Preparazione e test di impedenza a base di biochip fluidici con le cellule RTgill-W1 per valutare rapidamente campioni di acqua potabile per la tossicità

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come utilizzare un biosensore per valutare la tossicità dei campioni di acqua potabile. Ciò si ottiene creando biochip che contengono un monostrato di cellule branchiali di trota iridea e quindi utilizzandole come parte di un biosensore basato sull'impedenza. Questa procedura consente di rilevare rapidamente la tossicità chimica nelle forniture di acqua potabile a livelli rilevanti per la salute umana.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che i biochip possono essere utilizzati in condizioni di campo, possono essere conservati a freddo per un massimo di nove mesi senza alcuna cura o manutenzione delle celle e che sono pronti per i test e possono essere utilizzati in qualsiasi momento dopo la rimozione dalla refrigerazione. A dimostrare questa procedura sarà Jordan McNairn, uno studente universitario del nostro laboratorio. Il giorno prima della semina cellulare, rimuovere i biochip dalla confezione e inserirli in custodie di plastica sterilizzate per strumenti.

Collegare uno dei tubi alla siringa e aspirare una soluzione di candeggina al 20% in una siringa da 20 millilitri. Iniettare due millilitri di soluzione in ciascun canale del biochip. Al termine, lasciare riposare i biochip per un'ora con la soluzione di candeggina.

Dopo un'ora, utilizzare una siringa sterile da un millilitro dotata di un gruppo slip luer maschio collegato a una linea del vuoto per aspirare la soluzione di candeggina da entrambi i canali. Dopo aver aspirato la candeggina dal biochip, collegare al biochip un tubo sterile con luer a scorrimento maschio a ciascuna estremità da utilizzare come scarico durante il risciacquo dei biochip. Quindi, aspirare acqua sterile in una siringa da 20 millilitri e sciacquare ogni canale del chip con cinque millilitri di acqua.

Aspirare l'acqua sottovuoto come prima. E rimetti i biochip nelle custodie di plastica degli strumenti. Lasciare i biochip nella cappa di biosicurezza fino al giorno successivo.

Un'ora prima di seminare i biochip, iniettare due millilitri di una soluzione di fibronectina da 10 microgrammi per millilitro in ciascun canale del biochip. Incubare i biochip nella cappa di biosicurezza per 60 minuti, quindi aspirare sottovuoto la soluzione di fibronectina. Infine, posizionare due gruppi di tubi sterili per biochip sulle porte dei biochip e mettere da parte i biochip fino a quando le cellule non sono pronte per la semina.

Rimuovere dall'incubatrice una fiaschetta confluente T-175 contenente cellule epiteliali branchiali di trota iridea e inserirla nella cappa di biosicurezza. Un pallone confluente di T-175 sarà in grado di seminare circa 16 biochip. Aspirare il mezzo dalle cellule.

Sciacquarli con PBS e aspirare il PBS. E poi aggiungere sei millilitri di soluzione di tripsina-EDTA allo strato cellulare. Incubare il pallone a temperatura ambiente per circa cinque minuti.

Quindi, aggiungere 15 millilitri di terreno di coltura cellulare L-15 completo a ciascun pallone, per disattivare la tripsina. Prelevare una piccola aliquota dalla sospensione cellulare e utilizzare un emocitometro per misurare la concentrazione delle cellule. Osserva le cellule utilizzando un microscopio a campo chiaro dotato di un obiettivo 10x.

Quindi, calcolare l'attuale concentrazione di celle e regolare la sospensione cellulare a una concentrazione di un quarto di milione di cellule per millilitro. Quindi, utilizzare una siringa sterile da 20 millilitri per iniettare 2,5 millilitri di sospensione cellulare nella porta esterna di ciascun canale del biochip. Lasciare che la sospensione cellulare in eccesso fuoriesca dal tubo in un contenitore per rifiuti.

Quindi creare un anello chiuso per ogni canale del biochip inserendo l'estremità libera del tubo con un raccordo luer nella porta esterna per ciascun canale. Quindi, inumidisci un tovagliolo di carta con etanolo al 70% e usalo per rimuovere i supporti in eccesso dai circuiti chiusi. Quindi, rimetti i biochip in una scatola di plastica.

Il quarto e il settimo giorno, rimuovere i biochip dall'incubatrice. E cambiare i terreni nei biochip con terreni di coltura cellulare L-15 completi bilanciati a temperatura. Dopo l'alimentazione del settimo giorno, rimuovere e gettare i tubi dai chip e inserire i tappi di scarico dell'autoclave nei biochip.

Metti i biochip in una scatola in un'incubatrice a sei gradi Celsius fino a quando non vengono utilizzati per i test. Rimuovere il lettore di test ECIS e i materiali di consumo dalla custodia per il trasporto, quindi accendere il lettore. Inoltre, estrai uno dei biochip preparati dall'incubatore a sei gradi Celsius e posizionalo su un tovagliolo di carta.

Utilizzando una siringa da 10 millilitri, erogare 10 millilitri di acqua di controllo in un barattolo di controllo di plastica trasparente da 0,5 once etichettato. Assicurati di rimuovere le bolle per una misurazione accurata. Quindi, utilizzare una siringa separata e dosare 10 millilitri del campione di prova in un barattolo di plastica trasparente da 0,5 once.

Quindi, rimuovere due fiale di terreno in polvere. Aprire uno dei flaconcini di terreno in polvere e versare l'intero contenuto di un flaconcino nel barattolo con l'acqua di controllo, immergendo anche l'intero flaconcino nella soluzione. Ripetere questa procedura con il barattolo di prova.

Quindi, tappare e agitare i barattoli per assicurarsi che la polvere sia completamente sciolta. Riempi la siringa blu da 10 millilitri con nove millilitri di soluzione di controllo. E la siringa rossa da 10 millilitri con nove millilitri della soluzione di prova dalle rispettive fiale.

Rimuovere eventuali bolle d'aria esistenti dalle siringhe. Quindi, rimuovere i tappi dalle porte del biochip e collegare lo scarico. Posizionare il biochip nel vassoio di plastica rimovibile del lettore ECIS, chiudere il coperchio, quindi collegare le siringhe piene alle porte esterne del biochip.

Infine, collegare gli stantuffi della siringa. Dalla schermata principale del lettore, selezionare Avanti per avviare il pre-test. Il software controllerà quindi le impedenze iniziali.

Se le impedenze rientrano nell'intervallo, lo schermo registrerà Cartuccia superata" e indicherà all'utente di selezionare Avanti. Immettere quindi le informazioni di esempio utilizzando una tastiera virtuale e quindi selezionare Accetta al termine. A questo punto, verranno raccolti due minuti di dati di impedenza dal biochip inserito e un timer sullo schermo eseguirà il conto alla rovescia.

Dopo due minuti, premi Avanti. Quando viene richiesto da una casella verde lampeggiante di iniettare i campioni ora, iniettare contemporaneamente il supporto di controllo e di test dalle siringhe collegate nei canali del biochip. Al termine, lasciare le siringhe in posizione sui biochip.

Se il software del lettore ECIS determina che il canale di trattamento è statisticamente diverso dal canale di controllo in qualsiasi momento durante il test, il display su schermo indicherà che il campione è contaminato. In caso contrario, indicherà che non è stata rilevata alcuna contaminazione alla fine del periodo di monitoraggio. Registrare i risultati del test come contaminato "o non contaminato" per ciascun campione.

Al termine del test, rimuovere e gettare il biochip. Sciacquare e asciugare all'aria le siringhe, le fiale di test e il vassoio di plastica rimovibile che ospitava il biochip durante i test. 13 sostanze chimiche, mostrate qui, sono state selezionate per i test come rappresentanti di un ampio spettro di composti industriali tossici che potrebbero essere possibili contaminanti dell'acqua potabile.

Durante i test, nove dei 13 sono stati rilevati dal rilevamento dell'impedenza del substrato delle celle elettriche entro un'ora, a concentrazioni rilevanti per la salute umana. Qui sono mostrate le uscite tipiche che si vedrebbero a seguito di un test di rilevamento dell'impedenza del substrato di una cella elettrica. I campioni contaminati finiscono per avere livelli di impedenza significativamente più bassi, rispetto ai campioni di acqua pulita di controllo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un biochip con un monostrato di cellule epiteliali branchiali di trota iridea e successivamente utilizzare quel biochip in un test di tossicità basato sull'impedenza per la valutazione della tossicità dell'acqua potabile. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare in modo asettico nella preparazione dei biochip e anche di mantenere i biochip refrigerati fino al momento dell'utilizzo. Ogni biochip può essere utilizzato una sola volta e poi deve essere scartato.

Una volta padroneggiata, la preparazione del biochip può essere eseguita in circa 10 minuti. Questa è una stima, perché le patatine vengono preparate in lotti. Il test dell'impedenza del campione, compresa la preparazione del campione, richiede circa un'ora e 10 minuti se viene eseguito correttamente.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come la chimica analitica, possono essere eseguiti su un campione che ha prodotto un risultato contaminato, al fine di identificare la sostanza chimica o le sostanze chimiche sospette. Lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori interessati al rilevamento della tossicità dell'acqua per utilizzare la tecnologia che utilizza le cellule epiteliali branchiali della trota iridea e il rilevamento dell'impedenza. Ci auguriamo che troviate utili le tecniche e attendiamo con impazienza le future innovazioni che queste nuove capacità possono aiutare a facilitare.

Grazie e buona giornata.