Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello
27 marzo 2016
Questo articolo descrive un metodo per generare una lesione da compressione del midollo spinale (SCI) riproducibile nel topo neonatale. Il modello fornisce una piattaforma vantaggiosa per lo studio dei meccanismi di plasticità adattativa che sono alla base del recupero funzionale spontaneo.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una lesione da compressione del midollo spinale riproducibile in un topo neonatale. Ciò si ottiene anestetizzando prima profondamente il topo. Quindi eseguire una laminectomia dorsale per rivelare il midollo spinale.
E infine facendo la lesione da compressione. Recentemente abbiamo stabilito un modello murino neonatale per la lesione del midollo spinale e abbiamo dimostrato che i topi neonatali mostrano un sorprendente grado di plasticità adattativa. Lo studio di questo meccanismo alla base del recupero può fornire importanti intuizioni, che potrebbero essere utilizzate nel trattamento delle lesioni del midollo spinale.
In questo video, dimostreremo come eseguire una lesione da compressione del midollo spinale in un topo di un giorno. Questa procedura chirurgica include anestesia, laminectomia e due compressioni epidurali guidate da clip. Preparazione per l'intervento.
L'intervento viene eseguito sotto uno stereomicroscopio. Posizionare un cuscinetto riscaldante sotto il microscopio. È fondamentale mantenere il cucciolo al caldo per evitare la morte improvvisa durante l'intervento chirurgico.
Posiziona una coperta chirurgica o un grande foglio di carta da laboratorio morbida e pulita sopra il cuscinetto riscaldante. Per l'analgesia prechirurgica, preparare una siringa da insulina, 0,3 millilitri calibro 30, riempita con l'anestetico locale, Marcaina, diluita con PBS sterile, a una concentrazione finale di 2,5 milligrammi per millilitro. Per l'incisione della pelle, la rimozione muscolare e la laminectomia, utilizzare un micro coltello, una pinza fine e forbici per iridectomia fine.
Si noti che qui usiamo anche le pinze che abbiamo piegato sulle punte per formare i denti. Questi funzionano meglio delle pinze dentate disponibili in commercio perché i denti devono essere molto piccoli. Per la compressione del midollo spinale, utilizzare un Miniclip per aneurisma temporaneo Yasargil appositamente modificato, che descriveremo in seguito.
È inoltre necessario un piccolo pezzo di tubo capillare in plastica per realizzare un tappo per impedire la chiusura completa della clip e un applicatore di clip per posizionare la clip. Per suturare utilizzare un portaaghi e piccole forbici per tagliare il filo. Per il trattamento del dolore, diluire Temgesic in PBS sterile, a 0,03 milligrammi per millilitro.
La lesione del midollo spinale comporta una compressione guidata da una clip, utilizzando un miniclip per aneurisma temporaneo Yasargil. Prima dell'uso, la clip deve essere modificata meccanicamente, tagliando lo spessore delle lame fino a 150 micrometri utilizzando una pietra per affilare. Poco prima dell'intervento chirurgico, tagliare un breve tratto di tubo di plastica e posizionarlo su una delle lame della clip.
Il tubo funge da tappo per impedire la chiusura completa della clip. Anestesia e analgesia. Per l'anestesia gassosa, utilizziamo un vaporizzatore suprane collegato a un serbatoio di ossigeno.
L'isoflurano è l'anestetico che viene vaporizzato in ossigeno puro. Per distribuire l'isoflurano, la miscela di ossigeno al topo, è necessario costruire una maschera nasale adatta ai neonati. I topi neonatali sono così piccoli che la maschera può essere ricavata dalla punta di una siringa, che funge da ingresso per il tubo di plastica collegato all'uscita del vaporizzatore.
Sul lato della maschera, praticare un piccolo foro per collegare un tubo di evacuazione che termina in una pompa per vuoto regolata, con un'unità di raccolta o semplicemente in una cappa aspirante. Realizzare una camera di troppopieno per anestesia utilizzando una capsula di Petri di plastica da 150 x 25 millilitri. Da un lato, fai un foro abbastanza grande per la testa del mouse.
Sul lato opposto, praticare due fori più piccoli del diametro del tubo di plastica. Infine, praticate un foro di evacuazione, più piccolo degli altri, sulla parte superiore del piatto. Tagliare la punta di un puntale per pipetta da 250 microlitri e introdurla in quest'ultimo foro.
La punta della pipetta funge da connettore per il tubo di evacuazione collegato a un dispositivo per il vuoto impostato per una leggera pressione negativa. Usando la plastilina, fissa la maschera appena all'interno del foro per la testa del topo. Utilizzando del nastro adesivo o della plastilina, fissare il tubo di plastica al soffitto della camera, assicurandosi che i tubi siano ben posizionati negli appositi fori.
Posizionare la camera sulla coperta chirurgica sotto il microscopio. L'intero sistema è rappresentato in questo schema. Un rubinetto a tre vie è posizionato sull'uscita del vaporizzatore.
Qui, il percorso verso la camera del sonno è libero, mentre il percorso verso la maschera è bloccato e il topo può essere posizionato nella camera del sonno per iniziare la sedazione. Ruotando il rubinetto a tre vie verso destra, il gas può fluire verso la maschera e blocca il percorso verso la camera del sonno. In questa configurazione, il mouse può essere trasferito alla maschera.
La perdita di gas viene rimossa dal vuoto dalla camera di troppo pieno. Seleziona un cucciolo di topo che ha bevuto latte di recente, come evidenziato dal colore bianco visibile attraverso la pelle. Metti il cucciolo nella camera del sonno e introduci l'isoflurano vaporizzato al 4% per ottenere una sedazione rapida.
Trasferisci il cucciolo nella maschera. Posizionare con cura il muso del topo ben all'interno della maschera per garantire un'esposizione sufficiente al gas anestetico. Ruotare il rubinetto a tre vie, per deviare il gas verso la maschera.
Iniettare per via sottocutanea 50 microlitri di marcaina a 2,5 milligrammi per millilitro, nel sito chirurgico desiderato. Fai attenzione a non iniettare troppo in profondità, poiché i vasi sanguigni possono essere facilmente colpiti e l'introduzione della marcaina in un vaso è letale. Rimuovere l'eccesso di marcaina con un piccolo impacco sterile.
Laminectomia dorsale. Ridurre la concentrazione di isoflurano all'uno o due percento. Dopo alcuni minuti, forare la pelle con un micro coltello e praticare un'apertura di trasferimento da otto a nove millimetri tirando delicatamente la pelle in direzione caudale rostrale.
Un'apertura di trasferimento è molto più comoda e offre un migliore accesso laterale per l'esecuzione della laminectomia. Ritrarre i bordi dell'incisione cutanea dal tessuto sottostante, inserendo pezzi di spongistatina, rostrale e caudale per via sottocutanea all'incisione. Taglia i muscoli prevertebrali con forbici sottili per esporre la colonna vertebrale.
Si noti che nel neonato, il processo spinale non è completamente sviluppato. Identificare la linea mediana e tagliare la lamina trasversalmente con le forbici sottili. Prestare attenzione a non tagliare troppo in profondità, poiché ciò può potenzialmente danneggiare la dura madre e persino il midollo spinale.
Posizionare con cura una lama di una pinza sottile tra la lamina e la dura dura. Afferra la lamina chiudendo la pinza e sollevala con cautela finché non si stacca, lasciando intatta la dura madre. Ripetere il passaggio, due o tre volte per ottenere una laminectomia a due segmenti.
Controllare il sanguinamento con piccoli pezzi di spongistatina. Usando le pinze sottili come rongeur, rimuovere parti delle faccette articolari bilateralmente per guadagnare spazio sufficiente per posizionare il miniclip per aneurisma modificato all'interno del canale vertebrale. Questo passaggio spesso provoca sanguinamento che può essere controllato utilizzando piccoli pezzi di spongistatina.
Per migliorare la visibilità a volte è un vantaggio risciacquare con PBS sterile caldo, a 37 gradi centigradi. Generazione della lesione da compressione del midollo spinale. Aprire la clip e posizionare le lame su entrambi i lati del midollo spinale negli spazi tra le faccette articolari e il midollo.
Assicurarsi che le lame siano inserite abbastanza in profondità da abbracciare la parte ventrale del midollo spinale. Chiudere rapidamente la clip, tenendo l'applicatore in posizione, per evitare che la clip scivoli all'indietro. Dopo 15 secondi, rilasciare rapidamente la clip.
Pulire la ferita con spongistatina. Per ottenere una compressione simmetrica, invertire le pale ed eseguire una seconda compressione per 15 secondi con l'orientamento opposto. Sutura. Rimuovere i pezzi di spongistatina che sono stati posizionati sotto la pelle all'inizio dell'intervento chirurgico e chiudere la pelle con punti di sutura 6.0.
Iniettare 0,05 millilitri, Temgesic, a 0,03 milligrammi per millilitro per via sottocutanea con una siringa da insulina calibro 30 e posizionare il cucciolo in un ambiente a temperatura controllata a 30 gradi centigradi per alcune ore. Per ridurre il comportamento materno aggressivo nei confronti del cucciolo operato durante la prima notte, dopo l'intervento chirurgico, preparare una soluzione di Diazepam, diluita in PBS pulito, a 0,1 milligrammi per millilitro per iniezione intraperitoneale a otto grammi per chilogrammo. Risultati.
Come mostrato da questo grafico, sei ore dopo la compressione del midollo spinale, a livelli toracici più bassi, gli arti posteriori dei topi feriti sono paralizzati, mentre gli arti anteriori no. Nel caso di animali di controllo fittizi, che hanno ricevuto solo una laminectomia, sia gli arti posteriori che quelli anteriori sono altamente mobili. La sezione del midollo spinale mostra sangue residuo alla vista della lesione.
Inoltre, il tessuto è traslucido, suggerendo una perdita di tessuto, che spesso porta alla formazione di una carie diversi giorni dopo. Conclusione. Dopo questo video dovresti avere una buona comprensione di come generare una lesione da compressione del midollo spinale in un topo neonatale. Il vantaggio dell'utilizzo di topi neonatali è che possiamo utilizzare metodi specifici per affrontare la plasticità adattiva, che non può essere utilizzata nei topi adulti.
Inoltre, il modello fornisce una piattaforma per testare approcci terapeutici, come il trapianto di cellule staminali.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per indurre un danno da compressione del midollo spinale (SCI) riproducibile nei topi neonati. Questo modello è vantaggioso per lo studio dei meccanismi di plasticità adattativa alla base del recupero funzionale spontaneo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neurobiologia
- Modelli di Lesione
Sfondo
- Le lesioni del midollo spinale possono provocare gravi deficit funzionali.
- I topi neonati mostrano una notevole capacità di recupero.
- Comprendere la plasticità adattativa è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti.
- Questo modello consente sperimentazioni controllate sulla lesione del midollo spinale (SCI).
Scopo dello studio
- Stabilire un modello riproducibile di lesione da compressione del midollo spinale.
- Indagare i meccanismi di recupero nei topi neonati.
- Fornire indicazioni per possibili approcci terapeutici.
Metodi Utilizzati
- Anestesia profonda di topi neonati.
- Laminectomia dorsale per esporre il midollo spinale.
- Lesione da compressione mediante un miniforza di aneurisma modificato di Yasargil.
- Analgesia post-chirurgica per il controllo del dolore.
Risultati principali
- Il modello induce con successo una lesione da compressione del midollo spinale.
- I topi neonati mostrano una significativa plasticità adattativa dopo la lesione.
- Le conoscenze acquisite potrebbero orientare futuri trattamenti per lesioni del midollo spinale.
- Un protocollo chirurgico dettagliato garantisce la riproducibilità del modello.
Conclusioni
- Questo modello è uno strumento prezioso per lo studio delle lesioni del midollo spinale.
- Comprendere i meccanismi di recupero può portare a terapie migliori.
- La ricerca futura può basarsi su questo lavoro fondamentale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello di compressione del midollo spinale nel topo neonato consente l'indagine meccanicistica della plasticità adattativa nel recupero da lesioni in età precoce, offrendo un sistema rilevante per la patologia utile a ridurre il rischio delle ipotesi terapeutiche. Catturando la dinamica spontanea del recupero funzionale, il modello supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e lo screening fenotipico nei programmi preclinici di neuroscienze. La sua rilevanza per le lesioni del midollo spinale in età pediatrica e la potenziale continuità traslazionale verso indicazioni nell'adulto migliorano il processo decisionale a livello di portafoglio nella scoperta di neurofarmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai meccanismi di plasticità adattativa nella lesione del midollo spinale.
- Valore operativo: Fornisce un sistema biologicamente rilevante per la validazione funzionale di bersagli attraverso letture comportamentali ed elettrofisiologiche.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando i percorsi di plasticità dell'infanzia a potenziali bersagli terapeutici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera un modello di lesione standardizzato e riproducibile, adatto per lo screening di composti e la valutazione di interventi terapeutici.
- Parametri quantitativi: Permette misurazioni di variabili dipendenti, tra cui la motilità degli arti posteriori, la connettività sinaptica e l'attività elettrofisiologica.
- Scalabilità: Consente registrazioni ottiche ad alto rendimento e analisi fisiologiche ex vivo per lo sviluppo di saggi successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella il trauma del midollo spinale in età pediatrica con evidenza di deficit acuto degli arti inferiori e recupero funzionale entro due settimane.
- Continuità traslazionale: Sfrutta meccanismi condivisi di plasticità tra midollo spinale neonatale e adulto per generare informazioni trasversali all'età.
- Progressione proporzionata al rischio: Consente la valutazione di potenziali terapie utilizzando il recupero funzionale e la riconnessione sinaptica come biomarcatori predittivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino ai test di efficacia preclinica, in particolare per approcci di tipo neuroprotettivo e neurorestaurativo.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di plasticità adattativa e di recupero funzionale in seguito a compressione del midollo spinale.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi per la valutazione di composti mediante parametri comportamentali e fisiologici quantificabili.
- Analisi: Genera misurazioni di variabili dipendenti come il segnale elettrofisiologico e la registrazione ottica della connettività sinaptica.
- Ricerca Translazionale: Collega le scoperte sulla plasticità nell'età precoce a quelle sulle lesioni del midollo spinale nell'adulto attraverso meccanismi biologici conservati.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di interventi terapeutici nelle fasi di scoperta e preclinica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nell'obiettivo chiarificando i meccanismi del recupero spontaneo e della plasticità adattativa.
- Valore operativo: Fornisce un modello chirurgico riproducibile con parametri di compressione standardizzati e cure postoperatorie definite.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo segnali precoci di efficacia in un modello di lesione ad alta plasticità.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei neurofarmaci adeguata al rischio, basata su biomarcatori di recupero funzionale e riparazione sinaptica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione di topi neonati, microchirurgia e tecniche di registrazione elettrofisiologica.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi microscopio stereoscopico, applicatore di mini clip per aneurismi e sistemi di recupero con controllo termico.
- Necessita di standardizzazione tra i team chirurgici per garantire una laminectomia e un'inflizione di lesione compressiva costanti.
- Comporta considerazioni di adattamento nel trasporre i risultati ottenuti in modelli neonatali a contesti del midollo spinale adulto o umano.
- I limiti pratici includono la specificità del modello alle fasi postnatali precoci e la possibile variabilità nella gravità della lesione dovuta al posizionamento del clip.
