Name: Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Impara a generare colture primarie di fibroblasti da orecchio e coda di topo per studi di biologia cellulare. Questo metodo consente di utilizzare tessuti conservati a temperatura ambiente fino a 10 giorni.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NRF HUJ-CREATE - Meccanismi cellulari e molecolari dell'infiammazione.

I topi sono stati alloggiati in condizioni di assenza di patogeni in conformità con le linee guida istituzionali fino euthanization (La cura istituzionale degli animali e del Comitato uso (IACUC) le linee guida presso l&#39;Università Nazionale di Singapore e del Comitato consultivo nazionale per Research Laboratory Animal (NACLAR) le linee guida). 1. Topi <ol><li> Ordinare un mouse del background genetico appropriato. Questo protocollo è basato sul tessuto derivato da uno C57BL / 6 del mouse. </li></ol> 2. Preparazione del terreno completo <ol><li> Preparare terreno completo aggiungendo le seguenti componenti al Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: siero fetale bovino al 10% (FCS), 50 mM 2-mercaptoetanolo, 100 micron asparagina, glutammina 2 mM, soluzione di penicillina-streptomicina 1%. </li></ol> 3. Preparazione di enzima Solutions <ol><li> Preparare la soluzione collagenasi D in un tubo da 15 ml fondo conico. <ol><li> Pesare 10 mg di collagenasi D. Dissolve collagenasi D in 4 ml di terreno completo. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione pronasi in una provetta 1,7 ml microcentrifuga. <ol><li> Pesare 10 mg di Pronasi. </li><li> Aggiungere 5 ml di 1 M tampone Tris (pH 8,0). Aggiungere 1 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Rabboccare con 494 ml di acqua sterile. </li><li> Incubare la soluzione pronase a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione di Collagenasi D-pronasi Mix (≤2 Tails) Nota: Eseguire le fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare. <ol><li> Aggiungere 250 microlitri di soluzione pronase a 4 ml di soluzione di collagenasi D. </li><li> Passare il composto collagenasi D-pronasi attraverso un filtro siringa da 0,2 micron in una sterile 15 ml tubo fondo conico. </li></ol> 5. Estrazione di fibroblasti da tessuti dell&#39;orecchio e coda <ol><li> Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate.</li><li> Mettere in autoclave chirurgici strumenti (forbici e pinze) nel cofano coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm piatti di coltura di cellule ciascuno. </li><li> Tagliare orecchie (~ 1 cm raggio) e 5 cm di coda (dalla punta della coda) di un topo con le forbici e incubare per 5 minuti in 40 ml di etanolo 70% in una provetta sterile da 50 ml a fondo conico. </li><li> Orecchie con aria secca e la coda di collocarli in un 10 centimetri piatto di coltura cellulare aperta nel cappuccio per 5 min. Una volta essiccati, trasferimento orecchio e pezzi di coda a due piatti della cultura etichettati &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot; che contiene 10 ml di terreno completo come descritto al punto 5.3. </li><li> Eliminare i peli dalle orecchie e forbici coda utilizzando. </li><li> Tagliare orecchie e la coda in pezzi più piccoli di 3 mm di dimensioni con le forbici. </li><li> Trasferire i tessuti tagliati in 1,8 ml fiale cryotube etichettate &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot; e aggiungere collagenasi sufficiente soluzione D-pronasi per il volume di raggiungere i 1,8 ml sul flacone. </li><li> Pallacciare le fiale cryotube orizzontalmente su un ed agitare i campioni a 200 rpm per 90 min a 37 ° C. </li><li> Dopo 90 minuti di incubazione, rimuovere le fiale cryotube dal shaker e posizionare le fiale nella cappa. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm di colture cellulari piatti, con l&#39;etichetta &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot; ciascuno, e mettere un filtro 70 micron cella in ogni piatto. </li><li> Posizionare le orecchie e coda tessuti digeriti nel colino 70 micron cella nei piatti di conseguenza etichettati previste al punto 5.11 e con forza macinare i tessuti con una siringa da 10 ml stantuffo per&gt; 5 min. Agitare il filtro cellule occasionalmente nel mezzo per lavare le cellule fuori del filtro cella. </li><li> Pipetta la sospensione cellulare da ogni piatto in provette fondo due 15 ml coniche etichettati &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot;. Lavare il piatto e il filtro con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreno completo e aggiungere il supporto per le appropriate da 15 ml provette fondo conico. </li><li> Spin giù la cellasospensione per 7 minuti a 580 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera. </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 ml di mezzo completo per il pellet cellulare in 15 ml tubo fondo conico e risospendere le cellule. </li><li> Ripetere il passaggio 5.14 e 5.15. </li></ol> 6. Coltura di miscela cellulare <ol><li> Rimuovere il surnatante. Assicurarsi che il pellet di cellule rimane indisturbato. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di terreno completo e aggiungere il relativo composto per due 10 cm piatti di coltura di cellule etichettate &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot;. </li><li> Aggiungere 10 ml soluzione amfotericina B (soluzione madre: 250 mg / ml) per la cultura. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore. </li><li> Al terzo giorno, sostituire il mezzo con terreno completo contenente 10 ml fresco 10 ml di amfotericina B per rimuovere detriti (figure 1 e 2). </li></ol> 7. Sotto-cultura della fibroblasti <ol><li> Whecultura n raggiunge circa il 70% di confluenza (giorno 3-4 della cultura) rimuovere il supporto e lavare le cellule con 5 ml sterile 1x tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di soluzione sterile 1x tripsina-EDTA per le cellule. </li><li> Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore. </li><li> Dopo 5 minuti, delicatamente toccare il piatto cultura e aggiungere 6 ml di terreno completo alle cellule. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml conica fondo e girare il tubo per 5 minuti a 450 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera. </li><li> Rimuovere il surnatante, e delicatamente risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo completo. </li><li> Seed 2 x 10 5 cellule in un piatto di coltura cellulare 10 cm e incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore per 3-4 giorni prima di ripetere passaggi da 7.1 a 7.6. </li></ol> 8. Preparazione di orecchie per la spedizione Nota: eseguire tegli fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare. <ol><li> Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate. </li><li> Posizionare forbici e pinze in autoclave nel cofano coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 50 ml di terreno completo in un tubo da 50 ml fondo conico. </li><li> Tagliare le orecchie (~ 1 cm di raggio) di un mouse con le forbici. </li><li> Trasferire le orecchie nel tubo da 50 ml a fondo conico (come preparato al punto 3) con pinze. </li><li> Sigillare il tubo da 50 ml fondo conico con parafilm prima della spedizione a temperatura ambiente in una scatola appropriata. </li></ol>

<ol><li>Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi finanziari.

Qui forniamo una procedura semplice, economico e veloce sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. L&#39;estrazione dovrebbe risultare in fibroblasti divisorie aderenti e rapidamente entro 3 giorni post-isolamento del tessuto. Un importante limite di pile è senescenza, una crescita arresto permanente 15. Utilizzando il protocollo, colture di fibroblasti possono essere diversi passaggi da 5 a 6 volte prima fibroblasti diventano senescente, indicato dalla appiattimen...

Cellule primarie sono derivati ​​da tessuti e coltivate che vivono in condizioni in vitro. Si ritiene generalmente che le cellule primarie avvicinano maggiormente lo stato fisiologico e background genetico del tessuto da cui sono derivati ​​di linee cellulari immortalizzate o tumorali 1. Per questo motivo, cellule primarie rappresentano un modello utile per studiare le domande biologica 2,3. Tuttavia, a differenza di linee cellulari stabilizzate che crescono indefinitamente, pile infine subiscono senescenza nella cultura e devono essere frequentemente ristabilita. Pile comunemente usati includono fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, cellule T, cellule B, i macrofagi del midollo osseo (BMDM) e le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC). I fibroblasti sono spesso utilizzati come cellula primaria modello di coltura. Essi offrono vantaggi chiave rispetto ad altre cellule primarie. Le colture cellulari sono facilmente stabiliti, prontamente mantenuto e non richiedono purificazione di cellule precedenti alla cultura. Hanno rapida proliferazione iniziale e nessun requisito per i protocolli di media o di attivazione specializzate. I fibroblasti possono essere efficacemente trasfettate utilizzando protocolli fisici 4,5 biologici, chimici, e. C&#39;è la possibilità di memorizzare le orecchie fino a 10 giorni a temperatura ambiente, prima di stabilire colture cellulari. Colture di fibroblasti sono favorevoli alla visualizzazione dei processi citoplasmatici e adatto per la riprogrammazione in staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 6. I fibroblasti sono importanti cellule del tessuto connettivo che secernono proteine ​​collagene e della matrice extracellulare 7. Essi costituiscono il quadro strutturale in molti tessuti 8 e svolgono un ruolo fondamentale nella guarigione delle ferite e la riparazione dei tessuti 9,10. Qui, descriviamo un protocollo (4 ore &lt;) semplice e veloce per creare colture di fibroblasti da orecchie e le code di topo 11. Il protocollo richiede una minima del mouseesperienza per raccogliere i tessuti (a differenza di altri protocolli 12,13) ​​e può essere utilizzato per stabilire culture di orecchie memorizzati nel mezzo a temperatura ambiente per 10 giorni.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>Absolute per analisi</td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088866001</td><td>Da Clostridium histolyticum, liofilizzato, non sterile</td></tr><tr><td>Pronasi proteasi</td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>Da Streptomyces griseus&nbsp; </td></tr><tr><td>Tris tampone (pH 8)</td><td>1° BASE</td><td>1415</td><td>Grado ultra puro</td></tr><tr><td>0,5M EDTA (pH 8)</td><td>1° BASE</td><td>BUF-1053</td><td>Grado biotecnologico</td></tr><tr><td>10X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>1° BASE</td><td>BUF-2040-10X4L</td> Soluzione di tripsina-EDTA <td>di grado ultra puro</td></tr><tr><td>10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0,5% tripsina, 0,2% EDTA, tripsina gamma irradiata mediante processo SER-TAIN, senza rosso fenolo, in soluzione salina</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &mu; g/ml in acqua deionizzata, filtrata sterile</td></tr><tr><td>Forbice</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Aesculap</td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; M filtro per siringa</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro cellulare M</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Stantuffo siringa</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>Provetta crioviale</td><td>NUNC</td><td>368362</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare da 10 cm</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Piatto trattato per colture cellulari&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta a fondo conico da 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Provetta a fondo conico da 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>GFL</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore di incubazione</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 25 microscopio ottico</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Cellule primarie derivano direttamente dal tessuto e si pensa di essere più rappresentativo dello stato fisiologico delle cellule in vivo di linee cellulari stabilizzate. Tuttavia, colture cellulari primarie di solito hanno una durata di vita limitata e devono essere frequentemente ristabilita. I fibroblasti sono una fonte facilmente accessibile di cellule primarie. Qui, si discute una procedura semplice e rapida sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. Il protocollo può essere utilizzato per stabilire colture primarie di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Quando il protocollo è attentamente seguita, contaminazioni sono improbabili nonostante l&#39;uso di tessuti non sterile immagazzinato per tempo prolungato in alcuni casi. I fibroblasti proliferano rapidamente in coltura e possono essere espanse per un numero considerevole prima di subire la senescenza replicativa.

Estrazione di fibroblasti da risultati tessuto in una notevole quantità di frammenti di tessuto (Figura 1). In contrasto con i residui di tessuto, fibroblasti aderire a superfici di plastica coltura dei tessuti tra il giorno 1 e 3 della cultura. Il mezzo di colture di fibroblasti può essere modificato in modo sicuro il giorno 3 di coltura, che dovrebbe ridurre significativamente i livelli di detriti presenti nella cultura (Figura 2). I fibroblasti mostrano una morfologia allungata e un ...

Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è stabilire colture primarie di fibroblasti a partire dalle orecchie e dalla coda di topi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, come ad esempio la differenza tra cellule sane e cellule tumorali. Il principale vantaggio di questo studio è che possiamo generare fibroblasti a partire da orecchie conservate in mezzo a temperatura ambiente per un periodo fino a 10 giorni prima dell'isolamento delle cellule.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia del topo, può essere applicato anche ad altri organismi animali mammiferi come ratti e conigli. Prima di raccogliere i tessuti, riempire piatti di coltura da 10 centimetri con 10 millilitri di mezzo completo. Successivamente, dopo l'eutanasia del topo, procedere utilizzando strumenti sterilizzati per raccogliere i campioni di tessuto.Raccogliere i tessuti auricolari con un raggio di circa un centimetro e raccogliere circa cinque centimetri di tessuto della coda. Trasferire i tessuti in un tubo conico contenente 40 millilitri di etanolo al 70%. Lasciarli in ammollo per cinque minuti, quindi farli asciugare all'aria in

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Biologia dello sviluppo

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.

Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo video descrive il metodo rapido per isolare e coltivare contemporaneamente i melanociti e i fibroblasti dalla pelle del cucciolo di topo postnatale. Queste cellule possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare la biologia delle cellule della pelle, la guarigione delle ferite e il melanoma.

Coltura rapida di melanociti murini primari e fibroblasti: isolamento di melanociti e fibroblasti da un campione di pelle intera murina

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

Descriviamo qui un protocollo per la generazione di iCM utilizzando la somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c in un costrutto policistico. Questo protocollo produce una popolazione relativamente omogenea di cellule riprogrammate con una migliore efficienza e qualità ed è prezioso per studi futuri sulla riprogrammazione di iCM.

Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).

Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

Questo protocollo delinea un metodo rapido per generare simultaneamente colture di melanociti e fibroblasti dalla pelle di topi di 0-4 giorni. Queste colture primarie possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare una varietà di processi fisiologicamente rilevanti, tra cui biologia cellulare della pelle, pigmentazione, guarigione delle ferite e melanoma.

Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Qui viene presentato un protocollo per generare tessuti connettivi ingegnerizzati per una coltura parallela di 48 tessuti in una piastra multi-pozzo con doppi poli, adatto per studi meccanicistici, modellazione di malattie e applicazioni di screening. Il protocollo è compatibile con fibroblasti di diversi organi e specie ed è esemplificato qui con fibroblasti cardiaci primari umani.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Impara a generare colture primarie di fibroblasti da orecchio e coda di topo per studi di biologia cellulare. Questo metodo consente di utilizzare tessuti conservati a temperatura ambiente fino a 10 giorni.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

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