Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

L'obiettivo generale di questo metodo di dissezione dell'intera montatura è isolare la regione sensoriale della coclea adulta calcificata sotto forma di tre giri intatti: l'apice, il centro e la base. Questo metodo di dissezione preserva la struttura tridimensionale dell'organo di Corti e consente la visualizzazione di tutte le cellule se combinato con l'immunocolorazione e la microscopia confocale per l'imaging su diversi piani sull'asse Z. Rispetto ai metodi di dissezione precedenti, utilizziamo una strategia diversa che genera tre giri cocleari che sono più grandi e hanno meno probabilità di essere persi o danneggiati nel processo di immunocolorazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione è difficile da imparare. Poiché l'organo di Corti è fragile, c'è un piccolo margine di errore quando si rimuove il legamento spiralico. Dopo aver soppresso l'animale secondo le procedure approvate e aver rimosso il cervello, inizia identificando le ossa temporali alla base del cranio del topo.

Quindi raschiare via i nervi cranici usando una pinza standard. Posizionare la pinza sulla punta della capsula otica e utilizzare il pollice della mano opposta per premere sul canale semicircolare posteriore per rimuovere la coclea incapsulata. Liberare la metà inferiore dell'osso temporale dal cranio manualmente con il pollice e l'indice o usando forbici sottili da 10,5 centimetri e metterla in microscopia elettronica senza metanolo grado 4% di paraformaldeide per fissarla.

Dopo la fissazione, decalcificare le ossa temporali secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo. Per determinare se il campione è adeguatamente decalcificato, posizionare le ossa temporali su una capsula di dissezione rivestita in elastomero di silicone e premere delicatamente una pinza sulla coclea a forma di lumaca. Se il tessuto è spugnoso, la decalcificazione è completa.

Aggiungere PBS al piatto di dissezione, quindi mentre si lavora sotto un microscopio per stereodissezione, utilizzare una pinza numero quattro o numero cinque per tenere l'osso temporale nella regione vestibolare e cinque millilitri di forbici a molla di Vannas-Tubingen per tagliare via il tessuto in eccesso della capsula otica lungo i lati e sopra l'apice. Usando le forbici a molla Vannas da 2,5 millilitri, inserisci una lama nella finestra ovale e fai diversi piccoli tagli lungo il legamento a spirale del giro basale. Ora, inserisci una lama delle forbici a molla Vannas-Tubingen da cinque millilitri nella regione appena tagliata e posiziona l'altra lama all'esterno dell'osso temporale, medialmente alla finestra ovale.

Questo taglio separa la virgola basale da quella centrale e apicale. Successivamente, per completare la dissezione della curva basale, utilizzare le forbici a molla da 2,5 millilitri per tagliare le fibre nervose del ganglio a spirale che si collegano al modiolo per rilasciare la tensione nella curva basale. Tagliare sotto la gira basale per separarsi dagli organi vestibolari.

Utilizzare una pinza per guidare il tessuto e fissare le fibre gangliari a spirale al piatto rivestito in elastomero siliconico. Effettuare una serie di piccoli tagli per asportare il legamento spirale sia da sopra che da sotto l'organo di Corti. Con le fibre gangliari a spirale fissate al piatto rivestito in elastomero siliconico, utilizzare la pinza per rimuovere l'eventuale membrana di Reissner rimanente dall'organo di Corti.

Eseguire diversi tagli per ridurre lo spessore degli assoni gangliari a spirale. Quindi afferrare gli assoni rimanenti del ganglio spirale con una pinza e trasferire il giro basale sezionato in una piastra a 48 pozzetti contenente circa 500 microlitri di PBS. Ora separa i giri centrali e apicali posizionando prima i restanti due terzi della coclea con il lato apicale rivolto verso il basso.

Quindi inserire una lama delle forbici da 2,5 millilitri nella scala media, dove il giro centrale era precedentemente collegato al giro basale, e fare diversi tagli lungo il legamento a spirale del giro centrale. Usando le forbici da cinque millilitri, inserisci una lama nella regione di taglio, con il giro centrale posizionato sopra la lama. Posizionare l'altra lama all'esterno del labirinto osseo, con un angolo di 90 gradi rispetto alla punta apicale.

Questo taglio separa la spira centrale dalla spira apicale. Successivamente, completare la dissezione del giro medio rimuovendo il legamento spirale dall'organo di Corti. Trasferire il giro sezionato su una piastra a 48 pozzetti, come prima.

Ora, usa le forbici a molla Vannas da 2,5 millilitri per aprire il tappo che copre il giro apicale e ripeti la procedura per rimuovere il legamento a spirale del giro apicale dall'organo di Corti. Trasferire il giro sezionato su una piastra a 48 pozzetti, come prima. Per iniziare la procedura di immunocolorazione, aspirare prima il PBS da ciascun pozzetto, quindi sostituirlo con 200-300 microlitri di soluzione bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un rotatore 3D.

Trascorso il tempo di incubazione, rimuovere la soluzione bloccante e sostituirla con 100 microlitri di anticorpo primario, opportunamente diluito in soluzione di vettore. Incubare per una notte a quattro gradi Celsius su un rotatore 3D. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di anticorpi primari e lavare ogni pozzetto con 500 microlitri di PBS per almeno cinque minuti ogni volta, a temperatura ambiente.

Ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il PBS e fare attenzione a non aspirare la spira sezionata nel puntale della pipetta. Sostituire con 100 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario marcato in fluorescenza diluito in soluzione di vettore.

Posizionare la piastra a 48 pozzetti in una scatola nera per proteggerla dalla luce e posizionarla sul rotatore 3D per incubare per due o tre ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare tre volte con PBS come prima. Dopo aver tolto l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di Hoechst per etichettare i nuclei.

Proteggere dalla luce e incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Infine, rimuovere la soluzione Hoechst e lavare tre volte con PBS come prima. Dopo aver etichettato ogni vetrino, pipettare 50 microlitri di terreno di montaggio su ciascun vetrino.

Quindi, utilizzando la pinza da gioielliere diritta numero quattro o numero cinque, afferrare gli assoni del ganglio a spirale e trasferire delicatamente un giro cocleare dalla piastra a 48 pozzetti al mezzo di montaggio. Utilizzare il microscopio per assicurarsi che la spira sezionata non sia piegata o attorcigliata. Posizionare un'estremità di un vetrino coprioggetti su un vetrino e rilasciarlo delicatamente per far cadere il vetrino coprioggetti.

Utilizzare un microscopio a stereodissezione per assicurarsi che la spira cocleare non si trovi vicino a una bolla d'aria. In tal caso, spostare delicatamente il vetrino coprioggetto avanti e indietro per riposizionare la spira cocleare. Ripetere la procedura per gli altri giri cocleari.

Montare un giro cocleare per vetrino per evitare l'esposizione alla luce e lo sbiancamento delle foto durante il processo di imaging. Posizionare le diapositive in una cartella di diapositive in modo che siano piatte. Proteggere dalla luce e lasciare che il supporto di montaggio indurisca durante la notte a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, sigillare i vetrini coprilatte con smalto trasparente e conservare a temperatura ambiente o 20 gradi Celsius fino all'immagine. Questa immagine della fetta confocale mostra il giro centrale cocleare isolato da un topo p15. Le immagini 420X sono state sovrapposte per ricostruire l'intera curva centrale.

Le cellule ciliate, marcate con un anticorpo primario anti-miosina VIIa di coniglio e un anticorpo secondario coniugato Alexa 647 appaiono magenta. Le cellule di supporto, marcate con un anticorpo primario anti-SOX2 di capra e un anticorpo secondario coniugato Alexa 568 appaiono verdi. I nuclei appaiono blu a causa della colorazione di Hoechst.

La barra della scala rappresenta 100 micron. Questa immagine mostra una sezione trasversale ottica della curva centrale isolata da un topo di sei settimane nel piano X, Z. Ancora una volta, le cellule ciliate sono etichettate con un fluoroforo magenta e le cellule di supporto con un fluoroforo che appare verde.

Si tratta di un ingrandimento maggiore dell'immagine precedente, con il mirino rimosso. La barra della scala rappresenta 20 micron. Le quattro immagini seguenti mostrano alcuni dei problemi che possono verificarsi durante la dissezione dell'intera montatura o quando il montaggio delle dizioni cocleari su vetrini.

Qui, sul lato sinistro dell'immagine, il tessuto cocleare è stato tagliato accanto all'ultima fila di cellule ciliate esterne, causando il montaggio di molte di queste cellule ad angoli diversi. In questa immagine, una sezione dell'organo di Corti sul lato sinistro è stata tagliata. C'è un foro praticato nella regione esterna delle cellule ciliate al centro dell'immagine.

Qui l'organo di Corti è piegato in più punti. Una volta padroneggiata, l'intera tecnica di dissezione della montatura può essere completata in 20-30 minuti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante evitare di posizionare la pinza sull'organo di Corti ed evitare di tirare o afferrare il legamento spirale.

Invece, chiudi la pinza e fissa le fibre del ganglio a spirale al piatto rivestito in elastomero siliconico. I campioni di topi di una o tre settimane sono più indulgenti e utili per imparare il metodo di dissezione. Inoltre, i campioni con danni alle cellule ciliate sono più difficili da sezionare, con i tessuti esposti al rumore particolarmente difficili e fragili.

Dopo questa procedura di dissezione, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia elettronica a scansione. Tuttavia, è necessario un fissativo diverso. Inoltre, abbiamo apportato lievi modifiche a questo protocollo per la dissezione del tessuto cocleare di ratto e, in futuro, speriamo di modificare ulteriormente per la dissezione della coclea da cincillà, gerbillo e cavia.