Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

L'obiettivo generale di questo protocollo è esaminare la coclea ciliare mutante di topo per i fenotipi di polarità delle cellule planari. Queste tecniche consentono di ottenere un'ampia definizione del fenotipo cocleare, che porterà a una comprensione più precisa del coinvolgimento ciliare nello stabilire la segnalazione della PCP nei vertebrati. Il vantaggio principale di questo protocollo è che, una volta padroneggiato, gli epiteli cocleari sezionati possono essere utilizzati per una varietà di diversi tipi di analisi fenotipica.

Dopo aver preparato i reagenti e il tessuto da animali da esperimento, nella fase di sviluppo da E16.5 a p3, utilizzare una lama di bisturi o un piccolo paio di forbici per sezionare la testa lungo la linea mediana sagittale a partire dal naso e estendendo il cotile. Rimuovere il cervello da ciascuna metà del cranio con un paio di pinze. Quindi, identificare le ossa temporali che contengono i labirinti ossei in via di sviluppo dell'orecchio interno.

Mentre si lavora con il campione al microscopio da dissezione, utilizzare un paio di pinze per allontanare i labirinti ossei dal cranio facendo scorrere delicatamente le pinze sotto i labirinti ossei. Dopo la dissezione, utilizzare la punta della pinza da dissezione per liberare le finestre ovali e rotonde e praticare un piccolo foro all'apice della spirale cocleare. Successivamente, fissare i labirinti ossei in 1,5 millilitri di paraformaldeide al 4% per cinque minuti su ghiaccio per consentire una facile rimozione della membrana tectoriale.

Ora, posizionare i labirinti ossei in una capsula di dissezione rivestita di elastomero siliconico nero contenente PBS per facilitare la dissezione. Usa la pinza numero cinque per rimuovere la cartilagine esterna, esponendo il dotto cocleare. Inizia dalla finestra ovale, inserisci la punta inferiore della pinza nella finestra ovale e fai leva delicatamente sulla cartilagine, spostandoti lentamente verso l'alto verso l'apice.

Quindi, usa un paio di pinze sottili per pizzicare la membrana di Reissner alla base del dotto cocleare e staccarla con un movimento verso l'alto. Visualizza l'aspetto dorsale del dotto cocleare, compreso l'epitelio sensoriale. Quindi, usa la pinza numero 55 per pizzicare la membrana tectoriale alla base della coclea e sbucciarla verso l'alto verso l'apice.

La rimozione completa della membrana tettonica è necessaria per ottenere le migliori immagini con l'immunoistochimica ed è essenziale per la microscopia elettronica a scansione. Dopo aver esposto l'organo di Corti, fissare ulteriormente il tessuto ed eseguire l'immunoistochimica, o prepararsi per la microscopia elettronica a scansione, come dettagliato nella parte scritta del protocollo. Dopo che il tessuto è stato colorato, posizionare il campione in una capsula in elastomero siliconico nero, contenente PBS.

Utilizzando una pinza fine, rimuovere la regione vestibolare dalla spirale cocleare. Quindi, rimuovere con molta attenzione la cartilagine sottostante e il mesenchima dalla spirale cocleare. La spirale cocleare rimanente contiene il solco interno, l'organo di Corti e il solco esterno.

Trasferire la spirale cocleare in una goccia di PBS posta su un vetrino da microscopio. Allontana il PBS con un fazzoletto assorbente o un pezzo di carta da filtro e riposiziona delicatamente la spirale cocleare se l'epitelio si è spostato e si sovrappone su se stesso. Aggiungere una goccia di terreno di montaggio direttamente sul campione di coclea e posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti direttamente sul campione, facendo attenzione a evitare bolle d'aria.

Utilizzare un microscopio confocale a epifluorescenza o a scansione laser dotato di obiettivi ad alto ingrandimento e ad alta apertura numerica, per acquisire immagini della superficie apicale della cellula ciliata cocleare. Utilizzare obiettivi inferiori per acquisire immagini sovrapposte della spirale cocleare per quantificare la lunghezza del dotto cocleare. Le immagini seguenti mostrano la colorazione immunofluorescente della coclea di tipo post-natale del primo giorno post-natale.

La falloidina marca: actina filamentosa nelle stereociglia e actina corticale alla periferia cellulare. La miosina VIIA è un marcatore per le cellule ciliate interne ed esterne. ZO_1 etichetta le giunzioni strette tra le cellule, rendendolo un ottimo marcatore per distinguere i confini delle cellule.

L'alfa-tubulina acetilata è usata come marcatore per il kinocilium al vertice del fascio, come indicato dalla freccia bianca. I microtubuli interni sono anche marcati dall'alfa-tubulina acetilata, che è particolarmente abbondante nelle cellule pilastro, come indicato dagli asterischi bianchi. Questa immagine di dotti cocleari sezionati a E18.5, colorati con tubulina acetilata, mostra un marcato accorciamento dei dotti cocleari knockout condizionali di IFT20 rispetto al controllo.

L'immagine seguente è una preparazione a montatura intera del giro cocleare basale, in un topo knockout BBS8, al giorno zero post-natale. I fasci stereociliari nelle coclee knockout BBS8 sono variamente ruotati, come indicato dalla freccia destra, o appiattiti e mal localizzati, come indicato dalla freccia centrale. I kinocilia sono mal localizzati o mancano gli assonemi, come indicato dalla freccia sinistra.

Quando si prepara il fenotipo cocleare per l'analisi, è importante ricordare che le differenze nel background genetico possono modificare il fenotipo cocleare. Pertanto, è importante utilizzare i controlli dei compagni di cucciolata per l'analisi. Ulteriori analisi includono test audiometrici e coltura di espianti cocleari, che consentono il trattamento con vari attivatori o inibitori del segnale, contribuendo così alla comprensione meccanicistica dei processi di sviluppo coinvolti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il tessuto cocleare per analizzare il ruolo dei componenti ciliari e i loro effetti distinti sulla segnalazione della PCP.