Name: Luso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Scopri come valutare lo stato di condensazione della cromatina nelle cellule T mediante citometria a flusso. Questo metodo rileva le modifiche strutturali durante l'attivazione cellulare per studi di immunologia.

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Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (5 P20 RR016461 e 8 P20 GM103499), la National Science Foundation (EPS-0.903.795). Ulteriore supporto fornito dalla ricerca e crescita professionale di Furman University e premi Advantage Furman.

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo di origine animale è stato approvato dal (numero permesso: A3242-01) Furman University Istituzionale Animal Care and Use Committee. Tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo si possono trovare nella tabella di materiali ed attrezzature, mentre i buffer utilizzati possono essere trovati nella tabella di buffer e soluzioni. 1. sospensione singola cella di linfociti da mouse milze <ol><li> Sacrifica topi tramite CO 2 asfissia. Confermare l&#39;eutanasia da dislocazione cervicale. Nota: utilizzare la milza di due 6-8 settimane di età topi isogenico (ad esempio, C57B / 6) dello stesso sesso. In genere, due milze vengono elaborati. </li><li> Spruzzare animali abbondantemente con soluzione etanolica al 70% e orientare tale che la testa è rivolto verso sinistra. </li><li> Utilizzando pinze, sollevare la pelle dell&#39;animale verso l&#39;alto e lontano dal tegli corpo. Utilizzando le forbici, tagliare una piccola tacca attraverso la pelle vicino l&#39;addome dell&#39;animale. Usando le dita, tirare ciascun lato della tacca per esporre il peritoneo dal collo fino all&#39;inizio delle zampe posteriori. La milza dovrebbe essere visibile direttamente sotto il peritoneo. </li><li> Utilizzando pinze, sollevare il peritoneo e fare una piccola incisione per esporre la milza. Rimuovere la milza con una pinza e usare le forbici per prendere in giro via qualsiasi adiposo e tessuto connettivo. </li><li> Posizionare la milza in un tubo da 50 ml contenente 10 ml di PBS integrato con il 2% siero fetale bovino (di seguito denominato PBS + 2%). Mantenere la provetta in ghiaccio fino al momento di iniziare la sospensione di cellule singole. Nota: recupero tipica è tra 60-90.000.000 cellule per la milza, e in genere, 2 milioni di cellule sono necessari per campione. Eseguite tutte le seguenti operazioni in una cappa coltura tissutale. </li><li> Decantare la milza in una sterile 100 millimetri piatto di coltura tissutale. </li><li> Ottenere due vetrini smerigliati e tenere tscivola in modo che le due superfici ruvide smerigliato faccia verso l&#39;interno verso l&#39;altra. Bagnare i vetrini nella soluzione PBS + 2% versato nella capsula di Petri. </li><li> Tenere la milza tra le superfici dei vetrini smerigliati, con i bordi ancora sommerse, e macinare milza delicatamente spostando le diapositive e indietro uno contro l&#39;altro (Figura 1A). Le cellule cadranno nella piastra di Petri. Continuare fino a quando tutte le cellule di macinazione sono stati rilasciati ed i resti della milza appare bianco (Figura 1B). </li><li> Aspirare la sospensione cellulare in una pipetta e filtrare lentamente attraverso un filtro 70 micron in un nuovo tubo da 50 ml sterile. Si noti che piccoli pezzi di polpa rossa saranno presenti sul filtro (Figura 2A). <ol><li> Se il filtro si alza, delicatamente sollevarlo leggermente per consentire il fluido di defluire attraverso e inserire il filtro nel tubo conico da 50 ml e continuare, ripetendo questo processo, se necessario. Se il trattamento più di 5 spleente, può essere necessario dividere in due lotti e utilizzare un nuovo filtro per ogni. </li></ol></li><li> Utilizzando la porzione del tappo di una siringa da 3 ml premere delicatamente la polpa rossa contenente le cellule rimanenti attraverso il filtro (Figura 2B). Assicurati di premere sia il fondo del filtro e sui lati per garantire che tutti polpa rossa è passata attraverso il filtro (Figura 2C). </li><li> Aggiungere 10 mlof PBS + 2% al piatto di coltura tissutale e usare questo per lavare la scivoli, siringa tappo, e piatto di recuperare tutte le cellule rimanenti. Passare questo attraverso lo stesso filtro di cella 70 micron nel tubo da 50 ml. Ripetere questa operazione, se necessario. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare filtrato a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare delicatamente e scartare il surnatante, attenzione a non disturbare il pellet. Una traccia quantità di PBS + 2% sarà lasciato nel tubo. Tappare la provetta e flick il pellet fino a quando il pellet è completamente risospeso. </li><li> Lisare globuli rossi di annuncioding 2 mL di ACK Lysis Buffer (0,15 M NH 4 Cl, 1 KHCO mM 3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2, conservare a 4 ° C) per milza per tubo conico e ruotare e capovolgere il tubo per garantire che tutte le cellule entrare in contatto con il tampone ACK. Agitare delicatamente la provetta per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Portare il volume della sospensione cellulare a 50 ml aggiungendo PBS + 2% il tubo di neutralizzare il buffer ACK. Invertire il tubo 10 volte e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. Dopo la centrifugazione è completa, il pellet dovrebbe essere bianco (Figura 3). </li><li> Decantare delicatamente e scartare il surnatante, attenzione a non disturbare il pellet. Lascia una traccia quantità di PBS + 2% nel tubo, tappare la provetta, e sfogliare il pellet per sospendere di nuovo esso. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzi T cellulari [10% FBS, HEPES 10 mM (pH 7,0), 2 Glutamax mM, piruvato 1 mM sodio, aminoacidi non essenziali 1X, 1x penicillina / streptomicina e 50 mM β-mercaptoetanolo], e successive risospendere il pellet delicatamentepipettando su e giù. Poi filtrare la sospensione attraverso un nuovo filtro 70 micron in una nuova provetta da 50 ml. </li><li> Utilizzare altri 5-10 ml di media di cellule T per sciacquare il tubo originale e passare questo attraverso il filtro 70 micron nella provetta contenente il resto delle celle filtrati. Se l&#39;elaborazione più di due milze, il volume del supporto di cellule T può essere aumentata per massimizzare il recupero. </li><li> Mantenere le cellule in ghiaccio fino al momento di essere macchiato. Le cellule devono essere contati e la sostenibilità accessibili. <ol><li> Per contare le celle, unire 3 ml di cellule con 24 ml di PBS + 2% e 3 ml di 0,4% trypan blu. Carico 10 ml di questo in ciascuna camera di un migliorato emocitometro Neubauer. Viabilità, valutata mediante esclusione trypan blu, è in genere tra il 85-95%. </li></ol></li></ol> 2. Viabilità e colorazione della superficie <ol><li> Cellule pellet di centrifugazione per 10 minuti a 300 xg a 4 ° C. Risospendere le cellule in mezzi cellule T ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule / ml. Trasfer 2 milioni di cellule (100 ml) in un pozzetto di una 96-pozzetti di coltura tissutale U-fondo. </li><li> Centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 10 minuti a 300 xg a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante da ogni pozzetto muovendo liquido all&#39;interno della piastra e nel lavandino (il pellet cellulare rimarrà nel pozzo) e tamponando la piastra su un tovagliolo di carta pulito. Lavare le cellule da essi risospendere in 200 microlitri di PBS seguita da centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eseguire tutte lava questo modo, se non diversamente indicato. Nota: Non utilizzare PBS + 2%, come essa possa interferire con la macchia PI risolvibile. </li><li> Eliminare il surnatante tramite sfogliando la piastra e aggiungere 100 ml di colorante commerciale preparati al momento (ad esempio, macchia di cellule morte rosso fissabile) in ciascun pozzetto. <ol><li> Rendere la macchia diluendo il colorante soluzione madre reattiva 1:10 in DMSO seguita da una diluizione 1:10 in PBS. Incubare la piastra a 4 ° C per 30 minuti al riparo dalla luce. </li></ol></li><li> Centrifugare la ptardi per 10 min a 300 xg a 4 ° C. A questo punto in avanti, eseguire tutti i lavori con la piastra con il cappuccio luce coltura di tessuti fuori. </li><li> Eliminare il surnatante tramite sfogliando la piastra e poi aggiungere 100 ml di soluzione di blocco Fc. Fai la soluzione blocco Fc diluendo Fc soluzione blocco magazzino 1: 100 in PBS. </li><li> Anticorpi diluire da utilizzare per la colorazione della superficie (ad esempio, anti-CD4 o anti-CD8) in PBS e aggiungere 100 ml di ogni bene. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 30 min a 4 ° C al riparo dalla luce. Nota: anticorpi macchia di superficie devono essere titolati per ottenere prestazioni ottimali. Utilizzano in genere una diluizione 1: 400, secondo il protocollo del produttore: 200 o 1. </li></ol> 3. intracellulare colorazione per istone H3 <ol><li> Dopo incubazione della macchia superficiale, lavare le cellule due volte in PBS. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, aggiungere 100 ml di paraformaldeide al 4% in ogni pozzetto. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 5 minuti a temperatura ambiente. Fai paraformaldeide 4% per diluting 16% paraformaldeide in PBS. Fai di questo fresco. </li><li> Lavare le cellule due volte in PBS. </li><li> Preparare la soluzione Perm / blocchi (soluzione madre Perm è PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, conservare a 4 ° C) mediante la combinazione di 2 ml di siero di coniglio normale per 100 ml di soluzione madre di Perm. Fare abbastanza per 60 ml / campione. </li><li> Aggiungere 40 ml di Perm / blocchi ad ogni pozzetto e mescolare bene pipettando gentilmente su e giù, facendo attenzione a non fare bolle. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 45 minuti al buio. Salvare restante Perm / blocchi per passo 3.6. </li><li> Diluire fluorescente coniugato anticorpo istone H3K4me1 in soluzione Perm / blocchi riservato al punto 3.5 e aggiungere 10 ml di questa diluizione in ogni pozzetto. Mescolare pipettando gentilmente su e giù. Incubare la piastra a 96 pozzetti al buio per 1 ora a 4 ° C. Nota: utilizzare un anticorpo H3K4me1 coniugato utilizzando il kit di coniugazione R-Ficoeritrina seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare le cellule due volte in PBS + 2%. </li><li> Risospendere le cellule in 200l di PBS + 2% e trasferire i campioni al tubi FACS per l&#39;analisi di citometria a flusso. I campioni possono essere conservati a 4 ° C al buio. Per ottenere risultati ottimali analizzare i campioni entro due giorni. Singolarmente campioni colorati possono essere utilizzati come citofluorimetria controlli di compensazione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo sviluppato un protocollo che permette la valutazione della condensazione della cromatina in cellule T. Essa si basa sulla semplice osservazione che gli anticorpi dell&#39;istone H3 non possono accedere alle loro epitopi facilmente nelle cellule naive, ma al momento l&#39;attivazione delle cellule T, questi stessi anticorpi in grado di legarsi ai loro epitopi. Confrontando l&#39;MFI di istone H3 colorazione tra i gruppi di trattamento, il relativo grado di condensazione o decondensazione può essere determinato. Abbiamo usato questo protocollo per determinare lo stato di condensazione rispetto durante lo sviluppo timocita e durante l&#39;attivazione delle cellule T 4. Abbiamo anche usato questo protocollo per studiare i meccanismi che controllano il processo decondensazione 5. Questo protocollo si basa sull&#39;utilizzo di un anticorpo istone H3 a rilevare lo stato di condensazione della cromatina. Poiché non vi è alcun cambiamento globale nella modificazione degli istoni durante l&#39;attivazione delle cellule T 4, siamo in grado di utilizzare un anticorpo H3K4me1 per valutare cromatinastato in questo protocollo. Abbiamo usato anticorpi sollevate contro modificato istone H3; tuttavia, il segnale prodotto era molto più debole complessiva. Nella nostra esperienza, gli anticorpi sollevate contro modificato istone H3 funzionano meglio in immunofluorescenza e citometria a flusso test, mentre gli anticorpi contro modificato istone H3 funzionano meglio in Western Blot. Si deve notare che è anche possibile utilizzare anticorpi diretti contro le altre proteine ​​istoni, anche se non abbiamo tentato esso. I passi di anticorpi Perm / blocchi e dell&#39;istone H3 sono i passaggi più critici nel protocollo. La quantità di soluzione di Perm / blocchi utilizzato deve essere ottimizzato ogni volta che la soluzione di riserva di Perm è fatto. Questo può essere fatto confrontando le prestazioni di diverse diluizioni di soluzione madre. Un tipico esperimento consiste nel confrontare lo stato della cromatina in cellule T naive a quelli attivati ​​per 3 ore (Figura 4). Si dovrebbe scegliere la diluizione che produce il massimo cambiamento MFI soprail periodo di tempo analizzato. La soluzione madre può essere diluita in PBS + 2% di diminuire la forza Perm / blocchi dapprima risospendere le cellule in quanto 100 ml PBS + 2% dopo il punto 3.4 e quindi aggiungendo il Perm / blocchi nel passaggio 3.5. Un esperimento pilota, simile dovrebbe essere utilizzata per testare diverse diluizioni del coniugato anticorpo fluorescente istone H3 ogni volta che un nuovo lotto di anticorpi è etichettato. Questi passaggi sono particolarmente critiche per la rilevazione di successo delle differenze di condensazione presto attivazione delle cellule T (ad esempio, nel raggio di 3 ore di attivazione). Di tanto in tanto, ci sono cellule che non ottengono permeabilizzate e quindi non si macchia con l&#39;anticorpo istone H3. Ciò può accadere se le cellule non sono risospese bene quando si aggiunge il Perm / blocchi o se il Perm / blocchi non è abbastanza forte. Queste cellule appaiono come eventi premuti contro l&#39;asse quando visualizzare un istogramma di istone H3 colorazione. Dal momento che questi eventi si inclinare il generale IFM, questi eventi possono essere omessi dall&#39;analisi da Gating la normale distribuzione di cellule positive istone H3. Ulteriore assistenza può essere trovato nella Guida alla risoluzione dei problemi (Tabella 1). L&#39;inclusione di una macchia risolvibile cellula morta permette per la valutazione della vitalità cellulare nel saggio. Questo è assolutamente fondamentale quando si manipolano attivazione delle cellule T, perché certi stimoli possono indurre la morte delle cellule. In tal caso, l&#39;anticorpo può legarsi istone H3 istoni in cellule morte diverso rispetto cellule vive, portando a errata interpretazione dei risultati. Questo protocollo è progettato per l&#39;uso in formato piastra a 96 pozzetti, permettendo un alto rendimento di analisi dello stato della cromatina. Un milza da un 6-8 settimane vecchia femmina del mouse in genere di rendimento tra 60-90.000.000 cellule usando il protocollo. Poiché il protocollo di colorazione richiede 2 milioni di cellule per campione, si può facilmente eseguire il test di più gruppi di trattamento e punti temporali in triplice copia con un unico milza una singola piastra a 96 pozzetti. È possibile perfo rm il protocollo con meno cellule per campione; tuttavia, a causa del numero di fasi di centrifugazione e la perdita intrinseca di celle in ciascuna di queste fasi, non è consigliabile per ridurre il numero di celle di molto. Abbiamo completato con successo il protocollo con 1 milione di cellule per campione. Abbiamo utilizzato questo protocollo per esaminare lo stato della cromatina in cellule helper CD4 + T e cellule T citotossiche CD8 +. Ciò è reso possibile in quanto il protocollo comprende colorazione della superficie standard. Il protocollo può essere facilmente adattato per l&#39;esame della cromatina in altre sottopopolazioni linfocitarie utilizzando anticorpi contro marcatori di superficie specifici di popolazione. Questo protocollo potrebbe anche essere facilmente adattato ad altri tipi di cellule, purché anticorpi che riconoscono marcatori di superficie rilevanti sono condizioni fissaggio / permeabilizzazione disponibili e propri sono noti.

Citometria a flusso è una tecnologia laser sviluppata per l&#39;analisi di più parametri fisici e in popolazioni di cellule fluorescenti. Questa tecnologia funziona come cellule sospese in un flusso di fluido incontro un laser, marcatori fluorescenti eccitanti sopra o dentro le cellule. Questi marcatori quindi emettono luce che viene rilevato e quantificato da tubi fotomoltiplicatori. Mentre citometria a flusso è stato tradizionalmente usato per identificare popolazioni di cellule, che ha dimostrato di essere una tecnologia utile quando si studia una serie di proprietà delle celle tra cui l&#39;integrità della membrana cellulare, interazioni proteina-proteina e proteina traffico di 1-3. Abbiamo sviluppato un protocollo che permette questa tecnologia da utilizzare per rilevare lo stato della cromatina in cellule T che sono state attivate in vitro 4. Abbiamo anche usato questo protocollo per indagare il meccanismo di attivazione indotta cromatina decondensazione delle cellule T 5. Activatio cellule Tn e la proliferazione sono critici per una risposta immunitaria appropriata. Cellule T, un sottoinsieme di linfociti nel sistema immunitario, sono necessari per le risposte immunitarie adeguate e lo sviluppo della memoria immunologica. L&#39;attivazione viene avviata quando un antigene è presentato nel contesto del complesso maggiore compatibilità al recettore delle cellule T (TCR) che si trova sulla superficie extracellulare delle cellule T quiescenti (valutata in 6). Questo innesca una serie di eventi molecolari dinamici e altamente ordinati all&#39;interno delle cellule T che culminano in un aumento di Ca2 + intracellulare concentrazione 7 e la traslocazione nucleare di fattori di trascrizione necessari per l&#39;attivazione (recensito in 8-10). Una volta attivate, le cellule T acquisiscono la capacità di rispondere alle interleuchina-2 (IL-2), un potente fattore di crescita che utilizza la JAK (Janus Kinase) / STAT (segnale del trasduttore e attivatore di trascrizione) percorso per guidare la proliferazione clonale di attivazione T 11 cellule. Brevemente, IL-2 stimolazionerisultati nella fosforilazione di proteine ​​STAT, una famiglia di fattori di trascrizione latenti citosolico. Una volta fosforilata, proteine ​​STAT dimerize, traslocano nel nucleo e guidare l&#39;espressione dei geni compresi quelli operanti nel progressione del ciclo cellulare. Nelle cellule T, IL-2 segnali via STAT5, che è richiesto per la proliferazione cellulare T 12,13. Per conseguire l&#39;espansione clonale delle cellule T attivate, quelle cellule che non hanno sperimentato l&#39;antigene-TCR impegno (cellule T naive), devono avere un meccanismo per ignorare i potenti effetti di IL-2. Questo risultato è ottenuto attraverso la regolazione dello status di cromatina. Le cellule T naive in possesso di una cromatina condensata che proibisce l&#39;impegno STAT5-DNA in risposta a IL-2 stimolazione. Dopo l&#39;attivazione, decondenses cromatina e STAT5 possono accedere i promotori dei geni bersaglio, permettendo la proliferazione clonale 4. È interessante notare che questo cambiamento di status della cromatina non dipende modificazione epigenetica dell&#39;istone Proteins (per la revisione, vedi 14), come abbiamo osservato nessun cambiamento globale nella modificazione degli istoni durante l&#39;attivazione delle cellule T 4. Durante l&#39;esecuzione di questi studi, abbiamo scoperto che gli anticorpi contro le proteine ​​istoniche sollevate anche avuto difficoltà ad accedere loro epitopi in cellule naive, ma che al momento dell&#39;attivazione potessimo più facilmente legare i loro epitopi 4. Così, legame con istoni anticorpo funge da lettura per lo status condensazione della cromatina. Qui vi presentiamo il metodo da utilizzare citometria a flusso per rilevare gli anticorpi dell&#39;istone H3 fluorescente coniugati al fine di valutare lo stato della cromatina in cellule T. Condensazione della cromatina in una popolazione di cellule viene misurata l&#39;intensità media di fluorescenza (MFI) di istone H3 colorazione. Nel contesto di attivazione delle cellule T, la MFI di dell&#39;istone H3 colorazione aumenta, a significare la decondensazione della cromatina. Oltre a misurare lo stato della cromatina via intracellulare colorazione istone H3, questo protocollo Incorpora ancheTES superficie colorazione e una macchia risolvibile per le cellule vive, che permette l&#39;analisi di sottopopolazioni di cellule.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale da 100 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio smerigliati prepuliti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per cellule sterile, rete di nylon da 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 3 ml, punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubo conico in polipropilene da 50 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>Kit di colorazione di cellule morte rosse riparabili LIVE/DEAD</td><td>Life Technologies</td><td>L23102</td><td>Life Technologies vende versioni di questo kit con colori diversi</td></tr><tr><td>Blocco Fc</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>16% di paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Normale siero di coniglio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9133</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-H3K4me1</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Kit di coniugazione R-Ficoeritrina</td><td>Abcam</td><td>ab102919</td><td>In alternativa, è possibile utilizzare il kit LYNX rapid RPE di AbD Serotec</td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule t

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Durante una risposta immunitaria appropriata, cellule T quiescenti diventano attivate su presentazione dell&#39;antigene al loro recettore delle cellule T antigene-specifiche. Questo porta alla proliferazione clonale delle sole cellule T che portano un recettore che riconosce l&#39;antigene. Decondensazione cromatina è un segno distintivo di attivazione delle cellule T ed è necessario per le cellule T di acquisire la capacità di proliferare dopo l&#39;antigene fidanzamento. Questo cambiamento di condensazione della cromatina può essere rilevato utilizzando anticorpi diretti contro le proteine ​​istoniche. Questi anticorpi non possono legarsi ai loro epitopi in cellule T naive come possibile in cellule T attivate. Abbiamo descritto come macchia simultaneamente marcatori di superficie specifica delle cellule T, vitalità pista con una macchia fissabile cellule morte, e misurare lo stato della cromatina tramite colorazione intracellulare di proteine ​​istone H3. Cellule colorate vengono analizzati mediante citometria di flusso e lo stato condensazione della cromatina viene misurata l&#39;intensità media di fluorescenza (MFI) della macchia istone H3. Chromatin decondensazione durante l&#39;attivazione delle cellule T è dimostrato come un aumento del MFI

Linfociti da un C57B / 6 topo sono stati trasformati in una sospensione di cellule singole secondo il protocollo e contate con un emocitometro standard. Le cellule sono state seminate in triplicato a 2 x 10 6 / ml in mezzi T-cellule in 15 ml provette coniche e se non trattati, o stimolate con 1 mg / anticorpi anti-CD3 solubili mL (clone 4C11) per 3 ore a 37 ° C in un tessuto culturale incubatore standard. Le cellule morte sono state colorate e poi le cellule sono state poi superficie macchiata con anticorpi coniugati con CD8 e APC-CD4 secondo il protocollo. Istone accessibilità è stata analizzata mediante citometria a flusso (Figura 4). Nelle cellule CD4 + e CD8 + T entrambi ingenui, l&#39;intensità fluorescenza media (MFI) è bassa, che significa uno stato della cromatina condensata. Mentre le cellule sono attivate con anticorpi anti-CD3 le IFM aumenta in modo significativo (p &lt;0.001, test t di Student) che indica che la cromatina è decondensazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Figura 1. Tecnica da lavorazione milze in una sospensione di cellule singole usando vetrini da microscopio smerigliato. (A) La milza è premuto contro le superfici smerigliati due vetrini da microscopio. (B) Le diapositive vengono spostate avanti e indietro uno contro l&#39;altro i linfociti rilasciando in una capsula di Petri 100 millimetri fino a quando i resti della milza sono bianchi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Figura 2. Utilizzando un tappo siringa per premere rimanente polpa rossa attraverso un colino cella di 70 millimetri. (A) polpa rossa che rimane dopo una milza i<html> s trasformato in una sospensione di cellule singole e fatta passare attraverso il filtro cella 70 mm. (B) La porzione del tappo di una siringa 3 ml viene usato per premere delicatamente rimanente polpa rossa attraverso il filtro cella. (C) Dopo l&#39;uso della siringa, ci dovrebbe essere praticamente senza polpa rossa a sinistra nel colino cella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Fate clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Figura 3. ACK lisi dei globuli rossi. (A) centrifugazione di una sospensione di cellule singole generato da una singola spleniche di topo prima ACK lisi. (B) Dopo ACK lisi dei globuli rossi, il pellet dovrebbe essere bianco.ottenere = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Figura 4. Risultati rappresentativi del protocollo. Schema (A) gating utilizzate per analizzare lo stato della cromatina in linfociti T CD4 +. (B e C) le cellule T sono stati lasciati non trattati o attivati ​​con / anticorpi anti-CD3 ml solubili 1 mg per 3 ore (in triplice copia). Le cellule sono state poi analizzate mediante citometria di flusso per determinare la condensazione della cromatina in cellule CD4 + (B) e CD8 + (C). I dati sono la media ± deviazione standard dell&#39;intensità di fluorescenza media H3K4me1 colorazione. * p &lt;0,001 (t-test di Student) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate h</a>ere per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tabella 1:. Guida alla risoluzione un riferimento rapido per i problemi più comuni e le possibili soluzioni.

Citometria a flusso può essere utilizzato per valutare lo stato della cromatina in cellule T. Questo protocollo permette agli scienziati di interpretare prove di cromatina decondensazione durante l&#39;attivazione delle cellule T dimostrato da un aumento dell&#39;intensità media fluorescenza (MFI) di anticorpi fluorescenti istone H3

L&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è valutare lo stato di condensazione della cromatina nelle cellule T. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'attivazione delle cellule T, in particolare a come la cromatina regoli la proliferazione clonale.Il principale vantaggio di questa tecnica è che può rilevare cambiamenti sottili osservati nelle fasi iniziali dell'attivazione dei linfociti T. Dopo l'eutanasia di topi isogenici di sei-otto settimane di età, spruzzare abbondantemente gli animali con una soluzione al 70% di etanolo ed orientarli in modo che la testa sia rivolta verso sinistra utilizzando pinze. Sollevare la pelle verso l'alto e lontano dal corpo.Quindi praticare una piccola incisione attraverso la cute vicino all'addome. Utilizzando le dita, tirare ciascun lato dell'incisione per esporre il peritoneo dal collo fino all'inizio delle zampe posteriori.La milza dovrebbe essere visibile direttamente al di sotto del peritoneo. Successivamente, utilizzare la pinza per sollevare il peritoneo e quindi praticare un piccolo taglio per esporre la milza. Rimuovere la milza con la pinza e utilizzare le forbici per staccare qualsiasi tessuto adiposo e connettivo residuo ancora attaccato alla milza.Posizionare un milza in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PBS integrato con FBS al 2%, di seguito indicato come 2%. Lasciare il tubo sul ghiaccio fino al momento di proseguire con la procedura. Una volta raccolte tutte le milze, versarle in una piastra sterile per colture tessutali da 100 millimetri. Prendere due vetrini smerigliati e tenerli in modo che le due superfici ruvide e smerigliate siano rivolte verso l'interno, l'una di fronte all'altra.Quindi inumidire i vetrini nella soluzione al 2% dalla piastra di Petri. Posizionare la milza tra le superfici smerigliate dei vetrini, mantenendo i bordi ancora immersi. Macerare delicatamente la milza muovendo i vetrini avanti e indietro l'uno contro l'altro.Continuare la macerazione fino a quando tutte le cellule sono state rilasciate e i residui della milza appaiono bianchi. Quindi aspirare la sospensione cellulare in una pipetta e filtrarla lentamente attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un nuovo tubo conico sterile da 50 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di PBS al 2% per raccogliere le restanti cellule utilizzando la parte del tappo di una siringa da tre millilitri.Premere delicatamente la polpa rossa contenente le cellule residue attraverso il filtro. Assicurarsi di premere sia sul fondo che sui lati del filtro per garantire che tutta la polpa rossa sia passata attraverso il filtro. Successivamente, risciacquare la piastra per colture cellulari con 10 millilitri di 2% e quindi utilizzare questa soluzione per lavare lozioni, tappo e piastra al fine di recuperare eventuali cellule residue.Filtrare la soluzione attraverso lo stesso filtro cellulare da 70 micron e raccoglierla in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Decantare con attenzione e scartare il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet, lasciando un'infima quantità del 2% nel tubo.Coprì il tubo e agìtalo delicatamente fino a quando il pellet non è completamente risospeso nella soluzione residua. Successivamente, aggiungere due millilitri di buffer di lisi Act per milza alla miscela. Per lisare i globuli rossi, ruotare e capovolgere delicatamente il tubo per un minuto per assicurarsi che tutte le cellule vengano a contatto con il buffer di lisi.Dopo l'incubazione di un minuto, portare il volume della sospensione cellulare a 50 millilitri aggiungendo il 2% al tubo. Capovolgere il tubo 10 volte, quindi centrifugare la soluzione per cinque minuti a 300 ×g e a quattro gradi Celsius. Decantare delicatamente e scartare il surnatante avendo cura di non disturbare il pellet bianco.Lasciare una traccia di 2% nel tubo, chiuderlo con il tappo e quindi agitare delicatamente il pellet per risospendere. Sospendere il campione. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di mezzo per linfociti T e risospendere ulteriormente.Sospendere il pellet aspirando e dispensando delicatamente con una pipetta. Quindi filtrare la sospensione attraverso un nuovo filtro da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri pulito. Utilizzare altri cinque-dieci millilitri di mezzo per linfociti T per risciacquare il tubo originale e far passare anche questa soluzione attraverso il filtro da 70 micron.Contare le cellule e valutare la vitalità. Utilizzando il metodo del blu di tripano e un emocitometro, mantenere le cellule sul ghiaccio fino al momento della colorazione. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione per 10 minuti a 300 × g a quattro gradi Celsius.Quindi risospendere le cellule nel mezzo per linfociti T fino a una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro. Trasferire 2 milioni di cellule in 100 microlitri di mezzo nei pozzetti di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti con fondo a U, da centrifugare. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 10 minuti a 300 ×g e a 4 °C.Una volta terminato, rimuovere il surnatante da ogni pozzetto scuotendo il liquido presente nei pozzetti nel lavandino e tamponando la piastra su un tovagliolo di carta pulito. Successivamente, risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS per lavarle, quindi procedere alla centrifugazione a 300 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante scuotendo nuovamente la piastra, quindi aggiungere 100 microlitri di colorante rosso fissabile per cellule morte, appena preparato, a ciascun pozzetto.Incubare bene la piastra a quattro gradi Celsius per 30 minuti, proteggendola dalla luce. Successivamente, centrifugare la piastra per 10 minuti a 300 ×g a quattro gradi Celsius. Da questo momento in poi, eseguire tutte le operazioni con la piastra all'interno della cappa a flusso laminare con la luce spenta.Rimuovere il soprannatante eliminandolo con un colpetto alla piastra, quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di blocco FC in ciascun pozzetto. Successivamente, preparare gli anticorpi primari anti-CD4 e anti-CD8 diluendoli con PBS secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 100 microlitri degli anticorpi diluiti nei rispettivi pozzetti e incubare la piastra per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Sebbene sia protetto dalla luce dopo l'incubazione del colorante di superficie, lavare le cellule due volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide appena preparata al 4% in ogni pozzetto e incubare la piastra a 96 pozzetti per cinque minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, lavare le cellule due volte in PBS, quindi aggiungere 40 microlitri di una soluzione di permeabilizzazione e blocco contenente PBS con FBS al 2%, Trix 0,02% e siero di coniglio normale al 10%. Mescolare bene ogni pozzetto aspirando e dispensando delicatamente, avendo cura di non formare bolle.Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente per 45 minuti al buio. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di un anticorpo anti istone H tre K quattro ME uno coniugato con un fluorocromo, diluito nella soluzione di permeabilizzazione e blocco, in ciascun pozzetto. Mescolare nuovamente delicatamente i pozzetti aspirando e dispensando su e giù con una pipetta il marcatore per l'istone.La concentrazione dell'anticorpo H tre può variare e deve essere titolata ogni volta che viene preparata. Incubare la piastra a 96 pozzetti al buio per un'ora a quattro gradi Celsius. Infine, lavare le cellule due volte in 2% e quindi risospendere in 200 microlitri di 2%. Per l'analisi FACS, gli anticorpi contro l'istone H tre non riescono ad accedere facilmente ai loro epitopi nelle cellule naive, ma dopo l'attivazione delle cellule T, questi stessi anticorpi sono in grado di legarsi ai loro epitopi.Qui viene mostrata l'intensità media della fluorescenza della colorazione dell'istone H tre in cellule CD quattro positive e CD otto positive, non trattate o attivate con un microgrammo per millilitro di anticorpi anti CD tre solubili per tre ore. L'aumento significativo dopo l'attivazione indica che la cromatina si è decondensata nei campioni trattati. Una volta appresa, questa esperimento può essere eseguito in 11-14 ore a seconda della progettazione sperimentale.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la citometria a flusso per valutare la condensazione della cromatina nei linfociti T.

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