Una strategia per convalidare il ruolo di callose mediata Plasmodesmal gating nella risposta Tropic

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare i geni coinvolti nel gating plasmodesmale calloso-mediato durante la risposta tropica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo vegetale, come ad esempio quali geni sconosciuti controllano la segnalazione da cellula a cellula da parte dei plasmodesmi durante la risposta tropica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, funziona anche e si ripete.

Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la manipolazione degli ipocotili eziolati di Arabidopsis senza alcun danno durante l'intero processo è impegnativa. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo stabilito la regola di GSL8, una glucosio sintasi nel gating plasmodestmico. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le procedure menzionate nell'audio non hanno spiegato i passaggi critici che sono difficili da eseguire perché richiedono una configurazione e una gestione speciali.

Prepara Murashige e Skoog, o MS medium, un giorno prima dell'esperimento. Sterilizzarlo in autoclave e riempire lastre quadrate da 125 millimetri con 50 millilitri di terreno per piastra. Il giorno successivo, punteggiare i semi che sono stati sterilizzati con ipoclorito di sodio all'1,1% su piastre semi-essiccate.

Da un puntale per micropipetta da 1 millimetro, punteggiare i semi con 200 microlitri di acqua. Disporre i semi in cinque file, a 1,8 centimetri di distanza, con i semi a una distanza minima di 0,1 centimetri l'uno dall'altro nelle file. Lasciare evaporare un po' d'acqua prima di coprire e sigillare le piastre con nastro chirurgico.

Quindi avvolgere i piatti in un foglio di alluminio e metterli all'interno di una scatola. Incubare la scatola a quattro gradi Celsius per tre giorni. Dopo tre giorni di trattamento a freddo, trasferire la scatola dei semi a 22 gradi Celsius per tre giorni.

Dopo altri tre giorni, in una stanza buia, controlla lo stato di germinazione dei semi sotto la luce verde. Di solito, le piantine eziolate Col-0 di tre giorni crescono fino a 1,6 centimetri di lunghezza. Sotto la luce verde, analizza la risposta fototropica e gravitropica alterata.

Usando un piccone sterilizzato, seleziona piantine di dimensioni simili con crescita diritta e verticale. Solleva delicatamente le piantine dalla parte più bassa del loro ipocotile senza toccare altre parti. Quindi, trasferisci con cura le piantine selezionate su una nuova piastra di agar MS.

Sulla nuova piastra, orientare i ganci delle piantine allo stesso modo. Seleziona almeno 20 piantine di ogni background genetico per creare ogni fila e crea un duplicato di ogni piatto. Ogni piastra contiene due genotipi in due file.

Per verificare la risposta fototropica, posizionare le piastre in una scatola nera in modo che le piantine siano orientate verticalmente. Lasciare un lato della scatola aperto fino al bordo delle piastre. Quindi, incubare la scatola in una camera di crescita delle piante con luce bianca unilaterale.

Per controllare la risposta gravitropica, avvolgere le piastre con un foglio e metterle in una scatola nera in modo che le piantine siano orizzontali. In diversi punti temporali, di solito a partire da 90 minuti e fino a 12 ore, è possibile acquisire immagini delle lastre in condizioni di scarsa illuminazione. Utilizzare uno scanner impostato per raccogliere immagini JPEG a 600 DPI.

Per misurare l'angolo di curvatura delle piantine, caricare le loro immagini nel software ImageJ. Usa lo strumento di ingrandimento per ingrandire e scorri fino a una piantina da analizzare. Quindi utilizzare lo strumento angolare per misurare l'angolo con cui è piegata la piantina.

Per fare ciò, fare doppio clic con il pulsante sinistro del mouse sul punto di direzione di crescita dell'ipocotile originale A e trascinare il mouse sul punto di inizio della flessione B.Quindi, utilizzare un clic sinistro per disegnare la prima linea. Ora, trascina il mouse dal punto B all'estremità di piegatura, il punto C, e usa un clic sinistro per disegnare la seconda linea, formando un angolo, A.Il vero angolo di piegatura è l'angolo B, che è uguale a 180 gradi meno l'angolo A.Ora, misura e registra l'angolo A premendo M sulla tastiera. Il file dei risultati si aprirà separatamente.

Ripeti il passaggio precedente per misurare il resto delle piantine e misura l'angolo medio di due sfondi diversi utilizzando il file del foglio di calcolo del set di dati. La preparazione dei blocchi di agarosio HPTS necessari per questo test è trattata nel protocollo di testo. Inizia con la preparazione dei campioni di piante.

In questo esempio, vengono analizzati i mutanti con un limite di esclusione delle dimensioni dei plasmodesmi alterato. Innanzitutto, crea una piattaforma per il test. Posizionare un vetrino di copertura del microscopio su una nuova piastra media MS.

Successivamente, dalle piastre MS con piantine eziolate di tre giorni, utilizzare forbici chirurgiche affilate per asportare con cura le piantine dalla base dell'amo e trasferirle nel vetro di copertura. Trasferisci almeno cinque piantine per background genetico. Orientare le piantine in modo che rimangano solo 0,5 centimetri di ipocotile dalla posizione di escissione sul vetrino di copertura e il resto dell'ipocotile tocchi il terreno.

Quindi, posizionare un blocco di agarosio HPTS sopra le piantine asportate in modo che l'area asportata sia a contatto con il blocco HPTS. Assicurarsi che il contatto sia stato effettuato. Lascia riposare il blocco sugli ipocotili per cinque minuti.

Quindi, trasferisci gli ipocotili in una capsula di Petri da 10 millimetri contenente acqua distillata doppia e lavali agitandoli per 15 minuti. Quindi, trasferisci le piantine lavate su uno scivolo. Posiziona ogni mutante accanto a un controllo per effettuare confronti diretti.

Coprire gli ipocotili con 100-150 microlitri di acqua bidistillata e applicare un vetrino di copertura. Ora, analizza il vetrino utilizzando la microscopia confocale come descritto nel protocollo di testo. Per questo test, utilizzare colorante appena preparato che abbia meno di due giorni e tenuto al buio.

Per inibire la sintesi de novo del callosio, aggiungere 1,5 millimolari di 2-Deossi-D-glucosio al colorante. Iniziare questo test selezionando piantine eziolate di tre giorni per la colorazione della callosio, con o senza risposta tropica. Taglia le piantine dalla loro regione del gancio usando sottili forbici chirurgiche.

Quindi, usando la punta di uno stuzzicadenti, trasferisci le piantine in una piccola capsula di Petri contenente due millilitri di tampone colorante. Incubare le piantine nel tampone di colorazione al buio per due ore agitando continuamente a 30 giri/min. Dopo la colorazione, lavare le piantine con acqua distillata due volte per due minuti per rimuovere il tampone di colorazione in eccesso.

Una volta lavato, selezionare almeno cinque piantine di ogni sfondo per l'analisi confocale. Misura l'intensità del segnale di callosio con il software ImageJ. Aprire il file di microscopia confocale già salvato in formato JPEG nel software di imaging.

Quindi, utilizzando lo strumento di selezione rettangolare, trascinare il cursore sull'immagine e selezionare l'area da esaminare. Quindi, misurare e registrare i valori numerici per l'intensità del segnale premendo M.Il file dei risultati si aprirà separatamente. Nel file dei risultati, il termine "Media" indica l'intensità del segnale dell'area selezionata, non la media di più aree.

Uno per uno, analizza il segnale in questo modo per ogni piantina. Ripeti il passaggio precedente per misurare il resto delle piantine e misura l'angolo medio di due diversi sfondi utilizzando il file del foglio di calcolo del set di dati. Utilizzando i protocolli descritti, sono state analizzate le linee RNAi inducibili dal desametasone di AtGSL8.

piantine di DsGSL8 erano chiaramente difettose nel fototropismo e nel gravitropismo. Non mostravano alcuna flessione sotto l'influenza di nessuna delle due forze. Le alterazioni del movimento simplasmatico hanno mostrato che il movimento del colorante HPTSA era sostanzialmente più esteso nei knockdown dell'RNAi dsGSL8 rispetto a entrambi i controlli.

Il callosio è uno dei regolatori chiave del limite di esclusione delle dimensioni dei plasmodesmi e l'AtGSL8 è una nota plassossoma callosio sintasi. Quindi, è stata eseguita la colorazione blu all'anilina callosica. Nel controllo, il callosio si accumula dopo sei ore, come indicato dalle frecce gialle.

Tuttavia, dopo sei ore, i mutanti presentavano livelli persistentemente bassi di plasmodesmi callosi. Questa assenza di sintesi di callosio era notevolmente inferiore già tre ore dopo il fototropismo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire uno screening rapido dei geni nel controllo delle varianti del gating plasmodesmale dovuto alla risposta tropica attraverso la modulazione del puramente callosio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa sei ore dopo tre giorni di germinazione delle piantine di Arabidopsis. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare di danneggiare le piantine durante il trasferimento. Inoltre, è importante stabilire un contatto corretto tra l'agar e l'ipocotile durante il test di caricamento.

Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla biologia dello sviluppo per esplorare i geni, nuovi geni, che svolgono un ruolo nel controllo della conduttività simplasmatica durante il tropico