Una strategia per convalidare il ruolo di callose mediata Plasmodesmal gating nella risposta Tropic
17 aprile 2016
Questo articolo descrive i metodi per lo screening dei geni che controllano la permeabilità plasmodesmal e pendenza, quindi, auxina durante la risposta tropico. Ciò comprende la misurazione del grado di risposta tropico in hypocotyl di Arabidopsis thaliana e controllando la permeabilità plasmodesmal da acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico (HPTS) carico e valutazione del livello di fine callose.
L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare i geni coinvolti nella regolazione dei plasmodesmi mediata dalla callosa durante la risposta tropica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo vegetale, ad esempio quali geni sconosciuti controllano la comunicazione cellulare tramite i plasmodesmi durante la risposta tropica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è semplice, funzionale e ripetibile.
Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà perché la manipolazione degli ipocotili etiolati di Arabidopsis senza provocare alcun danno durante l'intero processo è impegnativa. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo definendo il ruolo di GSL8, una glucosio sintasi nel controllo dei plasmodesmi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le procedure menzionate nell'audio non illustrano i passaggi critici che risultano difficili da eseguire a causa della necessità di un allestimento e di una manipolazione particolari.
Preparare il mezzo di Murashige e Skoog, o mezzo MS, un giorno prima dell'esperimento. Sterilizzare in autoclave e versare 50 millilitri di mezzo per piastra in piastre quadrate da 125 millimetri. Il giorno successivo, depositare gocce di semi sterilizzati con ipoclorito di sodio al 1,1% su piastre semi-essiccate.
Da una punta di micropipetta da 1 millimetro, depositare gocce di 200 microlitri di acqua sulle semi. Disporre i semi in cinque file, distanti 1,8 centimetri l'una dall'altra, con i semi posizionati a una distanza minima di 0,1 centimetri all'interno delle file. Far evaporare parte dell'acqua prima di coprire e sigillare le piastre con nastro chirurgico.
Quindi avvolgere le piastre nella carta stagnola e collocarle all'interno di una scatola. Incubare la scatola a quattro gradi Celsius per tre giorni. Dopo tre giorni di trattamento a freddo, trasferire la scatola di semi a 22 gradi Celsius per tre giorni.
Dopo altri tre giorni, in una stanza buia, verificare lo stato di germinazione dei semi sotto luce verde. Di solito, le piantine etiolate di Col-0 di tre giorni raggiungono una lunghezza di 1,6 centimetri. Sotto luce verde, analizzare la risposta fototropica e gravitropica alterata.
Utilizzando un’ansa sterilizzata, selezionare delle piantine di dimensioni simili con crescita dritta e verticale. Sollevare delicatamente le piantine dalla parte più bassa dell’ipocotilo senza toccare altre parti. Successivamente, trasferire con attenzione le piantine selezionate su una nuova piastra in agar MS.
Sulla nuova piastra, orientare i ganci delle piantine nello stesso modo. Selezionare almeno 20 piantine per ciascun background genetico per formare ogni riga e preparare una duplicata di ogni piastra. Ogni piastra contiene due genotipi disposti in due righe.
Per verificare la risposta fototropica, posizionare le piastre in una scatola nera in modo che le piantine siano orientate verticalmente. Lasciare un lato della scatola aperto verso il bordo delle piastre. Quindi, incubare la scatola in una camera di crescita vegetale con luce bianca unilaterale.
Per verificare la risposta gravitropica, avvolgere le piastre con della pellicola d'alluminio e collocarle in una scatola nera in modo che le piantine siano in posizione orizzontale. In diversi intervalli di tempo, solitamente a partire da 90 minuti fino a 12 ore, acquisire le immagini delle piastre in condizioni di luce tenue. Utilizzare uno scanner impostato per acquisire immagini JPEG a 600 DPI.
Per misurare l'angolo di curvatura dei germogli, caricare le loro immagini nel software ImageJ. Utilizzare lo strumento di ingrandimento per zoomare e scorrere fino al germoglio da analizzare. Quindi utilizzare lo strumento angolo per misurare l'angolo di curvatura del germoglio.
Per fare ciò, fare doppio clic con il pulsante sinistro sul punto A, corrispondente alla direzione originale di crescita dell'ipocotilo, e trascinare il mouse fino al punto B, dove inizia la curvatura. Quindi, fare clic con il pulsante sinistro per tracciare la prima linea. Ora, trascinare il mouse dal punto B al termine della curvatura, punto C, e fare clic con il pulsante sinistro per tracciare la seconda linea, formando così un angolo A. L'angolo reale di curvatura è l'angolo B, pari a 180 gradi meno l'angolo A. Misurare e registrare l'angolo A premendo il tasto M sulla tastiera. Il file dei risultati si aprirà separatamente.
Ripetere il passaggio precedente per misurare il resto delle piantine e misurare l'angolo medio di due sfondi diversi utilizzando il file di foglio di calcolo del set di dati. La preparazione dei blocchi di agarosio HPTS necessari per questo saggio è descritta nel protocollo testuale. Iniziare preparando i campioni vegetali.
In questo esempio, vengono analizzati mutanti con un limite di esclusione dimensionale alterato dei plasmodesmi. Per prima cosa, preparare una piattaforma per il saggio. Posizionare un'ogiva per microscopio su una nuova piastra con mezzo MS.
Successivamente, da piastre MS con piantine etiolate di tre giorni, utilizzare forbici chirurgiche affilate per escindere con attenzione le piantine alla base del gancio e trasferirle sul vetrino. Trasferire almeno cinque piantine per ogni background genetico. Orientare le piantine in modo che solo 0,5 centimetri dell'ipocotilo a partire dal punto di escissione rimanga sul vetrino e il resto dell'ipocotilo tocchi il mezzo.
Quindi, posizionare un blocco di agarosio HPTS sopra le piantine escisse in modo che la zona escissa sia a contatto con il blocco HPTS. Assicurarsi che il contatto avvenga. Lasciare il blocco a contatto con gli ipocotili per cinque minuti.
Quindi, trasferire gli ipocotili in una piastra di Petri da 10 millimetri contenente acqua bidistillata e lavarli agitando per 15 minuti. Successivamente, trasferire le piantine lavate su un vetrino. Posizionare ogni mutante accanto a un controllo per effettuare confronti diretti.
Coprire gli ipocotili con 100-150 microlitri di acqua bidistillata e applicare un coprioggetto. A questo punto, analizzare il vetrino mediante microscopia confocale come descritto nel protocollo testuale. Per questo saggio, utilizzare un colorante appena preparato, di età inferiore a due giorni e conservato al buio.
Per inibire la sintesi de novo di calloso, aggiungere 1,5 millimolare di 2-Deossi-D-glucosio al colorante. Iniziare questo saggio selezionando piantine etiolate di tre giorni per la colorazione del calloso, con o senza risposta tropica. Tagliare le piantine dalla loro regione ad amo utilizzando forbici chirurgiche sottili.
Quindi, utilizzando la punta di uno stuzzicadenti, trasferire le piantine in una piccola piastra di Petri contenente due millilitri di tampone di colorazione. Incubare le piantine nel tampone di colorazione al buio per due ore con agitazione continua a 30 giri al minuto. Dopo la colorazione, lavare le piantine con acqua bidistillata per due minuti per rimuovere l'eccesso di tampone di colorazione.
Dopo il lavaggio, selezionare almeno cinque piantine per ciascun genotipo per l'analisi confocale. Misurare l'intensità del segnale di callosio mediante il software ImageJ. Aprire il file di microscopia confocale già salvato in formato JPEG nel software di analisi delle immagini.
Successivamente, utilizzando lo strumento di selezione rettangolare, trascinare il cursore sull'immagine e selezionare l'area da esaminare. Quindi, misurare e registrare i valori numerici dell'intensità del segnale premendo M. Il file dei risultati si aprirà separatamente. Nel file dei risultati, il termine "Mean" indica l'intensità del segnale dell'area selezionata, non la media di diverse aree.
Analizzare uno per uno il segnale in questo modo per ogni piantina. Ripetere il passaggio precedente per misurare le restanti piantine e misurare l'angolo medio di due sfondi diversi utilizzando il file di foglio di calcolo del set di dati. Utilizzando i protocolli descritti, sono state analizzate linee di RNAi induttive da desametasone di AtGSL8.
I semenzali DsGSL8 presentavano chiaramente difetti nel fototropismo e nel gravitropismo. Non mostravano alcuna curvatura sotto l'influenza di nessuna delle due forze. Le alterazioni nel movimento simplassico hanno mostrato che il movimento del colorante HPTSA era notevolmente più esteso nei ceppi con silenziamento RNAi di dsGSL8 rispetto ai controlli.
La callosa è uno dei principali regolatori del limite di esclusione dimensionale dei plasmodesmi, e AtGSL8 è una sintetasi della callosa associata ai plasmodesmi. Pertanto, è stata eseguita una colorazione con blu anilina per la callosa. Nel controllo, la callosa si è accumulata dopo sei ore, come indicato dalle frecce gialle.
Tuttavia, dopo sei ore, i mutanti presentavano livelli persistentemente bassi di callosa nei plasmodesmi. L'assenza di sintesi della callosa era misurabilmente ridotta già da tre ore dopo il fototropismo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi rapida dei geni coinvolti nella regolazione della permeabilità plasmodesmica in risposta a stimoli tropici mediante la modulazione esclusiva della callosa.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa sei ore dopo tre giorni di germinazione delle piantine di Arabidopsis. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di evitare di danneggiare le piantine durante il loro trasferimento. Inoltre, è fondamentale stabilire un contatto adeguato tra l'agar e l'ipocotilo durante il saggio di caricamento.
Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla biologia dello sviluppo per esplorare geni, nuovi geni, che svolgono un ruolo nel controllo della conducibilità simplastica durante il tropismo
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per l'analisi di geni che regolano la permeabilità dei plasmodesmi e i gradienti di auxina durante le risposte tropiche nelle piante. L'attenzione è rivolta agli ipocotili di Arabidopsis thaliana, valutando la permeabilità plasmodesmica e i livelli di callosa.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia dello Sviluppo delle Piante
- Comunicazione Cellula a Cellula
- Screening Genetico
Sfondo
- Comprendere la regolazione dei plasmodesmi è fondamentale per la segnalazione nelle piante.
- La callosa svolge un ruolo significativo nel controllo della permeabilità plasmodesmica.
- Le risposte trofiche nelle piante coinvolgono interazioni genetiche complesse.
- Arabidopsis thaliana è un organismo modello utilizzato in questi studi.
Scopo dello studio
- Identificare geni sconosciuti che controllano la segnalazione plasmodesmica durante le risposte trofiche.
- Migliorare la comprensione del controllo plasmodesmico mediato da callosio.
- Fornire una metodologia semplice e diretta per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Misurazione della risposta tropica negli ipocotili di Arabidopsis.
- Valutazione della permeabilità dei plasmodesmi mediante carico di HPTS.
- Valutazione dei livelli di callosio nei tessuti vegetali.
- Dimostrazioni visive per facilitare l'esecuzione del metodo.
Risultati principali
- Identificazione dei geni chiave coinvolti nella regolazione dei plasmodesmi.
- Misurazione con successo delle risposte trofiche in condizioni controllate.
- Dimostrazione dell'efficacia e della ripetibilità del metodo.
- Evidenziazione delle difficoltà nel manipolare gli ipocotili di Arabidopsis.
Conclusioni
- Il metodo fornisce informazioni sul controllo genetico della segnalazione nelle piante.
- Gli ausili visivi sono essenziali per l'implementazione corretta della tecnica.
- Ulteriori ricerche possono basarsi su questi risultati per esplorare altri fattori genetici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la regolazione mediata dai geni della connettività dei plasmodesmi fornisce un'analisi meccanicistica sulla formazione del gradiente di auxina, un processo fondamentale nella segnalazione dello sviluppo vegetale. Questa strategia permette l'identificazione sistematica di regolatori genetici del controllo simplasmico, sostenendo la validazione di bersagli nelle vie di segnalazione vegetale. Tale conoscenza aiuta a ridurre i rischi nelle ipotesi riguardanti i meccanismi di comunicazione intercellulare rilevanti per lo sviluppo di caratteristiche delle colture e la modellizzazione della risposta allo stress.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi genetiche che collegano la sintesi di calloso nei plasmodesmi a fenotipi di risposta tropica.
- Valore operativo: Utilizza lo screening di risposte tropiche anomale nei semenzali per individuare geni che influenzano la connettività simplassica.
- Valore scientifico: Permette la validazione funzionale di geni candidati mediante saggi di movimento di traccianti simplassici e deposizione di calloso.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Stabilisce letture quantitative della permeabilità dei plasmodesmi mediante saggi con blocchi di agarosio contenenti HPTS.
- Valore operativo: Standardizza l'inibizione della sintesi di callosa tramite trattamento con 2-Deossi-D-glucosio per analisi comparative.
- Valore scientifico: Permette la misurazione dell'intensità del segnale mediante microscopia confocale per valutare la dinamica della regolazione dei plasmodesmi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la modulazione genica a modifiche della connettività simplastica durante le risposte trofiche, fornendo informazioni per modelli meccanicistici.
- Valore operativo: Consente il confronto tra diversi background genetici mediante l'uso di piastre duplicate e l'escissione standardizzata dell'ipocotile.
- Valore scientifico: Supporta protocolli di screening fenotipico per geni che influenzano la segnalazione da cellula a cellula in contesti dello sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della scoperta precoce collegando lo screening genetico alla validazione funzionale dei regolatori dei plasmodesmi, fornendo informazioni per la valutazione della fiducia nei bersagli successivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su geni che controllano la segnalazione da cellula a cellula tramite plasmodesmi durante le risposte trophiche.
- Screening: Permette la preparazione del saggio attraverso protocolli standardizzati di carico di HPTS e di colorazione della callosa per la quantificazione della permeabilità e della regolazione del gating.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (angolo di curvatura, intensità del segnale) che consentono il confronto tra condizioni e la validazione dei risultati positivi.
- Ricerca traslazionale: Fornisce una continuità meccanicistica dalla perturbazione genica ai cambiamenti nella connettività simplassmica nei modelli di risposta trophica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di screening riutilizzabile per geni che modulano la segnalazione simplassmica nei sistemi di sviluppo vegetale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo collegando la funzione genica ai meccanismi di controllo dei plasmodesmi.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità mediante procedure standardizzate di gestione delle piantine, duplicazione delle piastre e misurazione degli angoli in cieco.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nella priorizzazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di segnalazione.
- Impatto sul portafoglio: Consente l'avanzamento mirato dei candidati con ruoli confermati nella regolazione della connettività simplastica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella sterilizzazione dei semili di Arabidopsis, nell'allestimento delle piastre e nella manipolazione degli ipocotili senza provocare danni meccanici.
- È dipendente da strumentazione per microscopia confocale, analisi con ImageJ e camere di crescita con luce e temperatura controllate.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi di lavoro per l'acquisizione delle immagini delle risposte tropiche, la colorazione della callosa e l'esecuzione dei saggi con traccianti simplastici.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare il metodo a diversi background genetici o stadi di sviluppo.
- Comprende limitazioni pratiche, come la sensibilità dei semili durante il trasferimento e la necessità di un contatto preciso tra agar e ipocotile durante i saggi di caricamento.
