampioni di una spin coater, con il lato rivestito in ITO rivolto verso l'alto. Successivamente, aggiungere 150 microlitri della soluzione di P3HT PCBM sul vetrino e applicare la spin coating al campione. Al termine della spin coater, rimuovere il campione e utilizzare un tampone da cleanroom imbevuto di acetone per pulire il retro del substrato.Sterilizzare i substrati fotoattivi posizionandoli in un contenitore resistente al calore coperto e riscaldandoli a 120 gradi Celsius per due ore. Successivamente trasferire i campioni in una cappa sterile e lasciarli raffreddare. Da questo momento in poi, mantenere la sterilità dei campioni.Posizionare i substrati fotoattivi in una piastra a sei pozzetti. Data l'idrofobicità dello strato di polimero coniugato, creare un pozzetto in polidimetilsilossano per fissare il campione e confinare le soluzioni come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, posizionare i substrati fotoattivi nei pozzetti della piastra e coprire l'intera superficie di ciascun campione con 500-750 microlitri di una soluzione di fibronectina in PBS a due milligrammi per litro.Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere la soluzione di fibronectina, quindi lavare i substrati una volta con due millilitri di PBS. Aggiungere innanzitutto un volume totale di 750-1.000 microlitri di mezzo di crescita completo per pozzetto.Successivamente, seminare 15.000 cellule AGK293 per centimetro quadrato di substrato fotoattivo in ogni pozzetto. Quindi, incubare le cellule per 24-48 ore. Le cellule possono essere facilmente coltivate sui substrati fotoattivi, a condizione che venga depositato un opportuno strato di adesione, come la fibronectina.Per iniziare, preparare sia la soluzione extracellulare che quella intracellulare come descritto nel protocollo testuale allegato. Sterilizzare le soluzioni facendole passare attraverso un filtro da 0,2 micron. Successivamente, preriscaldare la soluzione extracellulare ponendola in un bagno termico a 37 gradi Celsius.Inoltre, riempire una siringa da un millilitro con la soluzione intracellulare ed equipaggiarla con un ago da 34 gauge. Mantenere la soluzione intracellulare a contatto con il ghiaccio per evitare il degrado dell'ATP. Successivamente, prelevare un substrato ricoperto di cellule dall'incubatrice e rimuovere con attenzione il pozzetto in PDMS.Quindi rimuovere il mezzo di crescita con una pipetta di vetro e risciacquare lentamente il campione con soluzione extracellulare per evitare il distacco delle cellule. Aggiungere tre millilitri di soluzione extracellulare in ogni pozzetto e successivamente trasferire la piastra sul supporto del campione della stazione di elettrofisiologia. Una volta posizionata, inserire l'elettrodo di riferimento nel pozzetto da testare.Successivamente, preparare una micropipetta di vetro fresca per la tecnica del patch clamp utilizzando un estrattore di micropipette. Riempire metà della pipetta con soluzione intracellulare. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la pipetta da patch in prossimità della membrana cellulare selezionata.Durante il posizionamento, applicare una pressione eccessiva sulla pipetta per evitare che lo sporco aderisca alla punta. Con la pipetta posizionata a pochi micron sopra la cellula, iniziare ad abbassare la pipetta verso la membrana cellulare monitorando la resistenza della pipetta tramite il software di controllo della tecnica del patch. Quando la resistenza della pipetta aumenta di circa un megaohm, rimuovere la pressione eccessiva ed applicare una leggera aspirazione al fine di formare il gigaseal tra la pipetta e la membrana cellulare.Successivamente, applicare un potenziale negativo di meno 40 millivolt al pipetto per favorire la stabilizzazione del sigillo. Compensare la transitorietà capacitiva dovuta alla capacità del pipetto mediante i comandi appositi sull'amplificatore per registrazione in configurazione patch e/o sul software di controllo della patch. Applicare un breve e intenso impulso di aspirazione al pipetto al fine di rompere la membrana e consentire l'accesso elettrico al citoplasma della cellula.Quindi, impostare l'amplificatore per registrazione in modalità clamp di corrente in modo da non iniettare alcuna corrente nella cellula. In modalità clamp di corrente, monitorare il potenziale della membrana cellulare e attendere alcuni minuti affinché si stabilizzi. Una volta raggiunta la stabilità, applicare al campione il protocollo di illuminazione desiderato illuminando la membrana fotoattiva al di sotto della cellula con luce compresa tra 450 e 600 nanometri.Registrare l'effetto della luce sul potenziale di membrana. Impulsi luminosi brevi di circa 10-20 millisecondi provocano una depolarizzazione transitoria della cellula, mentre con un'illuminazione prolungata dell'ordine di centinaia di millisecondi si osserva una iperpolarizzazione sostenuta fino a quando la luce viene spenta. La stimolazione ottica delle cellule mediata da substrati fotoattivi può produrre effetti diversi sulla membrana cellulare, a seconda della durata dello stimolo luminoso.Un picco rapido, come quello mostrato qui, è seguito da una depolarizzazione transitoria dell'ordine di decine di millisecondi. Per impulsi luminosi brevi, quando la luce viene spenta, si osserva un comportamento opposto. Questi segnali sono stati attribuiti a una variazione della capacità della membrana dovuta al riscaldamento locale successivo all'assorbimento della luce.Per un'illuminazione prolungata, la depolarizzazione iniziale si trasforma in un'iperpolarizzazione cellulare. Questo fenomeno ha nuovamente origine termica, ma in questo caso è legato a una variazione del potenziale di equilibrio della membrana dovuta a un cambiamento della conduttività dei canali ionici indotto dall'aumento della temperatura. È importante notare che questa tecnica è piuttosto flessibile e può essere adattata alle esigenze specifiche di un determinato esperimento, ad esempio modificando il polimero fototossico, il processo di fabbricazione o il protocollo di illuminazione.Tuttavia, prima di modificare il protocollo, si dovrebbero verificare innanzitutto le proprietà importanti del polimero attivo, come la sua biocompatibilità, l'idoneità al processo di sterilizzazione, la stabilità elettrochimica e temporale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare un'interfaccia ibrida tra polimeri conduttivi e cellule viventi e di come utilizzarla per il controllo ottico dell'attività cellulare. Riteniamo che questa tecnica possa inoltre diventare uno strumento complementare nelle neuroscienze per indagini in vitro e aprire nuove prospettive per applicazioni in vivo.Tuttavia, per perfezionare il protocollo, è fondamentale un forte sforzo congiunto da parte di scienziati dei materiali, neuroscienziati, fisici e medici.

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo protocollo delinea come utilizzare il riscaldamento transitorio associato all'assorbimento ottico delle nanobarre d'oro per stimolare la differenziazione e l'attività intracellulare del calcio nelle cellule neuronali. Questi risultati aprono potenzialmente nuove applicazioni nelle protesi neurali e negli studi fondamentali nelle neuroscienze.

Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali

Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Un protocollo per l'analisi dei gel formata da optoelettronica coniugati polimero poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) utilizzando piccoli e lo scattering di neutroni ultra-piccolo angolo in presenza ed assenza di illuminazione è presentato.

Monitoraggio degli effetti di illuminazione sulla struttura del gel di polimeri coniugati utilizzando lo Scattering di neutroni

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

Il protocollo qui presentato consente la fabbricazione automatizzata di micropattern che standardizzano la forma cellulare per studiare le strutture citoscheletriche all'interno delle cellule di mammifero. Questa tecnica di facile utilizzo può essere impostata con sistemi di imaging disponibili in commercio e non richiede apparecchiature specializzate inaccessibili ai laboratori standard di biologia cellulare.

Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi

Qui, presentiamo il metodo di fabbricazione di un sistema optrode con fibre ottiche per l'erogazione della luce e un array di elettrodi per la registrazione neurale. Esperimenti in vivo con topi transgenici che esprimono channelrhodopsin-2 mostrano la fattibilità del sistema per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica.

Optrode Array per la modulazione optogenetica simultanea e la registrazione neurale elettrica

Questo protocollo prevede la trasfezione di sensori cAMP e bPAC-nLuc, una proteina optogenetica, per tracciare accuratamente la sua distribuzione cellulare e la risposta alla stimolazione luminosa. L'approccio innovativo di creare una mappa di risposta cAMP utilizzando un sistema di scansione puntuale ha il potenziale per far progredire la ricerca con le proteine optogenetiche in diversi campi.

Mappatura della distribuzione cellulare di una proteina optogenetica utilizzando una griglia di stimolazione luminosa

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

L'uso della luce per controllare le cellule e i tessuti cardiaci consente la stimolazione senza contatto, preservando così lo stato naturale e la funzione delle cellule, rendendolo un approccio prezioso sia per la ricerca di base che per le applicazioni terapeutiche.

Un sistema microfisiologico cardiaco per lo studio della propagazione del Ca2+ tramite stimolazione ottica non genetica

Scopri come controllare l'attività elettrica delle cellule viventi mediante stimolazione ottica con polimeri coniugati sensibili alla luce. Questo metodo non invasivo offre un'alternativa all'optogenetica per la ricerca in neuroscienza.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Esplora altri video