Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di testare la tossicità dipendente dalla salinità delle sostanze chimiche per gli organismi acquatici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecotossicologia, come la valutazione della tossicità sulle condizioni dell'acqua dolce, dell'acqua salmastra e dell'acqua marina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ai medaka non viene mai chiesto di testare la tossicità di sostanze chimiche in diverse salinità.

Inoltre, le implicazioni di questa tecnica si estendono ad altre terapie o diagnosi di tossicità chimica. La preparazione di nanocolloidi commerciali d'argento in soluzione, a varie salinità, è trattata nel protocollo di testo. Così come la coltura del medaka e la raccolta delle uova.

Iniziare con il risciacquo di sei raccolte di uova di medaka Stage 21, tre volte in soluzione di prova. Fallo usando gli ERM, a una concentrazione diversa per ogni serie di uova. Ora, da ogni raccolta risciacquata, trasferite 15 uova in un diverso pozzetto di soluzione di prova, in una piastra di plastica a sei pozzetti.

Imposta questo esperimento in triplice copia, lavando ogni gruppo separatamente. Avvolgere le piastre in un foglio di alluminio e incubarle a 25 gradi Celsius, al buio. Fino alla schiusa delle uova, o per 14 giorni, a seconda dell'evento che si verifica per primo.

Durante l'incubazione, osservare quotidianamente le uova per eventuali cambiamenti biologici. E per eventuali uova morte. Cambia la soluzione di test ogni giorno, insieme alle osservazioni.

Il sesto giorno di osservazione, contare la frequenza cardiaca di ogni embrione in 15 secondi. Sempre il sesto giorno, misurare il diametro degli occhi di ogni embrione, in ogni condizione sperimentale, utilizzando un micrometro. Ogni volta che gli embrioni si schiudono in larve, misura la loro lunghezza completa del corpo, usando un micrometro.

Inoltre, nel corso dei 14 giorni, tieni il conto del totale delle uova che si schiudono. Per misurare il bioaccumulo di argento, il sesto giorno, raccogli i corioni delle uova, utilizzando il metodo standard. Le uova decorionate possono essere analizzate, così come viene analizzata la soluzione SNC, come descritto nella sezione seguente.

Per prima cosa, filtrare la miscela di colloidi e argento solubile, utilizzando una membrana da tre kilodalton. Quindi, centrifugare il filtro caricato a 14.000 Gs, per 10 minuti, in una centrifuga refrigerata.

Da 50 microlitri di filtrato, misurare la concentrazione di argento mediante analisi ICP-MS. Caricare l'aliquota in un becher di teflon da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di acido nitrico ultrapuro al becher. Quindi, scaldare il composto su una piastra calda, a 110 gradi Celsius.

Dopo circa tre ore di riscaldamento, lasciare che la soluzione si asciughi quasi. Una volta che il becher si è raffreddato, sciogliere completamente i solidi organici. Aggiungere due millilitri di acido nitrico ultrapuro e 0,5 millilitri di perossido di idrogeno al becher.

Quindi, scaldare nuovamente il composto, fino a quando non si sarà quasi asciugato di nuovo. Ora, sciogliere il residuo rimanente in quattro millilitri di acido nitrico ultrapuro all'uno per cento, prodotto in acqua ultrapura. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Ripetere il processo di dissoluzione dei solidi rimanenti nel becher in teflon, altre due volte, raffreddando le tre raccolte in un unico tubo. Ora, misurare la concentrazione di argento nel campione, utilizzando ICP-MS. Utilizzare il protocollo consigliato dal produttore per analizzare i campioni.

Assicurati di utilizzare standard interni ed esterni. L'effetto della salinità sulla tossicità del SNC è stato facilmente evidente. L'induzione della deformità o della morte era chiaramente dipendente dalla salinità.

Sono state effettuate varie misurazioni fisiologiche. Le frequenze cardiache non sono state influenzate fino a quando la salinità ha raggiunto 30 volte l'ERM. La lunghezza del corpo era significativamente più corta a salinità di 15 e 30 X ERM.

Anche il diametro dell'occhio è diminuito, coerentemente con la lunghezza del corpo. La schiusa era meno probabile a 15 volte l'ERM e si verificava solo per il 2% delle uova a 30 volte l'ERM. Con le soluzioni sperimentali, i complessi metallici solubili in acqua si formavano più facilmente all'aumentare della concentrazione di sale.

L'esame dei complessi metallici negli embrioni dopo sei giorni ha mostrato che aumentavano di concentrazione negli embrioni all'aumentare della concentrazione nella soluzione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di regolare il pH delle condizioni di test, perché il rilascio di ioni d'argento è facilitato dalla condizione acida.