Analisi comparativa di ormone umano della crescita nel siero Utilizzando SPRI, Nano-SPRI e saggi ELISA

L'obiettivo generale di questo studio è valutare il potenziale diagnostico della risonanza plasmonica di superficie diretta e amplificata, o saggi SPRi, nel rilevamento di biomarcatori nel siero e confrontarlo direttamente con il kit di saggi di immunoassorbimento enzimatico disponibile in commercio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico, come evidenziare la fase iniziale di una malattia e fornire mezzi per monitorare l'efficacia terapeutica. Il vantaggio principale di SPRi è che consente il monitoraggio e la visualizzazione in tempo reale e senza marcatura delle interazioni biomolecolari registrando le variazioni dell'indice di rifrazione adiacenti alla superficie del sensore.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi dei livelli di hGH nel siero, perché l'hGH endogeno è stato collegato a numerosi disturbi medici che influenzano la crescita e lo sviluppo umano. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di preparazione della chimica delle superfici dei biochip sono difficili da imparare e qualsiasi errore può influire enormemente sui risultati. Dopo aver preparato le soluzioni e i campioni proteici secondo il protocollo di testo, utilizzare 120 millilitri di soluzione piranha stabilizzata per pulire il chip d'oro mediante sonicazione a 50 gradi Celsius per 90 minuti.

Usa l'acqua per sciacquare il chip e sonica in acqua per cinque minuti. Quindi sciacquare il chip con etanolo e utilizzare un flusso di azoto per asciugarlo. Metti il chip d'oro in una camera di ozono UV per 30 minuti per rimuovere eventuali contaminanti.

Successivamente, aggiungere 150 milligrammi di acido 11-mercaptoundecanoico a 20 millilitri di etanolo in una provetta contenente un tappo di plastica per fornire supporto al chip e una barra di agitazione per mescolare in modo omogeneo la soluzione. Metti il chip nella provetta e tappalo. Quindi microonde il tubo a 50 watt e 50 gradi Celsius per cinque minuti.

Con l'etanolo, sciacquare la patatina e immergerla nell'etanolo per cinque minuti. Usa l'acqua per ripetere il risciacquo e immergi per cinque minuti. Aggiungere 150 milligrammi di 1-etil-3-carbodiimmide a 20 millilitri di acqua in una provetta contenente un'ancoretta di agitazione.

Trasferisci il chip nella provetta e cuoci nel microonde come appena dimostrato. Usa l'acqua per sciacquare la patatina e immergila per cinque minuti in acqua. Quindi aggiungere 150 milligrammi di N-idrossisuccinimide a 20 millilitri di acqua in una provetta con una barra di agitazione.

Aggiungere il chip alla provetta, sigillarlo con un tappo e cuocere nel microonde. Dopo aver risciacquato e immerso il chip in acqua come prima, aggiungere 250 micromolari di glicole polietilenico in 20 millilitri di acqua in una provetta con una barra di agitazione. Aggiungere la patatina e il microonde, quindi sciacquare e immergere con acqua come prima.

Preparare 15 microgrammi per millilitro di soluzione anticorpale anti-rhGH e anti-IgG come controllo negativo e aggiungere 10 microlitri di ciascuno in un pozzetto separato in una piastra da 384 pozzetti. Progetta il modello di spotting nel microarrayer e, con un perno da 500 micrometri con punta in teflon, individua il chip con gli anticorpi. Incubare il chip maculato a temperatura ambiente e al 75% di umidità per due ore.

Dopo aver impostato l'esperimento SPRi e aver bloccato il chip secondo il protocollo di testo, preparare una soluzione di rhGH con il seguente insieme di concentrazioni in PBS, contenente il 10% di siero e un milligrammo per millilitro di BSA. È importante sottolineare il tipo di molecola bloccante scelta in questo passaggio. Poiché l'obiettivo è ridurre al minimo le interazioni non specifiche.

Preparare una soluzione due a uno aggiungendo un microlitro di sei anticorpi anti-rhGH marcati con biotina micromolare a tre microlitri di punti quantici nel vicino infrarosso rivestiti di streptavidina micromolare in una provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri. Iniettare 150 microlitri di soluzione di siero umano con hGH nel circuito di iniezione. Un forte aumento del segnale sarà seguito da un lento calo del siero non specificamente legato che risciacqua la superficie.

Una volta che il segnale si stabilizza, utilizzare una soluzione di cloruro di sodio da 450 millimolari, aggiunta al tampone di corsa, per lavare la superficie. Con il tampone in esecuzione, diluire la soluzione di anticorpi anti-rhGH di rilevazione e punti quantici a una concentrazione di 10 nanomolari e iniettare nella cella a flusso. Importare i dati in un programma di analisi dei dati.

Quindi traccia il segnale SPRi in funzione del tempo e determina la differenza tra le macchie anticorpali anti-rhGH e di controllo negativo dopo il lavaggio ad alto contenuto di sale. Per eseguire l'ELISA, dopo aver preparato i reagenti, i pozzetti rivestiti di anticorpi e gli standard, secondo il protocollo di testo, preparare i campioni dell'ormone rhGH nel siero umano al 10% alle seguenti concentrazioni. Aggiungere 50 microlitri di ogni standard, controllo e campione in ogni pozzetto in triplice copia.

Quindi sigillare i pozzetti e incubare a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione durante la notte. Il giorno seguente, togliete la piastra dallo shaker e lasciatela raggiungere la temperatura ambiente. Riscaldare l'HRP anti-rhGH, il tampone coniugato, il tampone di lavaggio, il cromogeno tetrametilbenzidina o TMB e interrompere il reagente a temperatura ambiente.

Per preparare i reagenti di lavoro, utilizzare un tampone coniugato per effettuare una diluizione 40x di HRP anti-rhGH. Utilizzare acqua distillata per diluire il tampone di lavaggio 200x. Aggiungere 50 microlitri di coniugato HRP anti-rhGH in ogni pozzetto.

Sigillare i pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti agitando delicatamente. Decantare la soluzione dai pozzetti, capovolgere la piastra e picchiettare a secco su un panno assorbente. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio in ogni pozzetto, prima di travasare e picchiettare nuovamente per asciugare.

Ripetere il lavaggio tre volte. È importante picchiettare la piastra a 96 pozzetti per rimuovere gli agenti accessori, poiché fare affidamento sulla pipetta non è efficace. Quindi, aggiungere 100 microlitri di cromogeno in ciascun pozzetto, entro 15 minuti dalla fase di lavaggio.

Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti agitando delicatamente. Le soluzioni incolori diventeranno blu. Aggiungere 100 microlitri di reagente di arresto in ogni pozzetto.

Le soluzioni passeranno dal blu al giallo. Utilizza un lettore di piastre a 450 nanometri per leggere immediatamente l'assorbanza di ogni pozzetto. Infine, tracciare la curva standard per gli standard forniti, quindi tracciare la densità ottica dell'rhGH in campioni di siero al 10%, rispetto alla concentrazione di ciascun campione.

In questo video, le prestazioni di SPRi e nano-SPRi sono state confrontate con ELISA per la rilevazione di rhGH. Questa cifra rappresenta la curva di titolazione di rhGH-spiked nel siero umano al 10% ed è confrontata con l'OD ottenuto a 450 nanometri. È stata osservata una buona risposta lineare e il limite di rilevamento è stato determinato in un nanogrammo per millilitro.

Qui, il rilevamento di rhGH è stato valutato con SPRi. Ogni punto della curva del gradiente di concentrazione rappresenta il valore medio della differenza di riflettività calcolata da tre curve cinetiche SPRi per ciascuna concentrazione. Il limite di rilevamento, o LoD, è stato determinato in 3,61 nanogrammi per millilitro.

Per aumentare la sensibilità del biosensore SPRi, sono stati introdotti in sequenza nano-enhancer nel sensore. In questo esperimento, i nanoenhancer hanno amplificato la risposta del biosensore fino al 7,9%, tuttavia, con una variazione minima del segnale al controllo. La praticabilità del biosensore nano-SPRi è stata valutata misurando l'intervallo di rhGH da 30.000 a 0,25 picogrammi per millilitro.

Il LoD è stato calcolato come 9,2 picogrammi per millilitro e il coefficiente di variazione era del 20%Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora per il rilevamento diretto e in due ore per il nano-SPRi, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni per ogni passaggio e, dopo averlo fatto, i risultati possono essere facilmente riprodotti in una durata più breve. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'analisi multi-tufo e maspeck possono essere eseguiti direttamente sul chip dopo un esperimento SPRi, al fine di fornire ulteriori informazioni sulla molecola catturata.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica dovrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica medica per esplorare il rilevamento di più biomarcatori contemporaneamente, legati a cancro, disturbi neurologici e cardiovascolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare un test SPRi, un nano-SPRi e un test ELISA per il rilevamento dei livelli di hGH nel siero umano. Non dimenticare che lavorare con i reagenti può essere estremamente pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e occhiali protettivi.