Name: Uno studio della Complessazione di Mercurio (II) con Dicysteinyl Tetrapeptidi da Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Scopri la caratterizzazione dei complessi mercurio-peptidi dicisteinil mediante spettrometria di massa orbitrap con ionizzazione elettrospray. Questo metodo analizza i complessi ionici metallici con frammentazione trascurabile.

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MN-S riconosce il sostegno della National Science Foundation, RUI concedere CHE 1011859. Gli autori ringraziano lo strumento Triade Spettrometria di Massa presso la University of North Carolina a Greensboro per l&#39;uso del spettrometro di massa Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Gli autori ringraziano Daniel Todd, Vincenzo Sica, e Brandie Erhmann presso la University of North Carolina a Greensboro per utili suggerimenti e commenti questo lavoro.

Nota: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza pertinenti (MSDS) prima dell&#39;uso. Cloruro di mercurio è una sostanza chimica tossica. Dispositivi di protezione individuale (guanti, occhiali di sicurezza, e camice) devono essere indossati al momento della consegna e tutte le soluzioni collegate. Smaltire le soluzioni in bottiglie rifiuti chimici chiaramente etichettati designate per i metalli pesanti. 1. Preparazione di 5 mm degassificato ammonio formiato tampone, pH 7,5 <ol><li> Sciogliere 0,1576 g di buffer di formiato di ammonio in 450 ml di acqua per HPLC. Regolare il pH della soluzione sopra con 1 M di acido formico e 1 M di idrossido di ammonio a 7,5. Trasferire questa soluzione in un matraccio tarato da 500 ml e aggiungere acqua HPLC per la retta di calibrazione per ottenere una soluzione di ammonio formiato 5 mM. </li><li> Degassare il 5 mM tampone formiato di ammonio sotto un sistema di aspirazione per 10 minuti e spurgo con argon. Ripetere due volte e la soluzione di negozio sotto argon. Il giorno di utilizzo, filtrare la soluzione tampone attraverso un filtro da 0,2 micron before l&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di mercurio (II) Chloride Soluzioni <ol><li> Pesare 0,2375 g di mercurio (II) cloruro. Sciogliere in 25 ml di 5 mM tampone formiato di ammonio per produrre una soluzione di cloruro di 0,035 M di mercurio (II). </li><li> Aggiungere 0,214 ml di soluzione 0,035 M di mercurio (II) cloruro di 9.785 ml di 5 mM tampone formiato di ammonio per creare una soluzione 7,5 x 10 -4 M. Ricoprire la soluzione con gas argon 7.5 x 10 -4 M mercurio (II). </li></ol> 3. Preparazione del CGGC Stock Solution <ol><li> Sciogliere 2,0 mg di tetrapeptide dicysteinyl, CGGC, in 0,118 ml di acetonitrile grado HPLC e quindi aggiungere 1,0647 ml di 5 formiato di ammonio mM, pH 7,5 tampone che è stato degasata in argon per ottenere una soluzione madre 5 CGGC mm. </li><li> Aggiungere 225 ml di soluzione madre 5 CGGC mM a 1.275 ml di 5 mM formazione ammonio pH 7,5 tampone per dare una soluzione 7,5 x 10 -4 M CGGC. </li></ol> 4. Preparazionedi varie miscele di reazione di mercurio (II) e CGGC <ol><li> Preparazione 1: 0,5 rapporto di mercurio (II): soluzione CGGC <ol><li> Mettere 255 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio. </li><li> Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 15 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M CGGC nella microcentrifuga 1,5 ml. Vortex la soluzione per 10 secondi. Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti prima dell&#39;iniezione nello spettrometro di massa. </li></ol></li><li> Preparazione di rapporto 1: 1 di mercurio (II): soluzione CGGC <ol><li> Mettere 240 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio. </li><li> Vortex la soluzione per 10 secondi. Poiaggiungere 30 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M CGGC nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1. </li></ol></li><li> Preparazione di rapporto 1: 2 di mercurio (II): soluzione CGGC <ol><li> Mettere 210 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio. </li><li> Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 60 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M CGGC nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1. </li></ol></li></ol> 5. Preparazione di PECO Stock Solution <ol><li> Sciogliere 3,5 mg di tetrapeptide dicysteinyl, PECO, in 0,145 ml di acetonitrile grado HPLC per sciogliere il peptide. Poi aggiungere 13.067 ml di 5 mM formiato di ammonio, pH 7,5 tampone che è stata degasata in argon per produrre 0,5 mSoluzione M PECO. </li><li> Agitare la soluzione fino a quando tutti peptide è disciolto. Aggiungere 1,125 ml di soluzione 0,5 mM PECO e 0,375 ml di 5 mM formiato di ammonio, pH 7,5 tampone in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per ottenere una soluzione 7,5 x 10 -5 M PECO. Vortex fino misti. </li></ol> 6. Preparazione di varie miscele di reazione di mercurio (II) e soluzione PECO <ol><li> Preparazione 1: 0,5 rapporto di mercurio (II): soluzione PECO <ol><li> Mettere 255 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio. </li><li> Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 15 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M PECO nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1. </li></ol></li><li> Preparazione di rapporto 1: 1 di mercurio (II): soluzione PECO <ol><li> Mettere 24081; l di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio. </li><li> Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 30 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M PECO nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1. </li></ol></li><li> Preparazione di rapporto 1: 2 di mercurio (II): soluzione PECO <ol><li> Mettere 210 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio. </li><li> Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 60 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M PECO nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1. </li></ol></li></ol> 7. Analyzing le miscele di reazione di Mercurio (II) e CGGC campioni da Orbitrap ESI Spettrometria di Massa <ol><li> Preparazione del spettrometro di massa ESI 16 <ol><li> Disegnare 100 ml di standard di calibrazione in una siringa di vetro da 500 ml. </li><li> Posizionare la siringa nella culla della siringa della pompa MS, collegare il tubo, e iniettare lo spettrofotometro di massa. </li><li> Impostare il nome del file per la corsa selezionando l&#39;icona del file e digitando il nome del file. </li><li> Selezionare il pulsante dei dati acquisiscono, nel modulo di acquisizione dati e raccogliere 150 scansioni. </li><li> Analizzare il cromatogramma per verificare gli standard di calibrazione aprendo modulo di elaborazione di dati del software. Aprire il modulo, andare al menu File e selezionare &quot;aperto&quot;, e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che i picchi nel cromatogramma sono correlati alla massa di addebitare i rapporti degli standard. </li><li> Pulire la siringa di vetro da 500 ml, elaborando 500 microlitri HPLC metanolo e poi dispensare il metanolo in un becher. </li><li> Elaborare 500 ml di metanolo per HPLC nella siringa di vetro e lavare il sistema di cui al punto 7.1.2. </li><li> Selezionare il modulo di impostazione metodo di software per impostare i parametri. Scegliere il menu della modalità di scansione e identificare l&#39;analizzatore come FTMS, e quindi fare clic su &quot;OK&quot;. Poi cliccando sulle varie icone nella pagina vista spettro in tempo reale, impostare i seguenti parametri: Guaina portata del gas: 10, temperatura Fonte: 0, tensione capillare: 37 V, lente del tubo: 95 V, tensione Spray: 4.20 kV , Portata 10.00 ml / min, Analyzer: FTMS, Numero di scansioni: 150. </li></ol></li><li> Esecuzione di campioni CGGC su ESI spettrometro di massa <ol><li> Eseguire il formiato di ammonio pH 7,5 tampone 5 mm. <ol><li> Mettere 500 ml di 5 mM tampone formiato di ammonio nella siringa di vetro da 500 ml, metterlo nella culla della siringa della pompa MS, e collegare il tubo. </li><li> Eseguire tampone attraverso il tubo per 1-2 min. </li><li> Impostare il nome del file per la corsaselezionando l&#39;icona del file e digitando il nome del file. </li><li> Selezionare il pulsante dei dati acquisiscono nel modulo e raccogliere 150 scansioni. </li><li> Fare clic sul pulsante di esecuzione per interrompere la raccolta dopo 150 scansioni vengono raccolti. </li><li> Aprire il modulo del browser di dati, quindi andare al menu File e selezionare &quot;aperto&quot;, e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che non picchi a 483, 683, 1.163 e 1.363 m / z sono presenti che assomigliano il peptide o il mercurio (II) -peptide. </li></ol></li><li> Eseguire il 1: 0,5 mercurio (II): soluzione rapporto CGGC. <ol><li> Mettere 250 ml di 1: 0,5 mercurio (II): rapporto CGGC del campione nella siringa. </li><li> Posizionare la siringa nella culla della siringa della pompa MS, collegare il tubo, e il primo l&#39;apparato. </li><li> Selezionare un nome di file per la corsa selezionando l&#39;icona del file e digitando il nome del file. </li><li> Premere il pulsante di dati acquisiscono, nel modulo di acquisizione dati e di raccogliere 150 scansioni e fare clic sul pulsante di esecuzione per fermare la raccolta. </li><li> Aprire il modulo, andare al menu File e selezionare &quot;aperto&quot;, e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che il cromatogramma contiene picchi compreso quello per il peptide CGGC sola. </li><li> Lavare la siringa aspirando con 500 microlitri di buffer formiato di ammonio e quindi l&#39;erogazione del buffer formiato di ammonio in un becher. </li><li> Selezionare il pulsante rifiuti MS e lavare la tubazione tre volte con 500 microlitri di buffer formiato di ammonio. </li><li> Lavare la siringa aspirando con 500 microlitri di metanolo e quindi l&#39;erogazione del metanolo in un becher. </li><li> Lavare l&#39;unica volta tubazione da 500 microlitri metanolo. </li><li> Selezionare il pulsante rilevatore carico sui SM. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone formiato di ammonio alla siringa. </li><li> Posizionare la siringa nella culla della siringa della pompa MS, collegare il tubo, e il primo l&#39;apparato. </li><li> Selezionare un nome di file per il buffer gestito selezionando l&#39;icona del file e digitando il nome del file. </li><li> stampail pulsante di dati acquisire e raccogliere 150 scansioni e quindi fare clic sul pulsante di esecuzione di arresto. </li><li> Aprire il modulo del browser di dati, andare al menu File e selezionare &quot;aperto&quot;, e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che il cromatogramma è privo di picchi del precedente Hg: corsa CGGC. </li></ol></li><li> Eseguire il 1: 1 di mercurio (II): soluzione rapporto CGGC. <ol><li> Mettere 250 ml di 1: 1 di mercurio (II): rapporto CGGC campione nella siringa. </li><li> Ripetere in un modo simile a quello descritto per passaggi 7.2.2.2 a 7.2.2.15. </li></ol></li><li> Eseguire il 1: 2 di mercurio (II): Soluzione rapporto CGGC <ol><li> Mettere 250 ml di 1: 2 di mercurio (II): CGGC campione concentrazione nella siringa. </li><li> Ripetere in un modo simile a quello descritto per passaggi 7.2.2.2 a 7.2.2.15. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. Analizzando le miscele di reazione di Mercurio e Campioni PECO di Orbitrap ESI Spettrometria di Massa <ol><li> Esecuzione di campioni PECO su ESI spettrometro di massa <ol><li> Ripetere la procedura di analisi (passaggi 7,1-7,2) utilizzando campioni PECO e miscele di reazione di mercurio (II) e PECO a vari rapporti stechiometrici. </li></ol></li></ol>

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Non vi è alcuna divulgazione per il lavoro riportato.

Il dicysteinyl tetrapeptide idrofoba CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; PM = 338) (Figura 1), forma complessi con mercurio (II) come mostrato in Figura 2 e Tabella 1 Inoltre, forma dimeri peptidici e trimeri. incrementale come aumenta la quantità di peptide nella miscela di reazione. Come mostrato dai valori m / z dei dimeri associati [(2M + H) + = 677] e trimeri [(3M + H) + = 1.015]...

Gli attuali farmaci clinici prescritti per la terapia chelante dell'avvelenamento da mercurio1 contengono gruppi tiolici, che sono responsabili del legame e del sequestro degli ioni mercurio2,3. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che questi piccoli composti tiolici [acido dimercaptosuccinico (DMSA) e acido dimercaptopropano-solfonico (DMPS)] non sono ottimali per la terapia chelante del mercurio4-6. Pertanto, è necessario comprendere l'associazione e le tendenze di formazione complessa del mercurio con i tioli per migliorare la progettazione razionale dei farmaci dei composti tiolici per la chelazione del mercurio. Recentemente, abbiamo riportato che i tripeptidi n-alchilici e arilicisteinilici con gruppi ditiolici possono fungere da efficaci "doppie ancore" per accogliere i siti di coordinazione del mercurio (II) per formare i complessi 1:1 mercurio(II):p eptide e 1:2 mercurio(II):(peptide)2 7. Inoltre, abbiamo studiato l'effetto dell'aumento dei residui di cisteinle su formazioni di tipo complesso8. In questo studio, indaghiamo l'associazione del mercurio(II) con due dicicesteinil tetrapeptidi, dove i residui di cisteinil sono separati da due residui di amminoacidi. Al fine di valutare l'effetto dei gruppi leganti ausiliari per il mercurio, gli amminoacidi intermedi sono due residui di glicina (non sostituiti) o due residui di acido glutammico (gamma-carbossilati). 
La reazione del peptide cisteinico con il mercurio (II) richiede condizioni che impediscano l'ossidazione dei gruppi cisteinil tiolico per formare legami disolfuro9. Inoltre, l'associazione del mercurio(II) con i peptidi cisteinilici per formare vari tipi di complessi mercurio-peptide dipende dal rapporto iniziale del mercurio(II): peptide nella miscela di reazione7,8. I tipi di complessi mercurio-peptide formati in queste miscele di reazione possono essere analizzati mediante spettroscopia di massa a ionizzazione morbida, che è uno strumento analitico sensibile per determinare le interazioni di specie tra ioni metallici e peptidi10-14. Di conseguenza, fornirà un profilo dei vari tipi di addotti peptidici mercuriati che si formano in una specifica condizione di ionizzazione elettrospray. Qui, mostreremo come i peptidi cisteinilici e le soluzioni di cloruro di mercurio (II) possono essere preparati in una soluzione tampone di formiato di ammonio degassata ricoperta di argon per ridurre al minimo l'ossidazione. Facendo reagire diverse moli equivalenti di mercurio (II) con dicicisteinil tetrapeptidi, mostreremo come il rapporto iniziale di mercurio (II) :p eptide abbia un effetto sui tipi di complessi formati. Mostreremo anche come la spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI) possa essere utilizzata come strumento di caratterizzazione per fornire un'accurata stechiometria del mercurio in peptide nei complessi formati. Il protocollo video associato dimostrerà le condizioni sperimentali per la preparazione dei complessi di mercurio, la procedura per l'analisi delle miscele di reazione in specifiche condizioni di ionizzazione elettrospray e la caratterizzazione delle stechiometrie dei complessi tetrapeptidi di mercurio(II)-dicicisteinile, sulla base dei distinti modelli di distribuzione isotopica del mercurio, utilizzando il programma ChemCal15. Ha lo scopo di assistere coloro che sono interessati all'utilizzo della spettrometria di massa orbitrap ESI per analizzare vari complessi formati da ioni metallici che esistono in diverse forme isotopiche.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di mercurio (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td></td></tr><tr><td>Formiato di ammonio</td> altamente tossico <td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>Fisher</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>Acqua HPLC</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Pescatore di metanolo</td><td></td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

uno studio della complessazione di mercurio (ii) con dicysteinyl tetrapeptidi da electrospray ionizzazione spettrometria di massa

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In questo studio abbiamo valutato un metodo per la caratterizzazione di complessi, formati in diversi rapporti relativi di mercurio(II) e dicicesteinil tetrapeptide, mediante spettrometria di massa orbitrap a ionizzazione elettrospray. Questa strategia si basa su una precedente caratterizzazione di successo di complessi mercurio-dicicesteinil che coinvolgono tripeptidi utilizzando la spettrometria di massa tra le altre tecniche. Il cloruro di mercurio(II) e un dicicisteinil tetrapeptide sono stati incubati in un terreno tamponato degassato a rapporti stechiometrici variabili. I complessi formati sono stati successivamente analizzati su uno spettrometro di massa elettrospray costituito da un analizzatore di massa ibrido lineare a trappola ionica e orbi. Gli spettri della spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) sono stati acquisiti in modalità positiva e i picchi osservati sono stati quindi analizzati per individuare i distinti modelli di distribuzione isotopica del mercurio e il picco monoisotopico associato. Questo lavoro dimostra che un'accurata stechiometria del mercurio e del peptide nei complessi formati in specifiche condizioni di ionizzazione elettrospray può essere determinata utilizzando ESI MS ad alta risoluzione basata su distinti modelli di distribuzione isotopica del mercurio.

<html> Uno studio è stato effettuato per caratterizzare l&#39;eventuale mercurio peptide complessa composizione per due tetrapeptidi, CGGC e PECO (Figura 1) mediante spettrometria di massa ESI. Complessi di mercurio (II) con CGGC o PECO sono stati studiati facendo reagire le miscele di mercurio (II) e soluzioni di peptidi a tre differenti rapporti molari: 1: 0.5, 1: 1 e 1: 2 (mercurio (II): peptide) . La concentrazione di mercurio (II) era 7,5 x 10 -6 M e la co...

Viene presentata la caratterizzazione dei complessi formati in diversi rapporti relativi di mercurio (II) e dicicesteinil tetrapeptidi mediante spettrometria di massa orbitrap a ionizzazione elettrospray.

Uno studio della Complessazione di Mercurio (II) con Dicysteinyl Tetrapeptidi da Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare complessi di mercurio e peptidi dicisteinilici in diverse stechiometrie di reazione e caratterizzare i diversi complessi formati mediante spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray e analizzatore oribitrap. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le tendenze di complessazione del mercurio con composti tiolici, migliorando così la progettazione razionale di agenti chelanti per l'immobilizzazione degli ioni mercurio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita l'analisi dei complessi di ioni metallici con frammentazione trascurabile.Altri includono un distinto schema di distribuzione isotopica del mercurio. La facilit&agrave; nell'assegnare la carica e nell'analizzare i picchi sovrapposti mediante spettrometria di massa in tandem. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sui complessi peptidici del mercurio, pu&ograve; essere applicato anche ad altri complessi, in particolare a ioni metallici che esistono in diverse forme isotopiche.Deaerare un tampone di formiato di ammonio 5 millimolare sotto vuoto per 10 minuti ed eliminare l'aria con argon. Ripetere due volte e conservare la soluzione sotto argon. Nel giorno d'uso, filtrare la soluzione tampone attraverso un filtro da 0,2 micron prima dell'impiego.Per preparare soluzioni di cloruro di mercurio, pesare 0,2375 grammi di cloruro di mercurio. Sciogliere in 25 millilitri di tampone formiato di ammonio 5 millimolare, per ottenere una soluzione di cloruro di mercurio 0,035 molare. Aggiungere 0,214 millilitri della soluzione di cloruro di mercurio a 9,785 millilitri di tampone formiato di ammonio 5 millimolare, per ottenere una soluzione 0,75 millimolare.Coprire la soluzione risultante con gas argon. Successivamente, aggiungere 225 microlitri di una soluzione madre di CGGC 5 millimolare a 1,275 millilitri di tampone di formiato di ammonio 5 millimolare a pH 7,5, ottenendo una soluzione di CGGC 0,75 millimolare. Quindi, preparare una soluzione in rapporto 1 a 0,5 di mercurio rispetto a CGGC ponendo 255 microlitri di tampone di formiato di ammonio 5 millimolare a pH 7,5 in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi, aggiungere 30 microlitri di soluzione di cloruro di mercurio 0,75 millimolare nel tubo. Vortexare la soluzione per 10 secondi. Quindi, aggiungere 15 microlitri di soluzione CGGC 0,75 millimolare nel tubo.Vortexare la soluzione per altri 10 secondi, quindi lasciarla riposare per 10 minuti prima dell'iniezione nello spettrometro di massa. Per preparare lo spettrometro di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray, o MS, aspirare 100 microlitri di standard di calibrazione in una siringa di vetro da 500 microlitri. Posizionare la siringa nel supporto della siringa della pompa dello spettrometro di massa.Collegare il tubo e iniettare nello spettrometro di massa. Impostare il nome del file per l'analisi selezionando l'icona del file e digitando il nome desiderato. Selezionare il pulsante acquisisci dati nel modulo di acquisizione dati e raccogliere 150 scansioni.Analizzare il cromatogramma per verificare gli standard di calibrazione aprendo il modulo di elaborazione dati del software. Quindi, accedere al menu file e selezionare apri, seguito dal file nella finestra di dialogo. Verificare che i picchi nel cromatogramma corrispondano ai rapporti massa/carica degli standard.Pulire la siringa di vetro da 500 microlitri aspirando 500 microlitri di metanolo di grado HPLC e quindi dispensandoli in un becher. Aspirare 500 microlitri di metanolo di grado HPLC nella siringa di vetro ed eseguire il lavaggio del sistema. Selezionare il modulo di configurazione del metodo del software per impostare i parametri.Scegliere il menu della modalità di scansione e identificare gli analizzatori FTMS, quindi fare clic su OK. Successivamente, fare clic sui vari icone nella pagina dello spettro in tempo reale per impostare i parametri come indicato nel protocollo testuale. Per eseguire il tampone, inserire 500 microlitri di tampone di formiato di ammonio 5 millimolare nella siringa di vetro da 500 microlitri.Posizionarlo nel supporto della siringa della pompa MS e staccare il tubo. Far passare il tampone attraverso il tubo per uno o due minuti. Impostare il nome del file per la corsa, selezionando l'icona del file e digitando il nome del file.Selezionare il pulsante acquisisci dati nel modulo e raccogliere 150 scansioni. Fare clic sul pulsante interrompi esecuzione per fermare la raccolta dopo che sono state acquisite 150 scansioni. Successivamente, aprire il modulo del browser dati, andare al menu file e selezionare apri, seguito dal file nella finestra di dialogo.Verificare che non siano presenti picchi a 483, 683, 1163 e 1363 di massa su carica che assomiglino ai complessi peptidici o agli ioni peptidici del mercurio. Eseguire la soluzione con rapporto da uno a 0,5 tra mercurio e CGGC posizionando 250 microlitri del campione nella siringa. Inserire la siringa nel supporto della siringa della pompa dello spettrometro di massa.Collegare il tubo e preparare l'apparecchiatura. Dopo aver acquisito 150 scansioni di dati, aprire il modulo del browser, andare al menu file e selezionare apri. Quindi, selezionare il file nella finestra di dialogo.Verificare che il cromatogramma contenga picchi, inclusi quelli del peptide CGGC da solo. Un aspetto fondamentale di questa procedura è assicurarsi che gli analiti del precedente run vengano completamente rimossi prima di ogni analisi della miscela di reazione. La minimizzazione della contaminazione del campione da analiti di carryover è garantita da un accurato lavaggio della linea di iniezione.Lavare la siringa aspirando 500 microlitri di tampone formiato di ammonio, quindi erogando il tampone in un becher. Successivamente, selezionare il pulsante di scarto sullo spettrometro di massa e lavare il tubicino tre volte con 500 microlitri di tampone formiato di ammonio. Lavare ulteriormente la siringa aspirando 500 microlitri di metanolo ed erogandoli in un becher.Sciacquare il tubo una volta con 500 microlitri di metanolo. Quindi, selezionare il pulsante del rivelatore di carico sullo spettrometro di massa. Dopo aver aggiunto 500 microlitri di tampone di formiato di ammonio alla siringa, inserire la siringa nel supporto della siringa della pompa dello spettrometro di massa. Collegare il tubo e avviare la messa a punto dell'apparecchiatura.Selezionare un nome file per l'esecuzione del tampone come in precedenza ed acquisire 150 scansioni prima di fare clic sul pulsante di arresto dell'esecuzione. Aprire il modulo del browser dati per verificare che il cromatogramma sia privo di picchi derivanti dall'esecuzione precedente di mercurio a CGGC. Ripetere la procedura di analisi per i campioni CGGC rimanenti.Per preparare un rapporto di uno a 0,5 tra mercurio e la soluzione CEEC, aggiungere 255 microlitri di tampone formiato di ammonio 5 millimolare a pH 7,5 in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro. Aggiungere 30 microlitri di soluzione di cloruro di mercurio 0,75 millimolare nel tubo. Dopo aver agitato la soluzione al vortex per 10 secondi, aggiungere 15 microlitri di una soluzione CEEC 0,75 millimolare nel tubo.Vortexare la soluzione per altri 10 secondi. Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti prima dell'iniezione nel spettrometro di massa. Ripetere la procedura di analisi utilizzando campioni di CEEC e miscele di reazione di ione mercurio e CEEC.Viene mostrato uno spettro di massa rappresentativo. Dopo 10 minuti, sono visibili i vari tipi di complessi peptidici del mercurio per la miscela di reazione con rapporto da uno a 0,5 tra mercurio e CGGC, insieme a un picco del peptide a 339,08 e a un dimero del peptide a 677,15. Come osservato nello spettro precedente, la miscela di reazione con rapporto uno a uno tra mercurio e CGGC contiene alcuni picchi simili.Ad esempio, il picco a 539,03 indica il complesso uno a uno tra mercurio e peptide. L'ingrandimento mostra il tipico schema isotopico del mercurio corrispondente ai sette isotopi principali del mercurio presenti in natura. È stato inoltre osservato un complesso di mercurio con CGGC nel rapporto uno a due, come precedentemente riportato per il tripeptide dicisteinilico al mercurio.Questo complesso appare in tutte e tre le miscele di reazione di mercurio e CGGC. È stato facilmente analizzato mediante un distinto profilo isotopico del mercurio con un picco monoisotopico a 877. Tuttavia, se il mercurio è in eccesso, come nella miscela di reazione con rapporto uno a 0,5 tra mercurio e CGGC, viene rilevato un ulteriore complesso con rapporto da due a due tra mercurio e CGGC.Questa firma isotopica del mercurio corrisponde a un complesso di due atomi di mercurio, calcolata utilizzando il programma chem cal. La massa monoisotopica teorica protonata corrisponde a un valore di massa su carica di 1077, che è il nono picco nel cluster isotopico osservato. Viene mostrato uno spettro rappresentativo di vari complessi di mercurio con CEEC.È interessante notare i picchi sovrapposti associati al mercurio negli addotti CEEC con carica più uno, che mostrano un picco monoisotopico a 883, e con carica più due, con un valore calcolato del picco monoisotopico di 1765. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore, se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di sottoporre i tamponi a degasaggio e di risciacquare accuratamente la linea per evitare analiti di trascinamento. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del protone, del carbonio-13 e del mercurio-199, oppure la potenziometria, possono essere utilizzati per determinare con maggiore precisione i complessi presenti nella fase soluzione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di analizzare vari complessi di mercurio e i loro distinti schemi di distribuzione isotopica del mercurio e le formazioni di carica mediante spettrometria di massa con analizzatore orbitrap e ionizzazione a spruzzo elettrostatico, nonché di distinguere picchi sovrapposti mediante analisi in tandem MS.Non dimenticare che lavorare con soluzioni di mercurio può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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