Uno studio della Complessazione di Mercurio (II) con Dicysteinyl Tetrapeptidi da Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare complessi di mercurio e peptidi di dicicesteinil sotto diverse stechiometrie di reazione e di caratterizzare i diversi complessi formati dalla ionizzazione elettrospray e dalla spettrometria di massa oribitrap. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti le tendenze alla complessazione dei composti di mercurio e tioli, il che migliorerà la progettazione razionale degli agenti chelanti per sequestrare gli ioni mercurio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita l'analisi di complessi di ioni metallici con frammentazione trascurabile.

Altri includono un distinto modello di distribuzione isotopica del mercurio. Facilità nell'assegnazione della carica e nell'analisi dei picchi sovrapposti mediante spettrometria di massa tandem. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sui complessi peptidici di mercurio, può essere applicato anche con altri complessi, in particolare con ioni metallici che esistono in diverse forme isotopiche.

Degassare un tampone di formiato di ammonio da cinque millimolari sotto un sistema a vuoto per 10 minuti e spurgare con argon. Ripetere due volte e conservare la soluzione sotto l'argon. Il giorno dell'uso, filtrare la soluzione tampone attraverso un filtro da 0,2 micron prima dell'uso.

Per preparare soluzioni di cloruro di mercurio, pesare 0,2375 grammi di cloruro di mercurio. Sciogliere in 25 millilitri di tampone formiato di ammonio da cinque millimolari, per produrre una soluzione molare di cloruro di mercurio 0,035. Aggiungere 0,214 millilitri della soluzione di cloruro di mercurio a 9,785 millilitri di tampone di formiato di ammonio da cinque millimolari, per creare una soluzione 0,75 millimolare.

Ricoprire la soluzione risultante con gas argon. Quindi, aggiungere 225 microlitri di una soluzione madre di CGGC da cinque millimolari a 1,275 millilitri di tampone pH 7,5 di formiato di ammonio da cinque millimolari, per ottenere una soluzione CGGC da 0,75 millimolari. Quindi, preparare un rapporto da uno a 0,5 tra soluzione di mercurio e CGGC inserendo 255 microlitri di tampone pH 7,5 di formiato di ammonio da cinque millimolari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi, aggiungere 30 microlitri di soluzione di cloruro di mercurio 0,75 millimolare nel tubo. Agitare la soluzione per 10 secondi. Quindi, aggiungere 15 microlitri di soluzione CGGC 0,75 millimolare nella provetta.

Agitare la soluzione per altri 10 secondi, quindi lasciare riposare la soluzione per 10 minuti prima dell'iniezione nello spettrometro di massa. Per preparare lo spettrometro di massa ESI, o MS, aspirare 100 microlitri di standard di calibrazione in una siringa di vetro da 500 microlitri. Posizionare la siringa nella base della siringa della pompa MS.

Collegare il tubo e iniettare nello spettrometro di massa. Impostare il nome del file per l'esecuzione selezionando l'icona del file e digitando il nome del file. Selezionare il pulsante di acquisizione dati nel modulo di acquisizione dati e raccogliere 150 scansioni.

Analizza il cromatogramma per verificare gli standard di calibrazione aprendo il modulo di elaborazione dati del software. Quindi, vai al menu file e seleziona Apri, seguito dal file nella finestra di dialogo. Verificare che i picchi nel cromatogramma siano correlati ai rapporti massa/carica degli standard.

Pulire la siringa di vetro da 500 microlitri aspirando 500 microlitri di metanolo di grado HPLC e poi erogandolo in un becher. Aspirare 500 microlitri di metanolo di grado HPLC nella siringa di vetro e lavare il sistema. Selezionare il modulo di configurazione del metodo del software per impostare i parametri.

Scegli il menu della modalità di scansione e identifica gli analizzatori FTMS, quindi fai clic su ok. Quindi, fare clic sulle varie icone nella pagina dello spettro di visualizzazione in tempo reale per impostare i parametri come dettagliato nel protocollo di testo. Per far funzionare il tampone, inserire 500 microlitri di tampone di formiato di ammonio da cinque millimolari nella siringa di vetro da 500 microlitri.

Posizionarlo nella base della siringa della pompa MS e staccare il tubo. Far scorrere il tampone attraverso il tubo per uno o due minuti. Impostare il nome del file per l'esecuzione, selezionando l'icona del file e digitando il nome del file.

Seleziona il pulsante di acquisizione dati nel modulo e raccogli 150 scansioni. Fare clic sul pulsante Interrompi esecuzione per interrompere la raccolta dopo che sono state raccolte 150 scansioni. Quindi, apri il modulo del browser dei dati, vai al menu file e seleziona Apri, seguito dal file nella finestra di dialogo.

Verificare che non siano presenti picchi di sovraccarico di massa 483, 683, 1163 e 1363 che assomigliano ai complessi peptidici o peptidici di ioni mercurio. Far scorrere la soluzione con rapporto da uno a 0,5 di mercurio/CGGC inserendo 250 microlitri di campione nella siringa. Posizionare la siringa nella base della siringa della pompa MS.

Collegare il tubo e adescare l'apparecchio. Acquisendo 150 scansioni di dati, apri il modulo browser, vai al menu file e seleziona Apri. Quindi, seleziona il file nella finestra di dialogo.

Verificare che il cromatogramma contenga picchi, incluso quello del solo peptide CGGC. Un aspetto critico di questa procedura consiste nel garantire che gli analiti della corsa precedente vengano completamente rimossi prima di ogni analisi della miscela di reazione. La riduzione al minimo della contaminazione del campione da parte degli analiti di carryover è garantita da un'accurata pulizia della linea di iniezione.

Lavare la siringa aspirando con 500 microlitri di tampone di formiato di ammonio, quindi erogando il tampone in un becher. Quindi, selezionare il pulsante di scarico sull'MS e lavare il tubo tre volte con 500 microlitri di tampone di formiato di ammonio. Lavare ulteriormente la siringa, aspirando 500 microlitri di metanolo e dispensandola in un becher.

Sciacquare il tubo una volta con 500 microlitri di metanolo. Quindi, selezionare il pulsante del rilevatore di carico sull'MS. Dopo aver aggiunto 500 microlitri di tampone di formiato di ammonio alla siringa, posizionare la siringa nella base della siringa della pompa MS. Collegare il tubo e adescare l'apparecchio.

Selezionare un nome file per l'esecuzione del buffer come in precedenza e acquisire 150 scansioni prima di fare clic sul pulsante di arresto dell'esecuzione. Aprire il modulo del browser dei dati per verificare che il cromatogramma sia privo di picchi della precedente corsa dal mercurio al CGGC. Ripetere la procedura di analisi per i campioni CGGC rimanenti.

Per preparare un rapporto di uno a 0,5 tra mercurio e soluzione CEEC, mettere 255 microlitri di tampone pH 7,5 di formiato di ammonio da cinque millimolari, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 30 microlitri di soluzione di cloruro di mercurio 0,75 millimolare nella provetta. Dopo aver agitato la soluzione per 10 secondi, aggiungere 15 microlitri di una soluzione CEEC 0,75 millimolare nel tubo.

Agitare la soluzione per altri 10 secondi. E lasciare riposare la soluzione per 10 minuti prima dell'iniezione dello spettrometro di massa. Ripetere la procedura di analisi utilizzando campioni di PECO e miscele di reazione di ioni di mercurio e PECO.

Viene mostrato uno spettro di massa rappresentativo. Dopo 10 minuti, i vari tipi di complessi peptidici di mercurio sono visibili per la miscela di reazione da uno a 0,5 mercurio a CGGC, insieme a un picco peptidico di 339,08 e un dimero peptidico di 677,15. Come osservato nello spettro precedente, la miscela di reazione da mercurio a CGGC contiene alcuni picchi simili.

Ad esempio, il picco 539,03 indica il complesso uno a uno di mercurio e peptide. La vista ingrandita mostra il caratteristico modello isotopico del mercurio corrispondente ai sette principali isotopi di mercurio presenti in natura. Si osserva anche un complesso da mercurio a CGGC da uno a due, come precedentemente riportato per il mercurio diccisteinil tripeptide.

Questo complesso appare in tutte e tre le miscele di reazione di mercurio e CGGC. È stato prontamente analizzato con un modello isotopico distinto di mercurio con un picco monoisotopico a 877. Tuttavia, se il mercurio è in eccesso, come nella miscela di reazione da uno a 0,5 da mercurio a CGGC, viene rilevato un ulteriore complesso da due a due mercurio a CGGC.

Questa firma isotopica del mercurio corrisponde a un complesso a due mercurio calcolato utilizzando il programma chimico. La massa monoisotopica protonata teorica corrisponde a un valore di sovraccarico di massa di 1077, che è il nono picco nel cluster isotopico osservato. Viene mostrato uno spettro rappresentativo che mostra vari complessi da mercurio a PECO.

Di interesse, sono i picchi sovrapposti associati al mercurio agli addotti CEEC nella carica più uno che mostrano un picco monoisotopico a 883. E nella carica più due, con un valore di picco monoisotopico calcolato di 1765. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di degassare i tamponi e risciacquare accuratamente la linea per evitare il carryover di analiti. Seguendo questa procedura, altri metodi come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare di protoni, carbonio-13 e mercurio-199, o la potenziometria, possono essere utilizzati per fornire una determinazione più accurata dei complessi di contenuto nella fase di soluzione. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di analizzare vari complessi di mercurio e i loro distinti modelli di distribuzione isotopica del mercurio e le formazioni di carica utilizzando la spettrometria di massa orbitrap con ionizzazione elettrospray, nonché di distinguere i picchi sovrapposti mediante analisi MS tandem.

Non dimenticare che lavorare con soluzioni di mercurio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale.