Name: Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per valutare la tossicità salino-dipendente di nanocolloidi d'argento su embrioni di medaka. Questa tecnica consente test ecotossicologici in acqua dolce, salmastra e marina.

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Siamo grati alla signora Kaori Shimizu e al signor Masaki Takasu della Graduate School of Life Sciences, Toyo University, per il loro supporto tecnico. Questo progetto è stato supportato da sovvenzioni di ricerca della Special Research Foundation e del Bio-Nano Electronics Research Centre dell'Università di Toyo (a SK); dal Fondo per la promozione della ricerca scientifica della Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (a SK); dal Fondo per i Nuovi Progetti per la Valutazione dei Rischi, dal Ministero dell'Economia, del Commercio e dell'Industria (a SK); da una sovvenzione per la ricerca esplorativa stimolante (premio 23651028 a SK); da una sovvenzione per la ricerca scientifica (B) e (C) (attribuzione 23310026 e 26340030 a SK); e da una sovvenzione per un progetto di base di ricerca strategica per università private (premio S1411016 a SK) dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone.

I Medaka giapponesi utilizzati in questo studio sono stati trattati umanamente secondo le linee guida istituzionali di Toyo University, con la dovuta considerazione per l&#39;alleviamento della sofferenza e disagio. 1. argento Nanocolloids (SNCS) <ol><li> Acquisto SNCS purificati (20 mg / L -1, 99,99% di purezza, di particelle di diametro circa 28,4 ± 8,5 nm sospeso in acqua distillata significa). </li><li> Convalida la purezza e la concentrazione dell&#39;argento da accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma (ICP-MS) analisi in base alle istruzioni per l&#39;uso 8. Il metodo di pretrattamento per ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7. </li></ol> 2. Preparazione del SNC Solutions (miscele di argento colloidi e Ag +) con diverse salinità <ol><li> Preparare 60 ERM × costituito da 60 g di NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g di CaCl 2 · 2H 2 O, e 9,78 g MgSO 4 · 7H 2 O in 1 L di ultacqua rapure; regolare il pH a 7,0 con 1,25% NaHCO 3 in acqua ultrapura. </li><li> Agitare la soluzione ERM a 25 ° C per una notte. </li><li> Mescolare SNCS con ERM diluito. Preparare 40 ml di ciascuna soluzione mista SNC-ERM. La concentrazione finale è di 10 mg / L -1 di SNCS in diverse concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o). </li><li> Regolare il pH della soluzione mista SNC-ERM a 7,0 con 0,625% NaHCO 3 in acqua ultrapura. la regolazione del pH è molto importante nella preparazione della soluzione SNC, perché Ag + rilascio è facilitato da condizioni acide 9. </li><li> Utilizzare AgNO 3 come composto di riferimento per SNCS. <ol><li> Mescolare AgNO 3 con ERM diluito. Preparare 40 ml di Agno 3 -ERM soluzione mista ad un AgNO 3 concentrazione di 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 argento) a differenti concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o) . Nota: Per esaminare la tossicità colloidi d&#39;argento, Agno 3soluzione, che è una fonte di argento solubile, viene usato come composto di riferimento per SNCS, che sono una miscela di colloidi di argento e argento solubile. </li></ol></li></ol> 3. Medaka cultura e la raccolta Egg <ol><li> Ottenere il Medaka (latipes O.) (ceppo arancio-rosso) (60 maschi e 60 femmine). </li><li> Cultura Medaka come gruppi (20 maschi e 20 femmine come un unico gruppo) in 1x ERM in 3 serbatoi L utilizzando un sistema di coltura Medaka flow-through. <ol><li> Cultura alle seguenti condizioni: intervallo di pH del mezzo di coltura: 6,2 e 6,5 luce: buio ciclo: 16: 8 ore temperatura del mezzo di coltura: 24 ± 0.5 ° C pressione osmotica del mezzo di coltura: 257 mOsm </li></ol></li><li> Alimentare Medaka su Artemia salina naupli alle 10:00 (una volta al giorno) ed alimentare una dieta pesce secco artificiali alle 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinque volte al giorno). <ol><li> Ottenere A. salina nauplii. </li> &lt;li&gt; Preparare 5 L di una soluzione salina 3,0% in un beaker di plastica. </li><li> Aggiungere 30 g di uova del gambero di salamoia per la soluzione salina nel bicchiere. </li><li> Incubare le uova a 25 ° C per 48 ore con gorgogliamento (4 L / min -1) utilizzando una pompa di aerazione. </li><li> Dopo 48 ore, arrestare il bubbling. </li><li> Lasciare che la soluzione riposare per 5 a 10 minuti per separare la A. tratteggiato salina nauplii (parte inferiore della soluzione) dalle uova non schiuse e gusci d&#39;uovo (parte superiore della soluzione). </li><li> Rimuovere lo strato superiore della soluzione per decantazione. </li><li> Filtrare la porzione inferiore della soluzione attraverso un setaccio con aperture di 283 micron, e raccogliere i naupli che passano attraverso una rete con aperture di 198 micron. </li><li> Alimentare il nauplii alle Medaka entro 6 ore. </li></ol></li><li> Dopo i Medaka femminili hanno generato, rimuovere gli ammassi di uova esterni delicatamente dai corpi delle femmine o raccogliere le uova dal fondo della vasca di pesci utilizzando un smtutti i net (dimensione netta 5 cm x 5 cm, dimensione del foro 0,2 mm x 0,2 mm). </li><li> Risciacquare il cluster uovo con acqua corrente per 5 sec. </li><li> Aggiungere tutti i cluster di uova sciacquati a 30x soluzione ERM. </li><li> Rimuovere i cluster dalla soluzione dopo 1 min e posizionare i grappoli d&#39;uovo tra gli asciugamani di carta a secco e ruotare delicatamente. </li><li> Mettere le uova di nuovo nel ERM 30x. </li><li> Selezionare uova fecondate sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Luogo scelto 810 uova in 1x ERM in sei pozzetti di plastica utilizzando una pinza. </li><li> Incubare le uova a 25 ± 0,1 ° C in un incubatore fino stadio di sviluppo 21. (Stadi di sviluppo degli embrioni Medaka sono stati definiti dal lavoro di Iwamatsu 10). </li><li> Scegliere uova incubate in fase di sviluppo 21 sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Risciacquare uova selezionati con 1x ERM. </li><li> Sottoporre le uova sciacquati agli esperimenti di esposizione (sezione 4). </li></ol> 4. Prove di tossicità dei SNCS o AgNO 3 </sub&gt; A differenti salinità ERM <ol><li> Risciacquare uova Medaka (fase 21) tre volte con soluzione di prova [SNCS (10 mg / L -1) o AgNO 3 (15,7 mg / L -1 a 10 mg / L -1 argento) a ciascuna concentrazione di ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x o) a pH 7]. Come controlli, utilizzare uova in 1 × 30 × ERM a pH 7. </li><li> Aggiungere 15 uova sciacquati a 5 ml di ciascuna soluzione di prova in sei pozzetti di plastica. (Eseguire gli esperimenti di esposizione tre volte per il SNC o AgNO 3 di tossicità test con ogni soluzione di prova.) </li><li> Avvolgere le piastre in alluminio. </li><li> Incubare le piastre avvolte a 25 ° C al buio fino alla schiusa o per 14 giorni. </li><li> Osservare le uova esposte ogni 24 ore per i cambiamenti biologici e uova morti (figure 1 e 2). </li><li> Sostituire le soluzioni in esame ogni 24 ore. </li><li> Eseguire osservazioni come segue. <ol><li> Il giorno 6 di esposizione, contare la frequenza cardiaca (per 15 sec) oembrioni Medaka f sotto un microscopio da dissezione utilizzando un cronometro (Figura 3a). </li><li> Il giorno 6 di esposizione, si misura la dimensione dell&#39;occhio (diametro) di embrioni Medaka sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3b). </li><li> Il giorno schiusa, misurare le lunghezze corpo pieno di larve sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3c). </li><li> Contare il numero totale di uova che si schiudono esposti nei 14 giorni (figura 3d). </li></ol></li></ol> 5. L&#39;isolamento di Silver solubile da SNC Solution, e analisi d&#39;argento <ol><li> Isolare argento solubile di ciascuna soluzione SNC (una miscela di colloidi di argento e argento solubile) filtrando attraverso un filtro a membrana 3 kDa a 14.000 x ge 4 ° C per 10 min. Utilizzare un filtro a membrana 3 kDa per isolare l&#39;argento solubile dalle SNCS, perché il diametro medio riportato SNCS aggregati in 1x ERM è 67,8 nm 11 aND quella di Ag + è 0,162 nm 12; la membrana 3 kDa esclude le particelle con un diametro di 2 nm o più 13. </li><li> Misurare la concentrazione di argento in 50 ml di soluzione filtrata (= concentrazione argento solubile) mediante ICP-MS analisi (figura 3e) secondo il manuale operativo ICP-MS 8. Il metodo di pretrattamento per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7. </li></ol> 6. Misure di Silver bioaccumulo in Medaka Embrioni <ol><li> Esporre uova Medaka (fase 21) a SNCS o AgNO 3 come descritto nella sezione 4. </li><li> Il giorno 6 di esposizione, rimuovere corion dall&#39;uovo (vale a dire, dechorion) utilizzando Medaka cova enzima secondo il protocollo descritto nel Libro Medaka 14. </li><li> Misurare la concentrazione d&#39;argento delle uova dechorioned mediante analisi ICP-MS secondo la ICP-MS manuale operativo 8 (Figura 3f). Il pretrattamentometodo per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7. </li></ol> 7. misurazione della concentrazione d&#39;argento per ICP-MS Analysis <ol><li> Aggiungere esempi [50 ml di soluzione d&#39;argento (per la validazione della concentrazione di argento, sezione 1); tre embrioni dechorionated (sezione 5); o 50 ml di soluzione filtrata (sezione 5)] per un 50 ml di Teflon bicchiere. </li><li> Aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro al bicchiere da 50 ml. </li><li> Scaldare la miscela su un piatto caldo a 110 ° C fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore). </li><li> Per sciogliere la sostanza organica completamente, aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro e 0,5 ml di acqua ossigenata nel becher. </li><li> Scaldare la miscela di nuovo sulla piastra calda fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore). </li><li> Sciogliere il residuo in 4 ml di soluzione di acido nitrico ultrapuro 1,0%. </li><li> Trasferimento 4 ml di soluzione in una provetta da centrifuga. </li><li> Ripetere 7.6 al 7.7 volte (per un totale di tre volte). Il volume finale è 12.0ml. </li><li> Misurare la concentrazione d&#39;argento del campione (sciolto in acido nitrico ultrapuro 1,0%) utilizzando analisi ICP-MS secondo il manuale operativo 8. <ol><li> Utilizzare un interno e una soluzione standard esterno (vedi elenco dei materiali) per quantificare la concentrazione di argento. La soluzione standard interna ed esterna è accreditato dalla American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Limiti di rilevazione d&#39;argento erano 0,0018 ng / ml -1 (soluzione) e 0.016 ng mg-peso -1 (corpo dell&#39;embrione). </li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2+Effects+on+Biotic+Systems%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems</a>. , OECD. Available from:
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<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li>
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<li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Medaka è un pesce d&#39;acqua dolce che è altamente tolleranti all&#39;acqua di mare; non è ben noto che l&#39;habitat naturale originali pesce era acqua salata largo della costa giapponese 6. Quindi, pesce Medaka sono ben sviluppate cellule cloruro 7. Questa struttura unica fornisce agli scienziati un nuovo modo per testare la tossicità delle sostanze chimiche nell&#39;ambiente in funzione della salinità (acqua dolce ad acqua di mare) utilizzando solo una singola specie di pesce. <p class="jov...

Dal momento che l&#39;istituzione dell&#39;Organizzazione per la Cooperazione Economica e linee direttrici per lo sviluppo (OCSE) per le sostanze chimiche di test nel 1979, 38 linee direttrici sono state pubblicate nella sezione 2 delle linee guida, gli effetti sulla biotici Sistemi 1. Tutti gli organismi acquatici sottoposti alla prova sono stati da habitat d&#39;acqua dolce, vale a dire le piante d&#39;acqua dolce; alghe; invertebrati come dafnie e chironomidi; e pesci, come Medaka, zebrafish, e la trota arcobaleno. Rispetto agli ambienti di acqua salata, ambienti d&#39;acqua dolce sono più direttamente interessate da attività economiche e industriali umani. Pertanto, ambienti d&#39;acqua dolce sono state priorità per il test, perché sono a più alto rischio di inquinamento. Nelle zone costiere, tra cui estuari, salinità variano tra condizioni di acqua e acqua di mare salmastra, e queste zone sono spesso inquinate da attività industriale 2. Le zone costiere e le loro zone umide associati sono caratterizzati da hIGH biodiversità ecologica e produttività. Gli ecosistemi costieri devono pertanto essere protetti da inquinamento chimico. Tuttavia, vi è stata limitata la ricerca ecotossicologiche in acqua e acqua di mare salmastra habitat. Sakaizumi 3 studiato le interazioni tossiche tra metil mercurio e la salinità nelle uova Medaka giapponesi e ha scoperto che aumentando la pressione osmotica della soluzione di prova migliorato la tossicità del mercurio metilico. . Sumitani et al 4 utilizzati uova Medaka per studiare la tossicità del percolato di discarica; hanno scoperto che l&#39;equivalenza osmotica del percolato alle uova è stata la chiave per indurre anomalie durante l&#39;embriogenesi. Inoltre, Kashiwada 5 ha riferito che le nanoparticelle di plastica (39,4 nm di diametro) facilmente permeato attraverso il corion Medaka uovo in condizioni salmastre (15x embrione allevamento medio (ERM)). Un tipico modello di piccoli pesci, i Medaka giapponesi (Oryzias latipes </em&gt;) è stato usato in biologia di base e ecotossicologia 6. Medaka giapponesi possono vivere in condizioni che vanno da acqua dolce ad acqua di mare a causa delle loro cellule cloruro altamente sviluppati 7. Sono quindi suscettibili di essere utile per testare in condizioni con una vasta gamma di salinità.

<table><tbody><tr><td>Nanocolloidi d'argento</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>Per la produzione di ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>Per la produzione di ERM</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>Per la produzione di ERM</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>Per la produzione di ERM</td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>Per la produzione di ERM</td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (Oryzias latipes) ceppo rosso-arancio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di coltura a flusso continuo medaka</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina naupli uova</td><td>Giappone pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>pompa di aerazione</td><td>Giappone pet design Co. Ltd</td><td>non rumore w300</td><td></td></tr><tr><td>Otohime larvale &beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Otohime larvale &beta;-1</td><td>Artificiale dieta di pesce secco</td></tr><tr><td>microscopio da dissezione</td> Leica <td>microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>micrometro</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td></td><td></td>10450023</tr><tr><td>incubatore</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>agitatore</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in plastica a 6 pozzetti</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA foglio di</td><td></td></tr><tr><td>alluminio</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>cronometro</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a membrana 3 kDa</td><td>EMD Millipore Corporation</td> Filtro <td></td><td>centrifugo da 0,5 ml</td></tr><tr><td>Becher in teflon da 50 ml</td><td>AS ONE Co.</td><td></td><td></td>33431097</tr><tr><td>Standard personalizzato</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>Per standard interno</td></tr><tr><td>Standard personalizzato SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>Per</td><td></td></tr><tr><td>acido nitrico ultrapuro</td> standard esterno <td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>perossido di idrogeno&nbsp;</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>per spettrometria di assorbimento atomico</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>piastra riscaldante</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

tossicità assay salinità-dipendente di silver nanocolloids utilizzando medaka uova

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinità è una caratteristica importante per l&#39;ambiente acquatico. Per gli organismi acquatici definisce gli habitat di acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Prove di tossicità delle sostanze chimiche e valutazioni delle loro rischi ecologici per gli organismi acquatici vengono spesso eseguite in acqua dolce, ma la tossicità delle sostanze chimiche per gli organismi acquatici dipende dal pH, temperatura e salinità. Non esiste un metodo, tuttavia, per testare la dipendenza salinità di tossicità per gli organismi acquatici. Qui, abbiamo usato Medaka (Oryzias latipes) perché possono adattarsi a acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Diverse concentrazioni di media embrione-allevamento (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) sono stati impiegati per testare la tossicità delle particelle nanocolloidale argento (SNCS) per Medaka uova (1x ERM e 30x ERM avere pressioni osmotiche equivalente rispettivamente acqua dolce e acqua di mare,). In piastre sei pozzetti di plastica, 15 uova Medaka in triplice copia, sono stati esposti a SNCS a 10 mg / L &amp;# 8722; 1 in diverse concentrazioni di ERM a pH 7 e 25 ° C al buio. Abbiamo usato un microscopio da dissezione e un micrometro per misurare la frequenza cardiaca per 15 secondi e l&#39;occhio di diametro il giorno 6 e piena lunghezza del corpo delle larve sul schiusa giorno (sezione 4). Gli embrioni sono stati osservati fino alla schiusa o il giorno 14; Abbiamo poi contato il tasso di schiusa ogni giorno per 14 giorni (sezione 4). Per vedere l&#39;accumulo d&#39;argento negli embrioni, abbiamo usato ad accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma per misurare la concentrazione d&#39;argento di soluzioni di test (sezione 5) ed embrioni dechorionated (sezione 6) .Il tossicità dei SNCS di embrioni Medaka ovviamente aumentata con l&#39;aumento della salinità. Questo nuovo metodo ci permette di testare la tossicità delle sostanze chimiche in diverse salinità.

L&#39;effetto della salinità sulla tossicità SNC era molto evidente: l&#39;induzione di deformità o morte era salinità dipendenti (figure 1 e 2). Abbiamo misurato biomarcatori fenotipiche (frequenza cardiaca, dimensioni degli occhi, la lunghezza di tutto il corpo, e tasso di schiusa) nel SNC (10 mg / L -1) embrioni -exposed. Questi biomarcatori fenotipiche hanno rivelato tossicità SNC salinità-dipendente. <p class="jove_content" fo:keep-to...

Gli stadi embrionali sono i più suscettibili agli xenobiotici. Sebbene la tossicità chimica dipenda dalla salinità, non esiste alcun metodo per testare la dipendenza dalla salinità della tossicità per gli organismi acquatici. Qui, descriviamo un metodo nuovo e ad alto rendimento per determinare la dipendenza dalla salinità della tossicità per gli embrioni acquatici.

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è testare la tossicità dipendente dalla salinità di sostanze chimiche su organismi acquatici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ecotossicologia, come la valutazione della tossicità in condizioni di acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il medaka non deve mai essere utilizzato per testare la tossicità di sostanze chimiche in diverse salinità.Inoltre, le implicazioni di questa tecnica si estendono ad altre terapie o diagnosi della tossicità di sostanze chimiche. Nel protocollo descrittivo è illustrata la preparazione di nanocolloidi di argento commerciali in soluzione, a diverse salinità. Così come la coltivazione di medaka e il prelievo delle uova.Iniziare risciacquando sei collezioni di uova di medaka allo stadio 21, tre volte in soluzione di prova. Eseguire questa operazione utilizzando ERMs, a una concentrazione diversa per ciascun gruppo di uova. Ora, da ciascuna collezione risciacquata, trasferire 15 uova in un pozzetto diverso di soluzione di prova, in una piastra di plastica a sei pozzetti.Impostare questo esperimento in triplice replicato, lavando ogni gruppo separatamente. Avvolgere le piastre con carta stagnola e incubarle a 25 gradi Celsius, al buio, fino alla schiusa delle uova o per 14 giorni, qualunque evento si verifichi prima.Durante l'incubazione, osservare le uova quotidianamente per rilevare eventuali cambiamenti biologici e identificare uova morte. Cambiare la soluzione di prova ogni giorno, contemporaneamente alle osservazioni.Al sesto giorno di osservazione, conta la frequenza cardiaca di ciascun embrione per 15 secondi. Sempre al sesto giorno, misura il diametro degli occhi di ciascun embrione, in ogni condizione sperimentale, utilizzando un micrometro. Ogni volta che gli embrioni schiudono formando larve, misurane la lunghezza totale del corpo, utilizzando un micrometro.Inoltre, durante i 14 giorni, registrare il numero totale di uova schiuse. Per misurare la bioaccumulazione di argento, al sesto giorno raccogliere le corioni delle uova utilizzando il metodo standard. Le uova dechorionate possono essere analizzate esattamente come viene analizzata la soluzione SNC, come descritto nella sezione seguente.Per isolare l'argento solubile da ogni soluzione di SNC, filtrare prima la miscela di colloidi e argento solubile utilizzando una membrana da tre chilodalton. Successivamente, centrifugare il filtro caricato a 14.000 G per 10 minuti in una centrifuga refrigerata.Da 50 microlitri del filtrato, misurare la concentrazione di argento mediante analisi ICP-MS. Caricare l’aliquota in un becher in teflon da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di acido nitrico ultrapuro al becher. Successivamente, riscaldare la miscela su una piastra riscaldante a 110 gradi Celsius.Per un periodo di circa tre ore di riscaldamento, lasciare quasi asciugare la soluzione. Una volta che il becher si è raffreddato, sciogliere completamente i solidi organici. Aggiungere al becher due millilitri di acido nitrico ultrapuro e 0,5 millilitri di perossido di idrogeno.Quindi, riscaldare nuovamente la miscela fino a quando non è quasi completamente essiccata. Sciogliere ora il residuo rimanente in quattro millilitri di acido nitrico ultrapuro all'uno percento, preparato in acqua ultrapura. Trasferire la soluzione in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.Ripetere il processo di dissoluzione dei solidi rimanenti nel becher in teflon per altre due volte, raffreddando le tre frazioni in un unico tubo. A questo punto, misurare la concentrazione di argento nel campione mediante ICP-MS. Utilizzare il protocollo raccomandato dal produttore per analizzare i campioni.Assicurarsi di utilizzare standard interni ed esterni. L'effetto della salinità sulla tossicità di SNC era facilmente evidente. L'induzione di malformazioni o morte era chiaramente dipendente dalla salinità.Sono state effettuate diverse misurazioni fisiologiche. Le frequenze cardiache non sono state alterate fino a quando la salinità ha raggiunto 30 X ERM. La lunghezza del corpo era significativamente più corta a salinità di 15 e 30 X ERM.Il diametro dell'occhio è diminuito anch'esso, in modo proporzionale alla lunghezza del corpo. La schiusa è risultata meno probabile a 15 X ERM ed è avvenuta soltanto per il due percento delle uova a 30 X ERM. Nelle soluzioni sperimentali, i complessi metallici solubili in acqua si sono formati più facilmente all'aumentare della concentrazione di sali.L'esame dei complessi metallici negli embrioni dopo sei giorni ha mostrato un aumento della concentrazione negli embrioni all'aumentare della concentrazione in soluzione. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di aggiustare il pH delle condizioni sperimentali, poiché il rilascio di ioni argento è facilitato da condizioni acide.

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