Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione
27 dicembre 2015
Qui, presentiamo il protocollo di neovascolarizzazione coroideale indotta da laser (CNV) di topo, un modello sperimentale che ricrea i segni distintivi vascolari della degenerazione maculare neovascolare legata all'età (AMD). Una volta padroneggiato, può indurre in modo affidabile ed efficace la CNV come sistema modello per testare varie misure sperimentali.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ricreare i segni distintivi della degenerazione maculare neovascolare legata all'età o di una MD in un modello animale facile da studiare. Questo metodo può essere utilizzato per studiare diversi aspetti della ricerca neovascolare sulla A MD, incluso il modo in cui le alterazioni genetiche o i trattamenti farmaceutici possono influenzare la malattia o come la malattia può manifestarsi con diverse modalità di imaging. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, una volta padroneggiata, è facile da riprodurre, consentendo di eseguire esperimenti in modo rapido ed efficiente.
In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché mancano della destrezza e della coordinazione per avere successo, entrambe le quali migliorano con la pratica. Per preparare la posizione della stazione laser, il laser e la lampada a fessura dove è facilmente accessibile, accendere il laser e impostarlo sui parametri predeterminati. Qui vengono utilizzati l'impostazione 75 micrometri, la dimensione dello spot, la potenza di 100 milliwatt e la durata di 100 millisecondi.
Quindi, posizionare l'anestesia, lo scaldaanimali, le salviette in tessuto e il collirio con una facile portata dell'operatore laser. Dopo aver anestetizzato il primo topo, posizionalo sullo scaldavivande per circa tre-cinque minuti. Eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per garantire un'anestesia completa.
Quindi utilizzare una salvietta in tessuto arrotolato per prevenire l'aspirazione nasale del rotolamento del liquido. Metti una goccia da 30 microlitri di tetracaina cloridrato in ciascun occhio. Attendi due minuti affinché la soluzione abbia effetto.
Successivamente, applicare una goccia di coadiuvante tropico topico su ciascun occhio per dilatare le pupille. E attendi due minuti affinché la soluzione faccia effetto. Ora posiziona rapidamente il mouse sul tavolino del mouse, quindi posiziona il tavolino sul mentoniera della lampada a fessura.
Accendere la lampada a fessura e regolarla alla luminosità più bassa. Valuta la dilatazione della pupilla del topo. Se la pupilla non ha raggiunto da 2,5 a tre millimetri di dilatazione.
Rimetti il mouse nello scaldavivande o somministra un'ulteriore goccia di aiuto tropicale dopo la dilatazione della pupilla. Orientare il mouse sulla piattaforma in modo che si trovi orizzontalmente perpendicolarmente alla trave a fessura. Ruota leggermente il mouse in modo che non si trovi a un angolo di circa 170 gradi.
Con la testa orientata più vicino all'operatore laser, posizionare il mouse il più vicino possibile alla lampada a fessura mantenendo la stabilità della piattaforma e lasciando spazio sufficiente per consentire all'operatore di eseguire manipolazioni motorie di precisione. Una volta posizionato correttamente il mouse, applicare una goccia di soluzione lacrimale artificiale su un vetrino coprioggetti di vetro da 25 millimetri per 25 millimetri. Inoltre, metti una goccia di questa soluzione sull'occhio non mirato del topo per prevenire la disidratazione.
Afferrare un angolo del vetrino coprioggetto tra il pollice e l'indice e avvolgere le restanti tre dita attorno al mouse per sostenere e stabilizzare sia l'animale che la mano dell'operatore. Quindi premere con cautela il coperchio. Infilalo sull'occhio del topo per appiattire la cornea.
Posizionare il vetrino coprioggetti perpendicolarmente al percorso del raggio laser per evitare la dispersione o la riflessione del raggio. Guardando attraverso la lampada a fessura, usa la mano libera per regolare la messa a fuoco fino a quando la retina non è visibile. La retina dovrebbe apparire dal giallo chiaro al rosso Con vasi sanguigni rossi distinti presenti, muovi lentamente e con attenzione la testa del topo o il vetrino coprioggetti fino a quando non si osserva il nervo ottico.
Il nervo ottico sarà giallo con più vasi sanguigni che si irradiano da esso. Quindi accendere il raggio di messa a fuoco del laser e manovrarlo per mettere a fuoco l'epitelio pigmentato retinico o RPE del fondo oculare. Se il fascio di messa a fuoco sembra essere ovale o sfocato, regolare la lampada a fessura, la messa a fuoco o il vetrino coprioggetti.
Quando il raggio di messa a fuoco è regolato in modo appropriato, utilizzare il grilletto a pedale per avviare la somministrazione del laser. Immediatamente dopo la somministrazione del laser dovrebbe formarsi una bolla Le lesioni con bordi nebulosi o gli occhi con lesioni emorragiche devono essere esclusi dall'analisi. Assicurati di osservare la formazione di bolle e un'area circolare chiara e nitida che indica un'ustione laser focalizzata.
Le lesioni che non producono una bolla possono non indurre in modo appropriato la CNV. Creare lesioni aggiuntive in tutte le posizioni desiderate di neovascolarizzazione coroideale o CNV. Portare il laser in modalità standby quando non è in uso, registrare in un quaderno da laboratorio la posizione e il risultato di ogni somministrazione laser.
Ripetere la somministrazione laser per il secondo occhio del topo utilizzando un vetrino coprioggetti fresco e la mano opposta per stabilizzare il topo. Dopo aver completato tutte le somministrazioni, spegnere il laser e la lampada a fessura, scartare il vetrino coprioggetti e posizionare il mouse sull'animale. Più caldo macroscopicamente.
Ispezionare l'occhio per verificare la presenza di lesioni da superficie corneale o cataratta. Dopo il recupero, rimetti il topo nella sua gabbia. CNV quantificate tramite analisi di coroidi piatte montate dopo colorazione immunofluorescente qui.
L'etichettatura del destrano Fit c è stata effettuata tramite perfusione immediatamente prima del sacrificio animale. Questo è stato seguito dalla quantificazione dell'area tramite soglia nell'immagine J.Qui colorazione immunologica post mortem con il marcatore delle cellule endoteliali. È stata eseguita la selettina ISO GS IB quattro, seguita da imaging tramite microscopia confocale.
Sono state generate ricostruzioni 3D della lesione CNV su FOSS e vista laterale. La tomografia a coerenza ottica è stata utilizzata anche per visualizzare le lesioni della CNV in vivo. Qui, viene mostrata un'immagine in sezione trasversale della retina con una lesione CNV cerchiata in giallo.
Viene mostrata anche un'immagine en FOSS della lesione, cerchiata in giallo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato e posizionare le mani in modo che sia sostenuto e stabile.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fornire la concentrazione. Il laser brucia per indurre la CNV, che può essere successivamente studiata in vari modi.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per indurre la neovascolarizzazione coroideale (CNV) nei topi, riproducendo le caratteristiche vascolari della degenerazione maculare legata all'età di tipo neovascolare (AMD). Il metodo è stato progettato per essere riproducibile ed efficiente per svariati studi sperimentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oftalmologia
- Modelli Sperimentali
Sfondo
- La DMAE neovascolare è una delle principali cause di perdita della vista.
- I modelli animali sono essenziali per lo studio dei meccanismi della malattia.
- Il modello di neovascolarizzazione coroideale consente di testare interventi genetici e farmacologici.
- Le abilità motorie fini sono fondamentali per l'implementazione corretta del protocollo.
Scopo dello studio
- Riprodurre i tratti caratteristici della DMAE neovascolare in un modello murino.
- Facilitare la ricerca sugli effetti dei trattamenti e dei fattori genetici.
- Fornire un metodo affidabile per lo studio dell'evoluzione della malattia.
Metodi Utilizzati
- Preparazione della stazione laser con impostazioni specifiche.
- Utilizzo di un laser e di una lampada a fessura per indurre la neovascolarizzazione coroideale (CNV).
- Monitoraggio della neovascolarizzazione indotta.
- Valutazione della riproducibilità e dell'efficienza del modello.
Risultati principali
- Il protocollo induce efficacemente la neovascolarizzazione coroideale nei topi.
- Una volta padroneggiato, il metodo consente sperimentazioni rapide.
- Si osserva una variabilità nei tassi di successo tra utenti inesperti.
- Il modello può essere utilizzato per esplorare diverse linee di ricerca sul DMAE.
Conclusioni
- Il modello di CNV nel topo è uno strumento prezioso per la ricerca sulla DMAE.
- Padroneggiare la tecnica è essenziale per ottenere risultati costanti.
- Questo metodo può favorire la comprensione della DMAE e di potenziali trattamenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il modello murino di neovascolarizzazione coroideale (CNV) indotta da laser fornisce un sistema riproducibile ed economico per lo studio della degenerazione maculare legata all'età di tipo neovascolare (AMD), consentendo una rapida valutazione di interventi di natura genetica e farmacologica. La sua utilità risiede nella modellizzazione di vie angiogeniche rilevanti per la validazione di bersagli e la riduzione del rischio preclinico nella scoperta di farmaci in oftalmologia. Il modello supporta studi meccanicistici e lo screening terapeutico, offrendo una continuità traslazionale dalla fase di scoperta all'ottimizzazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei percorsi angiogenetici e dei meccanismi molecolari che guidano la formazione di CNV.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante manipolazione genetica e letture fenotipiche.
- Valore strategico: Favorisce la verifica di ipotesi e la riduzione del rischio biologico relativamente a bersagli coinvolti nella disregolazione vascolare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera lesioni CNV quantificabili mediante colorazione immunofluorescente e sogliatura con ImageJ per l'analisi dose-risposta.
- Valore operativo: Permette l'induzione standardizzata di lesioni con parametri laser riproducibili (dimensione del punto 75 µm, potenza 100 mW, durata 100 ms).
- Valore strategico: Consente la valutazione ad alto rendimento degli effetti dei composti sulla fuoriuscita vascolare e sulla neovascolarizzazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella l'angiogenesi rilevante per la malattia per valutare l'efficacia terapeutica in un sistema vivente.
- Valore operativo: Compatibile con modalità di imaging come la tomografia a coerenza ottica (OCT) e la microscopia confocale per il monitoraggio longitudinale.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo collegando la modulazione del bersaglio a esiti fenotipici in un modello preclinico di DMAE.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo letture fenotipiche che informano le decisioni relative all'avanzamento preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi molecolari e la validazione dei bersagli mediante la formazione indotta di CNV in topi wild-type e transgenici.
- Screening: Fornisce output angiogenetici standardizzati e quantificabili adatti allo screening di librerie di composti.
- Analisi: Consente la quantificazione dell'area delle lesioni e la ricostruzione tridimensionale per analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega interventi molecolari a patologie vascolari, supportando valutazioni precliniche allineate a biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di modificatori genetici e farmacologici della CNV.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile dell'interazione con il bersaglio modellando le risposte angiogeniche in vivo.
- Valore operativo: Offre riproducibilità e scalabilità una volta raggiunta la competenza tecnica, riducendo la variabilità sperimentale.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo iterazioni rapide e un'individuazione precoce dei fallimenti nei programmi per la DMLA.
- Impatto sul portafoglio: Guida la priorizzazione dei bersagli corretta per il rischio in base alla loro modulazione dei fenotipi di neovascolarizzazione coroideale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia, interazione laser-tessuto e visualizzazione della retina con guida della lampada a fessura.
- È dipendente da una calibrazione precisa del laser e da un posizionamento stabile dell'animale per garantire una formazione costante delle lesioni.
- Necessita di standardizzazione tra gli operatori per ridurre al minimo la variabilità nell'induzione e nella quantificazione della neovascolarizzazione coroideale (CNV).
- Le considerazioni relative all'adattamento includono background transgenici e endpoint di imaging alternativi per letture specifiche del percorso.
- I limiti pratici includono la natura acuta e indotta da lesione dell'angiogenesi, che potrebbe non replicare pienamente la fisiopatologia cronica della degenerazione maculare legata all'età (AMD).
