Name: Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Impara la dissezione a tutto monte e l'immunofluorescenza della coclea adulta di topo per studiare l'organo di Corti. Questo metodo preserva la struttura tridimensionale e consente la visualizzazione dettagliata delle cellule ciliate e di supporto mediante microscopia confocale.

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Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione dell'Office of Naval Research (N000141310569). L'attrezzatura della Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility è stata supportata dal National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e del Comitato uso alla Southern Illinois University School of Medicine. 1. Estrazione di temporali Ossa <ol><li> Identificare ossa temporali nella base del cranio del mouse 13 e raschiare via nervi cranici con pinze modello standard. </li><li> Posizionare forcipe modello standard con la punta della capsula otica e con il pollice della mano opposta stampa verso il basso sul canale semicircolare posteriore per rimuovere la coclea incapsulato. </li><li> Liberare la metà inferiore dell&#39;osso temporale dal cranio manualmente con il pollice e l&#39;indice o utilizzando 10,5 cm forbici sottili. </li></ol> 2. Post-fix temporali Ossa <ol><li> Mettere ossa temporali in 2 ml microprovette contenenti 250-500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) diluito in 10 mM tampone fosfato (PBS) pH 7.4 e incubmangiato a temperatura ambiente per 2-20 ore. NOTA: Non è necessaria l&#39;apertura della calotta apicale o iniezione di PFA nella rotonda o finestra ovale. Consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, microscopia elettronica (EM) di grado PFA che può essere acquistato ad una concentrazione del 16% in flaconcini di vetro. Una volta che una fiala viene aperto e diluito 1: 4 in PBS, facendo una soluzione al 4%, può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane se conservato a 4 ° C (Alcuni anticorpi richiedono breve fissazione e altri possono tollerare O / N (O / N) fissazione). </li></ol> 3. decalcify temporali Ossa <ol><li> Dopo la fissazione, rimuovere PFA con una pipetta e sostituirlo con 120 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), poco più di 2 ml. Assicurati di riempire l&#39;intera 2 ml provetta per evitare bolle d&#39;aria quando il tubo è chiuso. <ol><li> In caso contrario decalcificazione immediatamente, sostituire PFA con PBS 10 mM pH 7.4 e conservare i campioni a 4 ° C NOTA: Dopo la fissazione, ossa temporali possono essere conservati per variabLe quantità di tempo prima di decalcificazione seconda delle antigeni esaminata. </li></ol></li><li> Porre le provette su end-over-end dei rotatori e ruotano a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambiare soluzione EDTA quotidiano con una pipetta. Lunghezza della decalcificazione dipende dall&#39;età del campione e la preferenza del scienziato fare la dissezione. <ol><li> Incubare ossa temporali in EDTA utilizzando le seguenti linee guida per i tempi di incubazione: Per i campioni postnatale giorno (P) 8 a P15: 2-4 ore; Per i campioni di P15 P21: O / N; Per i campioni di P21 P30: 2 O / N; Per i campioni di età superiore a P30: 3 o più O / N. NOTA: i tempi di decalcificazione sono soggetti alle preferenze degli utenti e possono essere estesi a seconda delle necessità. Decalcificazione tempo può essere ridotto cambiando la soluzione di EDTA due volte al giorno, circa 8 ore a parte. Alcuni laboratori aggiungi 1% PFA alla soluzione EDTA quando decalcificazione per più di 3 giorni di tempo per evitare la contaminazione. </li></ol></li><li> Per determinare se il campione è adeguatamente decalcificata, posizionare ossa temporali ona silicone elastomero rivestito piatto dissezione e premere delicatamente pinze sulla coclea a forma di chiocciola. Se il tessuto è spongey, allora decalcificazione è completa. </li><li> Una volta che la decalcificazione, rimuovere EDTA con una pipetta e aggiungere 500 ml di -1.000 10 mM PBS pH 7,4. Conservare i campioni a 4 ° C fino al momento di sezionare. </li></ol> 4. Creare silicone elastomero rivestite Dish Dissection <ol><li> Unire la base e il catalizzatore di un kit incapsulante elastomero siliconico in base alle istruzioni del produttore e mescolare accuratamente. </li><li> Aggiungere circa 2-3 cucchiai di polvere di carbone fino a quando la soluzione è di colore nero e mescolare bene. NOTA: l&#39;inchiostro liquido o carbone liquido non si mescolano con la soluzione e non possono essere utilizzati. Kit elastomero incapsulante silicone possono essere acquistati in nero, permettendo passo 4.2 a essere omesso. </li><li> Versare la soluzione in 60 mm di vetro o scatole Petri in plastica, riempimento sufficiente a rivestire il fondo. Se bubbles sono presenti, sfoglia con l&#39;aria sulla superficie. Lasciate riposare almeno 24 ore a temperatura ambiente per impostare. NOTA: piatti elastomero silicone può essere utilizzato più volte per anni. Tuttavia non utilizzare l&#39;etanolo per la pulizia, in modo da causare il elastomero siliconico di crack. </li></ol> 5. intero monte dissezione della coclea (per P7 e campioni più vecchi) <ol><li> Separare il giro basale da curve medio / apicali <ol><li> Posizionare un osso temporale decalcificata in un piatto dissezione elastomero siliconico rivestite riempita per due terzi con 10 mM PBS pH 7.4 e utilizzare un microscopio dissezione stereo per i seguenti passaggi. </li><li> Tenere l&#39;osso temporale nella regione vestibolare con # 4 o # 5 pinze gioiellerie dritto e con 5 mm di forbici a molla Vannas-Tubinga, tagliare l&#39;eccesso di tessuto capsula otica lungo i lati e sopra l&#39;apice. </li><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nella finestra ovale e fare diversi piccoli tagli lungo la spirale legamento / lateraleparete del giro basale. </li><li> Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tubinga, inserire una lama nella regione appena tagliato e posizionare l&#39;altra lama sulla parte esterna dell&#39;osso temporale, mediale alla finestra ovale. Questo taglio separa il giro basale da curve medio e apicale. </li></ol></li><li> Dissezione completa del giro basale. <ol><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici primavera, tagliare le fibre nervose spirale gangliari che si connettono al modiolus per allentare la tensione nel giro basale e tagliare sotto il giro basale a separarsi da organi vestibolari. </li><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, effettuare una serie di piccoli tagli per rimuovere il / parete laterale spirale legamento da sopra e sotto l&#39;organo di Corti. Utilizzare # 4 o # 5 pinze gioielliere dritto per guidare il tessuto. Pin le fibre nervose spirale gangliari al rivestito-elastomero piatto dissezione di silicone, ma non tenere su questa regione come il tessuto si strappa. </li><li> Durante le fasi precedenti, alcuni dei Membran di Reissnere sarà spesso rimosso. Se qualcuno rimane ancora, afferrare la membrana della Reissner con una pinza # 4 o # 5 gioiellerie dritto e tirare via dal organo del Corti. NOTA: La membrana tectorial è raramente visibile e in genere galleggia via senza la necessità di una fase specifica per la rimozione. </li><li> Infine fare diversi tagli per ridurre lo spessore degli assoni spirale gangliari, per far girare il più piatto possibile e utilizzare # 4 o 5 # pinze gioielliere dritto per trasferire il giro basale sezionato, afferrando le rimanenti assoni del ganglio a spirale, a una piastra 48 pozzetti (o una diapositiva da camera) contenente ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4. </li></ol></li><li> Mezzo separata e curve apicali <ol><li> Posizionare i restanti due terzi della coclea, parte apicale verso il basso. </li><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nei media Scala, dove il turno di mezzo utilizzato per essere collegato al giro basale, e fare diversi piccoli tagli lungo il / parete laterale spirale legamento di the turno centrale. </li><li> Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tübingen, inserire una lama nella regione appena tagliato con il blocco di supporto centrale posto sulla parte superiore della lama, e posizionare l&#39;altra lama sul lato esterno del labirinto osseo, a un angolo di punta apicale 90 o. Questo separa la svolta mezzo dalla svolta apicale. </li></ol></li><li> Dissezione completa del blocco di supporto centrale in modo simile al giro basale (vedi i punti 5.2.2 a 5.2.4). </li><li> Dissezione completa del turno apicale. <ol><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, aprire il tappo che copre il turno apicale. Dissezione completa in un modo simile al giro basale (vedere i passi 5.2.2 a 5.2.4). NOTA: dissecato giri cocleari possono essere memorizzati in 10 mM PBS pH 7,4 in una piastra a 48 pozzetti (o camera di scorrimento) a 4 ° C per diverse settimane prima immunocolorazione. Tuttavia PBS evapora e deve essere rifornito periodicamente e stoccaggio più di 2 - 3 settimane può provocare la crescita batterica o fungina sultessuto che può diminuire la qualità dell&#39;immagine. Si consiglia di conservazione a lungo termine di campioni come ossa temporali undissected. </li></ol></li></ol> 6. Immunostaining con fluorescenza Tagged Anticorpi <ol><li> Dopo la dissezione, memorizzare ogni turno cocleare in un pozzo separata in una piastra da 48 pozzetti (o una diapositiva da camera), immerso in ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4. Per ciascuna delle seguenti fasi del turno cocleare deve essere immerso in un liquido, non galleggia sulla parte superiore o attaccato al lato del bene. NOTA: Quando si rimuove liquido da ciascun pozzetto, è facile perdere i giri cocleari o aspirare nella punta della pipetta. Modifica soluzioni con una punta della pipetta 200 microlitri utilizzando un ambito dissezione aiuterà a prevenire questo. </li><li> Usando una pipetta, rimuovere PBS da ogni pozzetto e sostituirlo con ~ 200-300 ml per pozzetto di bloccare / soluzione permeabilizzazione (1% Triton X-100, 1% di albumina sierica bovina (BSA), e siero di capra normale il 10% (NGS) diluito in 10 PBS mm PH 7.4). Incubare 1 ora a RT su un rotatore 3D. NOTA: Se un anticorpo primario utilizzato è stato fatto in una serie di capra, quindi sarà necessario un anticorpo anti-capra secondario e NGS NON deve essere utilizzato per uno dei passaggi. Siero di cavallo normale può essere utilizzato in sostituzione di NGS. </li><li> Rimuovere soluzione bloccante / permeabilizzazione con una pipetta e sostituirlo con ~ 100 microlitri per pozzetto di soluzione di anticorpo primario (0,1% Triton X-100, 1% BSA e 5% NGS diluito in PBS 10 mM pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni anticorpo primario varia. Incubare O / N (minimo 14 ore) a 4 ° C su un rotatore 3D. NOTA: Se si usa più di un anticorpo primario, tutti possono essere combinati nella stessa soluzione per l&#39;incubazione, basta assicurarsi che ogni anticorpo primario ha un host diverso. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Ogni lavaggio incuba un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. </li><li> Rimuovere ultima PBS lavata con una pipetta e sostituire con ~ 100 ml per pozzetto di soluzione di anticorpo secondario (0,1% Triton X-100, 1% BSA, e 5% NGS diluito in 10 mM PBS pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni fluorescente contrassegnati anticorpo secondario è di solito 1: 500 o 1: 1.000. Mettere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggere fluorescente contrassegnati anticorpi secondari dalla luce. Incubare 2-3 ore a temperatura ambiente su un rotatore 3D. NOTA: Se è necessario più di un anticorpo secondario, possono essere combinati nella stessa soluzione per l&#39;incubazione. Assicurarsi che non vi è alcuna possibilità di cross-etichettatura (ad es., Utilizzando capra anti-coniglio e pollo anti-capra anticorpi secondari) </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpo secondario con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. </li><li> Rimuovere ultimo lavaggio PBS utilizzando una pipetta e sostituirlo con ~ 100 pl per pozzetto di HOECHST 33342 (diluito 1: 2.000 in 10 mM PBS pH 7,4) per etichettare nuclei. Incubare 15 - 20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. NON incubare più lungo di 20 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione Hoechst con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. </li><li> Tutte le fasi possono essere estesi, tranne Hoechst incubazione, per diverse ore, se necessario. Per mettere in pausa la reazione in qualsiasi momento, basta immergere campioni in ~ 500 ul di 10mM PBS pH7.4 e conservare la piastra 48 be &#39;(o una diapositiva da camera) a 4 ° C fino al momento di riprendere le ore di protocollo o 1 - 2 giorni dopo . </li></ol> 7. Montare Cochlear Attiva diapositive <ol><li> Etichetta vetrini con informazioni pertinenti sul campione e anticorpi utilizzati. </li><li> Pipettare ~ 50 ml di supporti di montaggio sul ogni diapositiva e stia attentoper evitare bolle. Centrifugare la provetta contenente il supporto di montaggio per rimuovere eventuali bolle. </li><li> Utilizzando # 4 o pinze # 5 del gioielliere dritto, afferrare gli assoni del ganglio spirale di trasferire delicatamente un giro cocleare dalla piastra 48 pozzetti alla diapositiva e posto nei media di montaggio. Montare un giro cocleare per diapositiva per evitare l&#39;esposizione alla luce e photobleaching durante il processo di imaging. </li><li> Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire quel turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d&#39;aria. Se una di queste condizioni, pinza uso # 4 o # 5 del gioielliere dritto per riposizionare il turno cocleare. </li><li> Luogo un&#39;estremità di un coprioggetto sul vetrino e delicatamente rilasciare far cadere coprioggetto. </li><li> Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire che il turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d&#39;aria. Se una di queste condizioni, spostare delicatamente il coprioggetto avanti e indietro per riposizionare il turno cocleare. </li><li> Collocare i vetriniin una cartella diapositiva in modo che essi rimangano piatti. Lasciate montaggio supporti cura O / N a temperatura ambiente (tenere al buio) </li><li> Coprioggetto Seal con smalto trasparente e conservare a temperatura ambiente o -20 ° C fino a creare l&#39;immagine. Le diapositive possono essere memorizzati in una cartella diapositiva o scivolo box. NOTA: Le diapositive possono essere conservati a lungo termine a -20 ° C o -80 ° C e fluorescenza verrà mantenuto per diversi mesi. </li><li> Le diapositive di immagini utilizzando un microscopio confocale con la lunghezza d&#39;onda appropriata sulla base delle anticorpi secondari utilizzati durante la procedura di immunocolorazione. Luminosità e contrasto regolazioni possono essere eseguite utilizzando il software di imaging fornito dal venditore confocale. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Ci sono diversi passaggi critici per il successo dell&#39;intero dissezione mount e immunocolorazione. Tuttavia prima di uno di questi metodi vengono eseguiti, è necessaria un&#39;adeguata fissazione del tessuto cocleare. Si consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, grado EM PFA. PFA ottenuta dalla polvere può avere tracce di metanolo e un pH instabile che diminuisce la qualità di immunofluorescenza. Altri gruppi hanno anche dimostrato che le dissezioni simili sono possibili utilizzando fissativi che ...

La coclea a forma di spirale dell&#39;orecchio interno, contenuto all&#39;interno l&#39;osso temporale, ospita l&#39;organo del Corti, l&#39;organo sensoriale uditivo fine nei mammiferi. La coclea è tonotopically organizzato e comunemente suddivisa in apicale, centrale e basale giri corrispondente alle regioni di frequenze diverse con rilevamento del suono ad alta frequenza nella base e il rilevamento a bassa frequenza nel vertice 1. Le cellule cigliate, le cellule meccanosensoriali dell&#39;organo di Corti, eseguire la lunghezza della coclea, della lunghezza di circa 6 mm in topi 2,3. Queste cellule convertono l&#39;energia meccanica delle onde sonore, che sono trasmessi attraverso il labirinto membranoso pieno di liquido, in segnali neurali che vengono elaborati dalle strutture uditive centrali. La tecnica qui descritta fornisce un metodo per preparare supporti interi dell&#39;organo di Corti dopo calcificazione della coclea è completa (per i campioni che vanno da una settimana di vita adulta). Vi presentiamo anche un metodo per immunostavorazio il tutto montato tessuti cocleare. Supporti interi cocleari sono cruciali per la visualizzazione di tutte le cellule dei capelli e circostante cellule di sostegno nei loro arrangiamenti spaziali naturali e consentire l&#39;analisi in tre dimensioni con l&#39;uso della microscopia confocale. Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originariamente descritto un intero metodo di montaggio dissezione cocleare nel 1966. Hanno dettagliato una tecnica per fissare rapidamente e sezionare coclee calcificata immersi in un liquido da una varietà di mammiferi, preservando brevi segmenti intatti dell&#39;organo del Corti per l&#39;analisi microscopica 4. La dissezione di un unfixed, calcificata ratto coclea è stato illustrato in un video didattico 5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding alla Washington University fatto diverse modifiche importanti a questo metodo. Nella loro versione del metodo cocleare tutto il monte, l&#39;osso temporale era decalcificata, incorporato nella plastica, e cinque semi-spire o dieci quarti di giri erano dissezioneted 6,7. Dr. Charles Liberman e colleghi Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye e Ear Infirmary, modificato questa tecnica in modo che embedding plastica non è stato richiesto 8. Ulteriore modifica della tecnica si è verificato nel laboratorio del Dr. Jian Zuo in Ospedale dei Bambini St. Jude 9-12, che ha informato il metodo di dissezione presentato qui. Usiamo una strategia diversa per accedere al dell&#39;organo del Corti di Bohne e Liberman, che permette l&#39;isolamento di apicale completo, medio, e si gira basali. Così il tessuto sezionato è più grande e meno probabilità di essere perso o danneggiato durante i processi di dissezione e di immunoistochimica. Inoltre, l&#39;attuale metodo facilita misura della distanza dalla punta apicale o gancio basale per identificare una regione di frequenza. Anche se molti laboratori svolgono immunocolorazione del tessuto cocleare, non è chiaro in cui questo metodo ha avuto origine. Di conseguenza ci sono varie ricette per il blocco buffers e buffer di incubazione anticorpo che possono influenzare le prestazioni di anticorpi primari individuali. Qui, presentiamo un metodo per immunocolorazione con anticorpi targhette fluorescenza che è applicabile agli anticorpi più comunemente usati nel campo uditivo. La forma complessa della coclea, delicata struttura dell&#39;organo del Corti, e encasement ossuto forniscono una sfida per l&#39;analisi istologica e biochimica. Una varietà di tecniche sono attualmente utilizzati nel campo dell&#39;udito di superare queste caratteristiche difficili e visualizzare le cellule all&#39;interno dell&#39;organo di Corti, ogni tecnica con i suoi vantaggi e svantaggi. Il protocollo presentato qui permette per tutta la dissezione monte della coclea topo adulto e, con leggera modifica, può potenzialmente essere utilizzato per esaminare le strutture critiche all&#39;interno del coclee da una varietà di altri organismi modello utilizzato in campo.

<table><tbody><tr><td>Le pinze standard</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>possono essere acquistate da altri fornitori</td></tr><tr><td>Forbici fini da 10,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>possono essere acquistate da altri fornitori Provette</td></tr> per <tr><td>microcentrifuga da 2 ml</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>possono essere acquistate da altri fornitori</td></tr><tr><td>16% formaldeide, senza metanolo, ultra puro, grado EM</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TOSSICO --indossare guanti e non possono essere gettati nel lavandino. Può essere acquistato da altri fornitori.</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>può essere acquistato da altri fornitori EDTA</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>può essere acquistato da altri fornitori rotatore</td></tr><tr><td>per tubi end-over-end</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>può essere acquistato da altri fornitori Piastra</td></tr><tr><td>di Petri da 60 mm</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>può essere acquistata da altri fornitori</td></tr><tr><td>Kit incapsulante in silicone Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>carbone attivo</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>può essere acquistato da altri fornitori</td></tr><tr><td>microscopio per dissezione stereo</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>può essere acquistato da altri fornitori Dumont</td></tr><tr><td>#4 pinza da gioielliere</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinza da gioielliere</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas da 2,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>curve&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas-Tubingen da 5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td> piastre <td>diritte</td></tr><tr><td>a 48 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>possono essere acquistate da altri fornitori</td></tr><tr><td>Vetrini per camera a 8 pozzetti Fisher</td><td></td><td>1256518</td><td>possono essere acquistati da altri fornitori Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>può essere acquistato da altri fornitori</td></tr><tr><td>BSA, frazione V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>può essere acquistato da altri fornitori</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>può essere acquistato da altri fornitori NHS</td></tr><tr><td></td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>può essere acquistato da altri fornitori</td></tr><tr><td>Rotatore 3D</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>può essere acquistato da altri fornitori</td></tr><tr><td>Scatola di incubazione Western blot XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>può essere acquistato da altri fornitori Supporti</td></tr> di <tr><td>montaggio antisbiadimento in oro Prolong</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>possono essere acquistati da altri fornitori, ma i supporti di montaggio variano nella loro capacità di proteggere dal fotosbiancamento</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>può essere acquistato da altri fornitori</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>può essere acquistato da altri fornitori smalto</td></tr><tr><td>trasparente</td><td>Farmacia</td><td></td> locale <td>può essere acquistato da altri fornitori cartella</td></tr><tr><td>per vetrini in cartone</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>può essere acquistato da altri fornitori scatola</td></tr><tr><td>per vetrini in plastica</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>può essere acquistato da altri fornitori</td></tr></tbody></table>

tutta monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto coclea

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

L'organo di Corti, alloggiato nella coclea dell'orecchio interno, contiene cellule ciliate meccanosensoriali e cellule di supporto circostanti che sono organizzate a forma di spirale e hanno un gradiente tonotopico per la rilevazione del suono. La coclea del topo è lunga circa 6 mm e spesso divisa in tre giri (apice, centro e base) per l'analisi. Per studiare la perdita cellulare, la divisione cellulare o l'espressione genica a mosaico, è utile l'intera montatura o la preparazione della superficie della coclea. Questo metodo di dissezione consente la visualizzazione di tutte le cellule all'interno dell'organo di Corti se combinato con l'immunocolorazione e la microscopia confocale per visualizzare le cellule su diversi piani dell'asse z. Da queste immagini z-stack è possibile ottenere anche più sezioni trasversali ottiche. Inoltre, il metodo di dissezione dell'intera montatura può essere utilizzato per la microscopia elettronica a scansione, sebbene sia necessario un metodo di fissazione diverso. Qui, presentiamo un metodo per isolare l'organo di Corti sotto forma di tre giri cocleari intatti (apice, medio e base). Questo metodo può essere utilizzato per topi di età compresa tra una settimana e l'età adulta e differisce dalla tecnica utilizzata per i campioni neonatali in cui la calcificazione della coclea è incompleta. Una versione leggermente modificata può essere utilizzata per la dissezione della coclea di ratto. Dimostriamo anche una procedura per l'immunocolorazione con anticorpi marcati in fluorescenza.

Presentiamo un metodo per isolare l&#39;organo del Corti come tre giri intatte cocleari (apice, medio e base) dal tessuto cocleare che è calcificata, con gradini dissezione chiave presentati in Figura 1. Durante la prima settimana postnatale dello sviluppo, calcificazione Mouse coclea è incompleta e più semplice metodo di dissezione 13 può essere utilizzato. Utilizzando l&#39;intero metodo di dissezione monte neonatale con coclea da P7 e anziani topi risultati...

Vi presentiamo un metodo per isolare l&#39;organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

L'obiettivo generale di questo metodo di dissezione in toto è isolare la regione sensoriale della coclea adulta calcificata in tre giri intatti: l'apice, la parte media e la base. Questo metodo di dissezione preserva la struttura tridimensionale dell'organo del Corti e permette la visualizzazione di tutte le cellule quando combinato con immunomarcatura e microscopia confocale per ottenere immagini in diversi piani lungo l'asse Z. Rispetto ai metodi di dissezione precedenti, utilizziamo una strategia differente che genera tre giri cocleari più grandi e meno soggetti a perdita o danneggiamento durante il processo di immunomarcatura.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione è difficile da apprendere. Poiché l'organo del Corti è fragile, il margine di errore durante la rimozione del legamento spirale è molto ridotto. Dopo l'eutanasia dell'animale secondo procedure approvate e la rimozione del cervello, iniziare identificando le ossa temporali alla base del cranio del topo.Quindi rimuovere i nervi cranici utilizzando pinze da dissezione standard. Posizionare le pinze alla punta della capsula otica e premere con il pollice della mano opposta sul canale semicircolare posteriore per staccare la coclea contenuta nella capsula. Liberare la metà inferiore dell'osso temporale dal cranio manualmente con il pollice e l'indice oppure utilizzando forbici fini da 10,5 centimetri, quindi immergere in paraformaldeide al 4% in metanolo privo di residui, adatta per microscopia elettronica, per la fissazione.Dopo la fissazione, decalcificare le ossa temporali seguendo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo. Per determinare se il campione è stato adeguatamente decalcificato, posizionare le ossa temporali su una bacinella per dissezione rivestita con elastomero di silicone e premere delicatamente con una pinzetta sulla coclea di forma a chiocciola. Se il tessuto risulta spugnoso, la decalcificazione è completa.Aggiungere PBS nella piastra per dissezione, quindi, lavorando al microscopio stereoscopico da dissezione, utilizzare pinzette numero quattro o numero cinque per tenere l'osso temporale nella regione vestibolare e forbici a molla Vannas-Tubingen da cinque millilitri per rimuovere il tessuto in eccesso della capsula otica lungo i lati e sopra l'apice. Utilizzando forbici a molla Vannas da 2,5 millilitri, inserire una lama nella finestra ovale ed effettuare diverse piccole incisioni lungo il legamento spirale del giro basale. A questo punto, inserire una lama delle forbici a molla Vannas-Tubingen da cinque millilitri nella zona appena incisa e posizionare l'altra lama all'esterno dell'osso temporale, medialmente rispetto alla finestra ovale.Questo taglio separa il giro basale dai giri medio e apicale. Successivamente, per completare la dissezione del giro basale, utilizzare le forbici a molla da 2,5 millilitri per recidere le fibre nervose del ganglio spirale che si collegano al modiolo, in modo da alleviare la tensione nel giro basale. Effettuare un taglio al di sotto del giro basale per separarlo dagli organi vestibolari.Utilizzare la pinzetta per guidare il tessuto e fissare le fibre del ganglio spirale alla piastra rivestita di elastomero al silicone. Eseguire una serie di piccoli tagli per rimuovere il legamento spirale sia sopra che sotto l'organo del Corti. Con le fibre del ganglio spirale fissate alla piastra rivestita di elastomero al silicone, utilizzare la pinzetta per rimuovere qualsiasi membrana di Reissner residua dall'organo del Corti.Eseguire diversi tagli per ridurre lo spessore degli assoni del ganglio spirale. Quindi afferrare con una pinzetta gli assoni rimanenti del ganglio spirale e trasferire il giro basale dissezionato in una piastra a 48 pozzetti contenente circa 500 microlitri di PBS. A questo punto, separare i giri medio e apicale posizionando innanzitutto i due terzi rimanenti della coclea con il lato apicale verso il basso.Quindi inserire una lama delle forbici da 2,5 millilitri nella scala media, nel punto in cui il giro medio era precedentemente connesso al giro basale, ed effettuare diverse incisioni lungo il legamento spirale del giro medio. Utilizzando le forbici da cinque millilitri, inserire una lama nella zona incisa, posizionando il giro medio sopra la lama. Posizionare l'altra lama all'esterno del labirinto osseo, formando un angolo di 90 gradi rispetto all'apice.Questo taglio separa il giro medio dal giro apicale. Successivamente, completare la dissezione del giro medio rimuovendo il legamento spirale dall'organo del Corti. Trasferire il giro dissezionato in una piastra a 48 pozzetti, come in precedenza.Ora, utilizzare forbici a molla Vannas da 2,5 millilitri per aprire il cappuccio che ricopre il giro apicale e ripetere la procedura per rimuovere il legamento spirale del giro apicale dall'organo del Corti. Trasferire il giro dissezionato in una piastra a 48 pozzetti, come in precedenza. Per iniziare la procedura di immunomarcatura, aspirare prima il PBS da ogni pozzetto, quindi sostituirlo con 200-300 microlitri di soluzione bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un rotatore 3D.Trascorso il tempo di incubazione, rimuovere la soluzione di blocco e sostituirla con 100 microlitri di anticorpo primario, diluito opportunamente nella soluzione veicolare. Incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su un rotatore 3D. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare ogni pozzetto con 500 microlitri di PBS per almeno cinque minuti ogni volta, a temperatura ambiente.Ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il PBS avendo cura di non aspirare il tessuto dissecato nella punta della pipetta. Sostituire con 100 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario marcato con fluorocromo, diluito in soluzione veicolare.Posizionare la piastra a 48 pozzetti in una scatola nera per proteggerla dalla luce e metterla sul rotatore 3D per un'incubazione di due o tre ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione dell'anticorpo secondario e lavare tre volte con PBS come in precedenza. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di Hoechst per etichettare i nuclei.Proteggere dalla luce e incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Infine, rimuovere la soluzione di Hoechst e lavare tre volte con PBS come in precedenza. Dopo aver etichettato ogni vetrino, pipettare 50 microlitri di mezzo di montaggio su ciascun vetrino.Quindi, utilizzando pinzette dritte da gioielliere numero quattro o numero cinque, afferrare gli assoni del ganglio spirale e trasferire delicatamente un giro cocleare dalla piastra a 48 pozzetti al mezzo di montaggio. Utilizzare il microscopio per assicurarsi che il giro dissezionato non sia piegato o attorcigliato. Appoggiare un'estremità di un coprioggetto su un vetrino e rilasciarlo delicatamente in modo che il coprioggetto cada lentamente.Utilizzare un microscopio stereoscopico per accertarsi che l'avvolgimento cocleare non si trovi vicino a una bolla d'aria. Se ciò dovesse accadere, spostare delicatamente il coprioggetto avanti e indietro per riposizionare l'avvolgimento cocleare. Ripetere la procedura per gli altri avvolgimenti cocleari.Montare un giro della coclea per ogni vetrino per evitare l'esposizione alla luce e il fotoblecemento durante il processo di acquisizione delle immagini. Collocare i vetrini in una cartella in modo che giacciano piatti. Proteggere dalla luce e lasciare indurire il mezzo di montaggio tutta la notte a temperatura ambiente.Il giorno successivo, sigillare i coverslip con vernice trasparente per unghie e conservare a temperatura ambiente o a 20 gradi Celsius fino all'acquisizione dell'immagine. Questa immagine ottenuta con sezione confocale mostra il giro medio della coclea isolato da un topo p15. Le immagini a 420X sono state sovrapposte per ricostruire l'intero giro medio.I recettori uditivi, marcati con un anticorpo primario coniglio anti-miosina VIIa e un anticorpo secondario coniugato ad Alexa 647, appaiono magenta. Le cellule di sostegno, marcate con un anticorpo primario capra anti-SOX2 e un anticorpo secondario coniugato ad Alexa 568, appaiono verdi. I nuclei appaiono blu a causa della colorazione con Hoechst.La barra della scala rappresenta 100 micron. Questa immagine mostra una sezione ottica del giro medio isolato da un topo di sei settimane nel piano X, Z. Ancora una volta, le cellule ciliate sono marcate con un fluorocromo magenta e le cellule di sostegno con un fluorocromo che appare verde.Questa è un'ingrandimento maggiore dell'immagine precedente, con i mirini rimossi. La barra della scala rappresenta 20 micron. Le quattro immagini seguenti mostrano alcuni dei problemi che possono verificarsi durante la dissezione in toto o durante il montaggio delle spire cocleari su vetrini.Qui, sul lato sinistro dell'immagine, il tessuto cocleare è stato tagliato vicino all'ultima fila di cellule ciliate esterne, causando il montaggio di molte di queste cellule a diversi angoli. In questa immagine, una sezione dell'organo del Corti sul lato sinistro è stata asportata. Al centro dell'immagine si trova un foro praticato nella regione delle cellule ciliate esterne.Qui l'organo del Corti è piegato in diversi punti. Una volta acquisita padronanza, la tecnica di dissezione in preparato intero può essere completata in 20-30 minuti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante evitare di posizionare la pinzetta sull'organo del Corti e di evitare di tirare o afferrare il legamento spirale.Invece, chiudere la pinza e fissare le fibre del ganglio spirale alla piastra rivestita con elastomero di silicone. I campioni provenienti da topi di età compresa tra una e tre settimane sono più tolleranti e utili per imparare il metodo di dissezione. Inoltre, i campioni con danni alle cellule ciliate sono più difficili da dissezionare, con il tessuto esposto al rumore particolarmente delicato e fragile.Al termine di questa procedura di dissezione, possono essere eseguiti altri metodi, come la microscopia elettronica a scansione. Tuttavia, è necessario un fissativo diverso. Inoltre, abbiamo apportato alcune modifiche a questo protocollo per la dissezione del tessuto cocleare del ratto e, in futuro, speriamo di modificarlo ulteriormente per la dissezione della coclea di criceto, gerbillide e porcellino d'India.

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Una semplice procedura di vibratome sezionamento dell'organo del Corti, seguito da immunoistochimica e microscopia confocale è descritto. Questa procedura consente una migliore conservazione del bene citoarchitettura dell'organo di Corti dei mammiferi, e permette di conseguenza per la quantificazione precisa dei tipi di cellule.

Vibratome sezionamento per la Conservazione avanzata del citoarchitettura dell&#39;organo di Corti dei mammiferi

Le ciglia primarie influenzano varie vie di segnalazione. La coclea dei mammiferi è ideale per esaminare la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP). La disfunzione delle ciglia colpisce la crescita cocleare, il patterning cellulare e l'orientamento delle cellule ciliate, le letture della PCP. Il nostro obiettivo è analizzare la segnalazione della PCP nella coclea murina attraverso l'analisi fenotipica, l'immunoistochimica e la microscopia elettronica a scansione.

Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

Questo manoscritto descrive un protocollo sperimentale per valutare le caratteristiche morfologiche e lo stato funzionale delle sinapsi del nastro nei topi normali. Il modello attuale è adatto anche per modelli con sinaptopatia cocleare indotta dal rumore e legati all'età. Vengono inoltre discussi i risultati correlati dei precedenti studi sul mouse.

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l'uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l'immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

Viene presentato un protocollo per l'elaborazione di coclee di gerbillo giovani adulti e invecchiati immunomarcando le strutture sinaptiche afferenti e le cellule ciliate, spegnendo l'autofluorescenza nei tessuti invecchiati, sezionando e stimando la lunghezza delle coclee e quantificando le sinapsi in pile di immagini ottenute con l'imaging confocale.

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Qui, presentiamo un protocollo per un modello murino di perdita dell'udito indotta dal rumore (NIHL). Per indurre NIHL, abbiamo sviluppato un nuovo e semplice dispositivo utilizzando plastica ondulata, una gabbia trappola per topi e un altoparlante. La risposta uditiva del tronco cerebrale e l'imaging immunofluorescenza sono stati impiegati per valutare rispettivamente la funzione uditiva e il danno esterno delle cellule ciliate.

Condizioni sperimentali modificate per la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno esterno delle cellule ciliate

È stato sviluppato un microscopio a foglio di luce per visualizzare e digitalizzare l'intera coclea.

Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

La stria vasculare è vitale per la generazione del potenziale endococleare. Qui, presentiamo la dissezione della stria vasculare del topo adulto per il sequenziamento a singolo nucleo o l'immunocolorazione.

Dissezione della stria vascolare del topo adulto per sequenziamento di singoli nuclei o immunocolorazione

Questo protocollo, destinato agli utenti inesperti del tessuto dell'orecchio interno del topo, descrive in dettaglio i passaggi per l'elaborazione dell'orecchio interno del topo in diverse fasi di sviluppo per l'immunocolorazione della sezione.

Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

Impara la dissezione a tutto monte e l'immunofluorescenza della coclea adulta di topo per studiare l'organo di Corti. Questo metodo preserva la struttura tridimensionale e consente la visualizzazione dettagliata delle cellule ciliate e di supporto mediante microscopia confocale.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

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