Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

L'obiettivo generale di questo protocollo è stabilire colture primarie di fibroblasti a partire dalle orecchie e dalla coda di topi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, come ad esempio la differenza tra cellule sane e cellule tumorali. Il principale vantaggio di questo studio è che possiamo generare fibroblasti a partire da orecchie conservate in mezzo a temperatura ambiente per un periodo fino a 10 giorni prima dell'isolamento delle cellule.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia del topo, può essere applicato anche ad altri organismi animali mammiferi come ratti e conigli. Prima di raccogliere i tessuti, riempire piatti di coltura da 10 centimetri con 10 millilitri di mezzo completo. Successivamente, dopo l'eutanasia del topo, procedere utilizzando strumenti sterilizzati per raccogliere i campioni di tessuto.

Raccogliere i tessuti auricolari con un raggio di circa un centimetro e raccogliere circa cinque centimetri di tessuto della coda. Trasferire i tessuti in un tubo conico contenente 40 millilitri di etanolo al 70%. Lasciarli in ammollo per cinque minuti, quindi farli asciugare all'aria in una piastra da coltura da 10 centimetri aperta per cinque minuti in una cappa da coltura.

Dopo che i tessuti si sono asciugati, trasferirli sulla piastra contenente il mezzo. A questo punto, rimuovere i peli da tutti i tessuti utilizzando delle forbici e quindi tagliare i tessuti in pezzi più piccoli di tre millimetri. Trasferire il tessuto tritato in provette criogeniche e riempire le provette con soluzione di collagenasi D e pronasi, fino al segno di 1,8 millilitro.

Ora incubare i tessuti a 37 gradi Celsius, con agitazione a 200 giri al minuto per 90 minuti. Sotto la cappa, aggiungere una piastra con 10 millilitri di mezzo completo. Sopra la piastra, posizionare un filtro cellulare da 70 micron e, al termine dell'incubazione, versare la digestione del tessuto nel filtro.

Ora, macerare i tessuti nel filtro utilizzando un pestello. Procedere per almeno cinque minuti. Agitare occasionalmente il filtro nel mezzo per lavare via le cellule dissociate.

È importante che i tessuti dell'orecchio e della coda digeriti vengano ben macinati al fine di ottenere un buon numero di cellule. Assicurarsi inoltre di agitare il setaccio cellulare dopo la macinazione dei tessuti. Questo permetterà di recuperare ulteriori cellule dal setaccio.

Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Poi, risciacquare il filtro con 10 millilitri di mezzo e aggiungere la soluzione di risciacquo al campione. A questo punto, lavare le cellule.

Per prima cosa, centrifugare le cellule in una centrifuga refrigerata. In secondo luogo, rimuovere il soprannatante. E in terzo luogo, sospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo completo.

Ripetere il lavaggio un’altra volta e terminare la procedura con le cellule in mezzo completo, pronte per la coltivazione. Per coltivare le cellule, trasferire prima le sospensioni cellulari in piatti di coltura da 10 millilitri. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di soluzione di anfotericina B a ciascuna coltura.

Ora, incubare le cellule per tre giorni. Al terzo giorno, sostituire il mezzo con mezzo completo fresco contenente anfotericina B. Poco dopo, le colture raggiungeranno una confluenza del 70%. A questo punto, rimuovere il mezzo e risciacquare la coltura con cinque millilitri di PBS 1X.

Quindi, sostituire il PBS con due millilitri di soluzione di tripsina EDTA 1X e incubare le cellule per cinque minuti. Dopo la breve incubazione, battere delicatamente sulle piastre e aggiungere sei millilitri di mezzo completo fresco a ciascuna piastra. A questo punto, trasferire con una pipetta le cellule rilasciate dalla piastra in due provette coniche da 15 millilitri.

Quindi, centrifugare i tubi per cinque minuti a 450 G in una centrifuga refrigerata. Risospendere i pellet in cinque millilitri di mezzo completo e misurare la densità cellulare delle sospensioni. Ora, seminare le cellule in piastre da 10 centimetri a 200.000 per piastra.

Incubare queste cellule per tre o quattro giorni fino a quando raggiungono una confluenza del 70%, quindi ripetere il processo di raccolta e reimpianto delle cellule a una densità specifica. Possono essere coltivate in questo modo per un massimo di 25 giorni. Tre giorni dopo l'estrazione cellulare, era presente un significativo quantitativo di detriti nella coltura prima del cambio del mezzo.

I detriti cellulari sono evidenziati con frecce bianche. La barra della scala rappresenta 100 micron. Un nuovo mezzo ha ridotto in modo significativo i detriti cellulari.

Colture di tre giorni ottenute da tessuti conservati a temperatura ambiente per 10 giorni hanno dimostrato che i fibroblasti sono abbastanza resistenti. Da tali tessuti, è stata raggiunta una confluenza di fibroblasti del 70-80% dopo cinque-sei giorni. Le cellule sono state marcate con un marcatore per i fibroblasti, la vimentina, visibile in rosso.

Il DAPI è stato utilizzato per etichettare i nuclei, che appaiono in blu. La barra della scala è di 10 micron. La colorazione uniforme suggerisce che la coltura di fibroblasti è pura.

Il protocollo descritto ottiene regolarmente questo risultato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di concludere in questo modo l'illustrazione su come stabilire rapidamente e in modo affidabile colture primarie di fibroblasti. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è necessario prestare particolare attenzione all'estrazione dei fibroblasti dai tessuti, poiché una macinazione insufficiente del tessuto porterà a un numero inferiore di cellule.