Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la quantità di ciascuna specie di fosfoinositide nelle cellule in varie condizioni genetiche e ambientali al fine di comprendere la funzione e la regolazione dei fosfoinositidi. I lipidi fosfoinositidi controllano le funzioni cellulari come la migrazione, la replicazione e il traffico di memoria. Questo metodo identifica le condizioni genetiche e ambientali che influiscono sui fosfoinositidi e aumenta le nostre conoscenze sulla loro regolazione e funzione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una misurazione accurata e simultanea di tutti i fosfoinositidi all'interno delle cellule. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione dei fosfoinositidi nei lieviti, può essere applicato anche a cellule di mammifero in coltura. Le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa dei numerosi passaggi necessari per l'etichettatura, l'elaborazione e l'analisi.

Si consiglia di esercitarsi prima senza l'etichetta radioattiva. Per iniziare, coltiva una coltura liquida da 20 millilitri del ceppo di lievito SEY6210, in un mezzo sintetico completo a 30 gradi Celsius con agitazione costante fino alla fase di metà logaritmica. Quindi, trasferire un totale di 10-14 OD delle cellule di lievito in una provetta da centrifuga a fondo tondo da 12 millilitri e centrifugare a 800 volte G per cinque minuti.

Decantare il mezzo. E risospendere il pellet in 2 millilitri di terreno privo di inositolo. Centrifugare nuovamente le cellule.

E poi risospendere il pellet in 440 microlitri di terreno privo di inositolo. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 60 microlitri di mio-inositolo marcato con trizio e far crescere le cellule per altre da una a tre ore a 30 gradi Celsius con agitazione costante.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga contenente 500 microlitri di acido perclorico al 9% e 200 microlitri di perle di vetro lavate con acido. Mescolare capovolgendo ripetutamente la provetta, quindi incubare con ghiaccio per cinque minuti. Successivamente, agitare il tubo alla massima velocità per 10 minuti.

Quindi trasferire il lisato in una nuova provetta da microcentrifuga utilizzando una punta di caricamento in gel per evitare di aspirare le perle di vetro. Quindi, centrifugare la provetta e scartare il surnatante. Sonicare il pellet in un millilitro di EDTA da 100 millimolari ghiacciato fino a quando non è completamente disperso e centrifugare nuovamente.

Dopo la centrifugazione, aspirare l'EDTA dalla provetta contenente il pellet radiomarcato. Aggiungere 50 microlitri di acqua e sonicare per risospendere il pellet. Preparare il reagente di deacilazione fresco secondo il protocollo di testo.

Quindi aggiungere 500 microlitri di reagente di deacilazione alla provetta e sonicare per mescolare. Incubare il campione a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, trasferire il campione in un blocco riscaldante a 53 gradi Celsius per 50 minuti.

Successivamente, mettere il campione in una centrifuga sottovuoto e lasciarlo asciugare per un minimo di tre ore. Risospendere il pellet facendolo sonicare in 300 microlitri d'acqua e incubarlo a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, asciugare completamente il campione in una centrifuga sottovuoto per un minimo di tre ore.

Dopo l'essiccazione, aggiungere 450 microlitri di acqua al tubo e rimettere in sospensione il pellet sonicando fino a quando non si sarà completamente disperso. Preparare il reagente di estrazione fresco secondo il protocollo di testo. Aggiungere 300 microlitri di reagente di estrazione e vorticare alla massima velocità per cinque minuti.

Centrifugare la provetta a 18000 volte G per due minuti e pipettare con cura lo strato acquoso inferiore in una nuova provetta. Successivamente, essiccare la frazione acquosa finale mediante centrifugazione sotto vuoto per un minimo di tre ore. Successivamente, disperdere completamente il pellet sonicando in 50 microlitri di acqua e conservare il campione a 20 gradi Celsius.

Infine, determinare la radioattività del campione aggiungendo due microlitri a quattro millilitri di liquido di scintillazione in una fiala di scintillazione in polietilene da 6 millilitri. Registrare il CPM della fiala utilizzando un contatore a scintillazione liquida con una finestra aperta. Per impostare il sistema HPLC per la separazione dei glicero-inositidi marcati con trizio, preparare prima i tamponi A e B e la colonna cromatografica secondo il protocollo di testo.

Successivamente, caricare 10 milioni di CPM del campione in una fiala per iniezione da due millilitri, dotata di un inserto a molla da 250 microlitri, e aggiungere acqua per un volume totale di 55 microlitri. Tappare la fiala con un tappo a vite dotato di un setto in silicone PTFE e posizionarla nel vassoio di campionamento automatico del sistema HPLC, insieme a un bianco d'acqua in una fiala simile. Utilizzando il software del sistema HPLC, programmare un protocollo di eluizione.

L'uno per cento di buffer B per cinque minuti, l'uno al 20 per cento di B per quaranta minuti, dal 20 al 100 per cento di B per dieci minuti, il 100% B per cinque minuti, il 100-1 per cento di B per venti minuti e poi l'uno per cento di B per dieci minuti. Impostare la portata della pompa a 1,0 millilitri al minuto per 90 minuti e il limite di pressione a 400 bar. A seguire, impostare un protocollo di rilevamento sullo scintillatore di flusso per funzionare per 60 minuti, con una portata del fluido di scintillazione di 2,5 al minuto e un tempo di permanenza di 8,57 secondi.

Successivamente, programmare una sequenza di iniezione automatizzata sull'HPLC per iniziare con il bianco dell'acqua che esegue il protocollo di equilibrio, seguito dal campione radiomarcato sul protocollo di eluizione. Prima che il protocollo di equilibratura sia completato, creare una sequenza batch sullo scintillatore a flusso per misurare tutti i campioni utilizzando il protocollo di rilevamento, che viene attivato dal protocollo di eluizione. Per analizzare i dati HPLC, aprire prima il file di dati grezzi per ciascun campione, utilizzando il software di quantificazione cromatografica.

Nella scheda cromatogrammi, ingrandisci per allungare i picchi minori mantenendo la risoluzione temporale. Utilizza lo strumento di aggiunta del ROI per evidenziare ogni picco per l'analisi, quindi identifica i picchi in base al loro tempo di eluizione. Utilizzare la scheda della tabella delle regioni per individuare e registrare l'area di ciascun picco.

Allo stesso tempo, annota l'ora di inizio e di fine di ogni picco. Quindi, esegui una sottrazione di sfondo per ogni picco evidenziando una regione adiacente al picco, che copre lo stesso periodo di tempo. Utilizzando il software per fogli di calcolo, sottrarre il numero di conteggi per quella regione dai conteggi del picco corrispondente.

Normalizzare l'area di ciascun picco rispetto al picco di inositolo glicerato parentale e registrare come percentuale del fosfatidilinositolo parentale. Quindi normalizzare ciascuno dei picchi in ciascuna condizione sperimentale rispetto alla condizione di controllo ed esprimere l'aumento della piega finale rispetto al controllo. Esporta i file cliccando su File, e Salva con nome, e scegliendo il formato CSV.

Infine, apri il file CSV in un foglio di calcolo per tracciare i dati. L'analisi dei fosfoinositidi di lievito radiomarcati è stata eseguita mediante HPLC. Poiché le cellule di lievito generano solo quattro fosfoinositidi, la risoluzione può essere raggiunta con un metodo di eluizione a doppio gradiente di un'ora.

Il picco di inositolo glicerato che alludeva a otto-nove minuti offuscava il segnale di tutte le altre specie fosforilate. Pertanto, è necessario ingrandire la porzione di traccia contenente gli altri picchi prima di integrare i segnali radioattivi. I ceppi di lievito wild-type, ATG18 e VAC14 sono stati analizzati per verificare la presenza di variazioni nel fosfatidilinositolo 3, 5-bisfosfato utilizzando questo metodo HPLC.

È stato dimostrato che il mutante con delezione ATG18 produce la maggior quantità di fosfatidilinositolo 3, 5-bisfosfato e il mutante con delezione VAC14 ne produce meno. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni di crescita e di etichettatura in base allo specifico ceppo di lievito o ai tipi di cellule.

Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi, come i biosensori fusi con GFP, per integrare la scintillazione a flusso HPLC per la rilevazione di fosfoinositidi. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come marcare, estrarre e misurare i fosfoinositidi mediante scintillazione a flusso accoppiato HPLC. Non dimenticare che lavorare con radioattività e solventi organici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale e una formazione adeguata.