Name: Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS e AFM come strumenti di studi Biomolecule metallo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri l'interazione dell'oro con le proteine S-layer di Lysinibacillus sphaericus usando QCM-D, ICP-MS e AFM. Questo metodo consente il rilevamento in tempo reale della sorzione metallica per applicazioni ambientali e biotecnologiche.

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Il presente lavoro è stato parzialmente finanziato dal IGF-progetto &quot;S-Sieve&quot; (490 ZBG / 1), finanziato dal BMWi e BMBF-progetto &quot;Aptasens&quot; (BMBF / DLR 01RB0805A). Un ringraziamento speciale a Tobias J. Günther per il suo prezioso aiuto durante gli studi AFM e di Erik V. Johnstone per aver letto il manoscritto come un madrelingua inglese. Inoltre, l&#39;autore di questo articolo ringrazia Aline Ritter e Sabrina Gurlit (da Istituto di ecologia delle risorse per l&#39;assistenza nelle misurazioni ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava e la biotecnologia del gruppo del Helmholtz-Institut Freiberg per Technology Resource.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo lavoro ha studiato il legame di Au alle proteine ​​S-layer è stata studiata utilizzando una combinazione di diversi metodi di analisi. In particolare, il legame di Au è molto interessante non solo per il recupero di Au da acque minerarie o soluzioni di processo, ma anche per la costruzione di materiali, ad esempio, superfici sensoriali. Per gli studi di interazione Au (Au (III) e Au (0) -NPs) con sospensione e ricristallizzata monostrato di SLP1, la proteina doveva essere isolato. Pertanto, q...

A causa della crescente uso di oro per diverse applicazioni come l&#39;elettronica, catalizzatori, biosensori o strumenti medici, la domanda di questo metallo prezioso è cresciuta nel tempo degli ultimi anni 6-9. L&#39;oro così come molti altri metalli preziosi e pesanti vengono rilasciati nell&#39;ambiente tramite scarichi industriali in concentrazioni diluite, attraverso attività minerarie, e lo smaltimento dei rifiuti 7,8,10, anche se la maggior contaminazione ambientale da metalli pesanti o preziosi è un processo in corso principalmente causato da attività tecnologiche. Questo porta ad una interferenza significativa di ecosistemi naturali e potrebbe minacciare la salute umana 9. La conoscenza di questi risultati negativi promuove la ricerca di nuove tecniche per rimuovere i metalli da ecosistemi e miglioramenti contaminati nel riciclaggio dei metalli dalle acque di scarico industriali. Metodi fisico-chimici ben affermati come precipitazione o scambio ionico non sono così efficaci, specialmente in altaly diluito soluzioni 7,8,11. Bioassorbimento, sia con la vita o la biomassa morti, è un&#39;alternativa interessante per trattamento delle acque reflue 10,12. L&#39;uso di tali materiali biologici può ridurre il consumo di prodotti chimici tossici. Molti microrganismi sono stati descritti per la costituzione o immobilizzare metalli. Per esempio, le cellule di Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 hanno dimostrato elevate capacità di legame per i metalli preziosi, per esempio, Pd (II), Pt (II), Au (III), e altri metalli tossici come Pb (II) o U (VI) 4,13, cellule di Bacillus megaterium per Cr (VI) 14, le cellule di Saccharomyces cerevisiae per Pt (II) e Pd (II) 15, e Chlorella volgare Au (III) e U (VI) 16 , 17. Il legame di metalli precedenti, come Au (III), Pd (II), e Pt (II) è stato riportato anche per Desulfovibrio desulfuricans 18 e per L. sphaericus JG-B53 19,20. Tuttavia, non all microbi legano elevate quantità di metalli e la loro applicazione come materiale sorbitive è limitato 12,21. Inoltre, la capacità di legame del metallo dipende da diversi parametri, ad esempio, la composizione delle cellule, il bio-componente utilizzato, o ambientali e condizioni sperimentali (pH, forza ionica, temperatura etc.). Lo studio di frammenti di parete cellulare isolati 22,23, come lipidi di membrana, peptidoglicano, proteine ​​o altri componenti, aiuta a comprendere il processo di complessi costruiti cellule intere 8,21 vincolante metallo. I componenti cellulari focalizzati su in questo studio sono proteine ​​S-layer. Proteine ​​S-strato sono parti della busta esterna delle cellule di molti batteri e di archeobatteri, e costituiscono circa il 15 - 20% della massa di proteine ​​totali di questi organismi. Come la prima interfaccia per l&#39;ambiente, questi composti cellulari influenzano fortemente le proprietà di assorbimento batteriche 3. Proteine ​​S-strato con peso molecolare compreso tra quarantaa centinaia di kDa sono prodotti all&#39;interno della cellula, ma sono montati all&#39;esterno dove sono in grado di formare strati sulle membrane lipidiche o componenti della parete cellulare polimerici. Una volta isolato, quasi tutti S-layer proteine ​​hanno la proprietà intrinseca di auto-assemblarsi spontaneamente in sospensione, alle interfacce, o su superfici che formano strutture planari o tube-like 3. Lo spessore del monostrato proteine ​​dipende batteri ed è in un intervallo di 5 - 25 nm 24. In generale, le strutture proteiche S-strato formato può avere un obliquo (P1 o P2), quadrato (P4), o esagonale (p3 o p6) simmetria con costanti reticolari 2,5 a 35 nm 3,24. La formazione reticolare sembra essere in molti casi dipendono cationi bivalenti e principalmente su Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)). Tuttavia, la cascata reazione piena di monomero piegatura, interazione monomero-monomero, la formazione di un reticolo, e il ruolo dei diversi metalli, in particolare di cationi bivalenti come Ca 2+ e Mg 2+, non sono ancora del tutto chiaro. Il ceppo gram-positivi L. sphaericus JG-B53 (rinominato da Bacillus sphaericus dopo nuova classificazione filogenetica) 27 è stato isolato dalla miniera di uranio rifiuti mucchio &quot;Haberland&quot; (Johanngeorgenstadt, Sassonia, Germania) 4,28,29. La sua funzionale proteina S-layer (SLP1) possiede un reticolo quadrato, un peso molecolare di 116 kDa 30, e uno spessore di ≈ 10 nm a vivere cellule batteriche 31. In studi precedenti, la formazione in vitro di uno strato proteico chiuso e stabile con uno spessore di circa 10 nm è stato raggiunto in meno di 10 min 19. Il ceppo correlate L. sphaericus JG-A12, anche un isolato dal mucchio &quot;Haberland&quot;, possiede alta metallo capacità di legame e il suo isolato proteina S-layer ha mostrato un buon tasso di assorbimento chimica e stabilità meccanica e per i metalli preziosi come Au (III), Pt (II), e Pd (II) 4,32,33. Questo legame di metalli preziosi è più o meno specifici per alcuni metalli e dipende dalla disponibilità di gruppi funzionali sulla superficie esterna della proteina e interna del polimero e nei suoi pori, forza ionica, e il valore del pH. Gruppi funzionali rilevanti per l&#39;interazione metallo da parte delle proteine ​​sono COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - e SO-. In linea di principio, capacità di legame metallo aprono un ampio spettro di applicazioni, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)). ad esempio, come componenti biosorptive per la rimozione o recuperodi metalli tossici o pregiati disciolti, i modelli per sintesi o la deposizione di nanoparticelle definito regolarmente strutturati metalliche (NP) per la catalisi, e altri materiali bio-ingegneria, come bio-sensoriali strati 3,5,18,33. Array NP regolarmente organizzati come Au (0) -NPs potrebbero essere utilizzati per le principali applicazioni che spaziano dall&#39;elettronica molecolare e biosensori, dispositivi di storage ad altissima densità, e catalizzatori per CO-ossidazione 34-37. Lo sviluppo di tali applicazioni e design intelligente di questi materiali richiede una comprensione più profonda dei meccanismi vincolanti metallo sottostante. Un prerequisito per lo sviluppo di tali materiali bio-based è l&#39;implementazione affidabile di un livello di interfaccia tra la biomolecola e la superficie tecnica 38,39. Ad esempio, polielettroliti assemblati con il layer-by-layer (LBL) 40,41 tecnica sono stati utilizzati come strato di interfaccia per ricristallizzazione proteine ​​S-strato 39 </sup&gt;. Tale interfaccia offre un modo relativamente semplice per eseguire il rivestimento proteico in modo riproducibile e quantitativa. Eseguendo esperimenti diversi con e senza modifiche con i promotori adesive, è possibile fare dichiarazioni riguardanti la cinetica di rivestimento, la stabilità strato, e l&#39;interazione dei metalli con biomolecole 19,42, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)). Tuttavia, il complesso meccanismo di adsorbimento di proteine ​​e interazione proteina-superficie non è completamente noto. Soprattutto informazioni sulla conformazione, l&#39;orientamento del modello, e la densità di rivestimento è ancora mancante. Cristallo di quarzo microbilancia con il monitoraggio di dissipazione (QCM-D) la tecnica ha attirato l&#39;attenzione negli ultimi anni come uno strumento per lo studio delle proteine, la cinetica di rivestimento, e l&#39;interazione proprocessi su scala nanometrica 19,43-45. Questa tecnica permette di rilevare dettagliata di adsorbimento di massa in tempo reale, e può essere utilizzato come indicatore per il processo di auto-assemblaggio di proteine ​​e di accoppiamento molecole funzionali su reticoli proteine ​​19,20,42,46-48. Inoltre, le misure QCM-D aperta la possibilità di studiare processi di interazione del metallo con lo strato proteico in condizioni biologiche naturali. In un recente studio, l&#39;interazione della proteina S-strato con metalli scelti come Eu (III), Au (III), Pd (II) e Pt (II) è stato studiato con QCM-D 19,20. Lo strato proteina adsorbita può servire come un modello semplificato di una parete cellulare di batteri gram-positivi. Lo studio di questo singolo componente può contribuire a una più profonda comprensione delle interazioni metallo. Tuttavia, esclusivamente QCM-D esperimenti non consentono dichiarazioni riguardanti strutture superficiali e le influenze dei metalli alle proteine. Altre tecniche sono necessarie per ottenere tali informazioni. Una posbilità per immagini bio-nanostrutture e informazioni sulle proprietà strutturali ottenere è la microscopia a forza atomica (AFM). L&#39;obiettivo dello studio presentato era studiare l&#39;assorbimento di oro (Au (III) e Au (0) -NPs) alle proteine ​​S-strato, in particolare SLP1 di L. sphaericus JG-B53. Gli esperimenti sono stati fatti con proteine ​​sospesi su scala batch in un intervallo di pH di 2,0 - 5,0 mediante ICP-MS e con immobilizzati S livelli utilizzando QCM-D. Inoltre, l&#39;influenza della soluzione di sale di metallo sulla stabilità lattice è stata studiata con successivi studi AFM. La combinazione di queste tecniche contribuisce a una migliore comprensione dei processi di interazione in vitro in metallo come strumento per saperne di più su eventi in cellule batteriche intere riguardanti affinità metalliche specifiche vincolanti. Questa conoscenza non è solo cruciale per lo sviluppo di materiali filtranti applicabili per il recupero di metalli per la tutela dell&#39;ambiente e la conservazione del reFonti 49, ma anche per lo sviluppo di array di NP metalliche altamente ordinati per varie applicazioni tecniche.

<table><tbody><tr><td>equiment e software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreattore, sistema pilota a vapore in loco 70L</td><td>Applikon Biotechnology, Paesi Bassi</td><td>Z6X</td><td>inclusi dO2, sensori di pH di Applikon Biotechnology e software BioXpert V2</td></tr><tr><td>Monitor di biomassa non invasiva BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), USA</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>Spectrometer Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Gran Bretagna</td><td>80-2109-10</td><td>Azienda ora GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>MiniStar VWR, Germania</td><td>521-2844</td><td>Per la centrifugazione di campioni di coltivazione</td></tr><tr><td>Microscopio per sistemi di ricerca BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Germania</td><td>037006</td><td>Microscopio in combinazione con il software di imaging</td></tr><tr><td>Cell^P (versione 3.1)</td><td>Olympus Soft Imaging Solutions LLC, M&uuml; nster, Germania---</td><td></td><td>insieme al microscopio</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Florida, USA</td><td>9010PLT</td><td>Per la raccolta di biomassa</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Germania</td><td>431-2601</td><td>Per la rimozione dei flagelli e l'omogeneizzazione dei campioni</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>728411</td><td>Utilizzato nell'isolamento delle proteine Processore</td></tr><tr><td>mobile di fluidi ad alto taglio, M-110EH-30 Pilot</td><td>Microfluidics, Massachusetts, USA</td><td>M110EH30K</td><td>Utilizzato per la rottura cellulare</td></tr><tr><td>Alpha 1-4 LSC Liofilizzatore</td><td>Martin Christ Liofilizzatori LLC, Osterode, Germania</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spettrofotometria 102041---UV-VIS (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>Per la determinazione delle proteine camera</td></tr> per <tr><td>elettroforesi verticale Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Monaco di Baviera, Germania</td><td>165-3322</td><td>Per SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Imaging System 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Monaco di Baviera, Germania</td><td>1708030</td><td>Utilizzato per l'imaging di gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), USA</td><td>N8120536</td><td>Per la determinazione della concentrazione</td></tr> <tr><td>di metalliZetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire, Regno Unito</td><td>ZEN3600</td><td>Per la determinazione della dimensione delle nanoparticelle</td></tr><tr><td>del dispositivo Q-Sense E4</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Svezia</td><td>QS-E4</td><td>ordinato tramite LOT quantum design (software incluso con la piattaforma E4)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (registrazione dati)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Svezia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (valutazione e modellazione dei dati)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Svezia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D moduli di flusso QFM&nbsp; 401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Svezia</td><td>QS-QFM401</td><td>ordinato tramite LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp; 303 SiO2 sensori piezoelettrici al quarzo AT-cut</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Svezia</td><td>QS-QSX303</td><td>ordinato tramite LOT quantum design</td></tr><tr><td>Camera di pulizia dell'ozono</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA</td><td>QS-ESA006</td><td>ordinata tramite LOT quantum</td></tr><tr><td>design Microscopio a forza atomica MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>MFP-3DBio AFM</td><td>misure e software di imaging</td></tr><tr><td>Software AFM per la ricerca sull'asilo AR Versione 120804+1223</td><td>Ricerca sull'asilo, Santa Barbara (CA), USA</td><td></td>---<td>software di imaging incluso nella Cat. No. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Versione Pro 6.3.2.3 Software</td><td>WaveMetrics, Inc., USA</td><td></td>---<td>software di imaging incluso in Cat. No. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>Bioheater</td><td>Riscaldatore campione per misurazioni AFM</td></tr><tr><td>Biolever mini cantilever,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Germania LLC, Germania</td><td>&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Cantilever preferito per le misurazioni AFM</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L., Spagna</td> Software <td>freeware</td><td>per l'analisi AFM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Detergenti e altri equipaggiamenti </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acido acido, 100 %, p.a.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>Pericolo, liquidi e vapori infiammabili e corrosivi. Provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi.</td></tr><tr><td>Antischiuma 204</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>A6426</td><td>Per la soppressione della schiuma</td></tr><tr><td>bromofenolo blu, sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>Coomassie Blu brillante R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi II dalla milza suina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>D4138</td><td>Tipo IV , 2.000 - 6.000&nbsp; Kunitz unità/mg proteina</td></tr><tr><td>Etanolo, 95%</td><td>VWR, Germania</td><td>20827.467</td> Pericolo, glicerina <td>infiammabile</td></tr><tr><td>, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Cloridrato di guanidina (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>Pericolo; Corrosivo, utilizzato per la regolazione del pH</td></tr><tr><td>Lisozima dall'albume d'uovo di gallina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>Polvere liofilizzata, proteine = 90 %, = 40.000 unità/mg di proteine (Sigma)&nbsp;</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico con riscaldamento,&nbsp; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germania</td><td>504.10100.00</td><td>Agitatore standard nell'ambito dell'esperimento</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>Acido nitrico (HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>Pericolo; Ossidante, corrosivo</td></tr><tr><td>PageRuler Scala proteica non colorata</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>243051</td><td>Mw medio ~70.000</td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI), ramificata</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>Avvertimento; Nocivo, irritante, pericoloso per l'ambiente; Mw medio ~25.000</td></tr><tr><td>Carbonato di potassio anidro (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>Avvertimento; Ribonucleasi A dannosa</td></tr><tr><td>dal pancreas bovino&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>R5503</td><td>Tipo I-AS, 50 - 100 unità Kunitz/mg di proteina</td></tr><tr><td>Sodio azide (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>Pericolo; molto tossico e pericoloso per l'ambiente</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L-5750</td><td>Pericolo; tossico</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>Pericolo; Corrosivo, utilizzato per la regolazione del pH all'interno della coltivazione e la regolazione del pH</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, membrana per dialisi, MWCO 50.000&nbsp;</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Acido solforico (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>Pericolo; Corrosivo, utilizzato per la regolazione del pH all'interno della coltivazione</td></tr><tr><td>Acido tannico (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>Avvertenza; Nocivo, Pericoloso per l'ambiente</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Tubi per ultrafiltrazione</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>Pericolo, tossico</td></tr></tbody></table>

au-interazione di slp1 polimeri e monostrato da<em&gt; lysinibacillus sphaericus</em&gt; jg-b53 - qcm-d, icp-ms e afm come strumenti di studi biomolecule metallo

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In questa pubblicazione viene descritto il comportamento di assorbimento dell'oro delle proteine dello strato superficiale (S-layer) (Slp1) di Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Queste biomolecole si dispongono in matrici bidimensionali paracristalline sulle superfici, legano i metalli e sono quindi interessanti per diverse applicazioni biotecnologiche, come i materiali bioassorbenti per la rimozione o il recupero di diversi elementi dall'ambiente e dai processi industriali. La deposizione di nanoparticelle di Au(0) su strati S, sia mediante sintesi diretta dello strato S 1 che adsorbimento di nanoparticelle, apre nuove possibilità per diverse applicazioni sensoriali. Sebbene numerosi studi abbiano descritto le proprietà di bioassorbimento degli strati S 2-5, una comprensione più approfondita dell'interazione proteina-proteina e proteina-metallo rimane ancora impegnativa. Nello studio seguente, la spettrometria di massa accoppiata induttivamente (ICP-MS) è stata utilizzata per il rilevamento dell'assorbimento di metalli da parte di strati S sospesi. Ciò è stato correlato alle misurazioni della microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D), che consente il rilevamento online della formazione di monostrati proteici e della deposizione di metalli e, quindi, una comprensione più dettagliata del legame dei metalli.
I risultati dell'ICP-MS hanno indicato che il legame di Au(III) ai polimeri dello strato S sospeso dipende dal pH. Il massimo legame di Au(III) è stato ottenuto a pH 4,0. Le indagini QCM-D hanno permesso di rilevare l'assorbimento di Au(III) e la deposizione di Au(0)-NP in tempo reale durante gli esperimenti in situ. Inoltre, questo metodo ha permesso di studiare l'influenza del legame metallico sulla stabilità del reticolo proteico di Slp1. Le proprietà strutturali e la stabilità dello strato proteico possono essere visualizzate direttamente dopo l'esperimento QCM-D utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). In conclusione, la combinazione di questi diversi metodi fornisce una comprensione più approfondita del legame del metallo da parte delle proteine batteriche dello strato S in sospensione o come monostrati su cellule batteriche o superfici ricristallizzate.

Coltivazione di microrganismi e SLP1 Caratterizzazione I dati registrati di crescita batterica indica la fine della fase di crescita esponenziale a circa 5 ore. Studi precedenti hanno dimostrato che SLP1 può essere isolato da questo punto di raccolta (4,36 g / L biomassa umida (≈ 1,45 g / L (BDW)) con una resa massima 19. Tuttavia, l&#39;ottimizzazione della coltivazione utilizzando componenti o sup...

Per ottenere informazioni di base sull'assorbimento e il riciclaggio dell'oro dai sistemi acquosi, è stata studiata l'interazione delle nanoparticelle Au(III) e Au(0) sulle proteine dello strato S. L'assorbimento dei polimeri proteici è stato studiato mediante ICP-MS e quello dei monostrati proteici mediante QCM-D. Il successivo AFM consente l'imaging delle nanostrutture.

Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS e AFM come strumenti di studi Biomolecule metallo

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare il comportamento di sorzione dell'oro mediato dalle proteine S-layer del ceppo batterico presentato, da un punto di vista ecologico e tecnologico. Questi metodi possono rispondere a domande fondamentali nella scienza ambientale, in settori quali i processi di sorzione e la rimozione e recupero di metalli. Il principale vantaggio di queste tecniche è che permettono di rilevare la sorzione di metalli e l'adsorbimento di nanoparticelle in un diverso intervallo di scala.Utilizzando il QCM-D è possibile rilevare ciò mediante una misurazione in tempo reale. Per iniziare questa procedura, equipaggiare le celle fluide con sensori fittizi. Pompare almeno 20 millilitri per modulo di un agente pulente liquido al 2% in acqua ultrapura attraverso il sistema QCM-D e i tubi.Successivamente, pompare un volume pari a cinque volte il volume del modulo di acqua ultrapura attraverso il sistema, con un flusso fino a 300 microlitri al minuto per modulo, seguendo il protocollo del produttore. Pulire i sensori in biossido di silicio esterni ai moduli di flusso mediante incubazione in una soluzione al 2% di dodecilsolfato di sodio per almeno 20 minuti. Successivamente, risciacquare i sensori più volte con acqua ultrapura.Dopo aver asciugato i cristalli con aria compressa filtrata, posizionarli in una camera di pulizia all'ozono per 20 minuti. Successivamente, ripetere la procedura di pulizia due volte per rimuovere tutti i contenuti organici. Per rimuovere i metalli legati dalla superficie del sensore, sciacquare i sensori con acido nitrico uno molare.Quindi risciacquare i sensori più volte con acqua ultrapura. Successivamente, modificare i sensori con strati alternati di polietilenimina e polistirene solfonato a tre grammi per litro mediante rivestimento per immersione, utilizzando la tecnica layer-by-layer o LBL. Posizionare i sensori all'interno della soluzione di polielettrolita appropriata in piastre con pozzetti profondi e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere i sensori dalla soluzione di polielettrolita e risciacquarli accuratamente con acqua ultrapura tra ogni passaggio di rivestimento per immersione. Una volta completata la modifica esterna, posizionare i sensori all'interno del modulo di flusso. Equilibrare i sensori risciacquandoli con acqua ultrapura prima di iniziare gli esperimenti.A questo punto, sciogliere l'Slp1 precedentemente isolato e purificato nella formula di urea per convertire i polimeri in monomeri. Centrifugare le proteine monomerizzate a 15.000 ×g e 4 gradi Celsius per un'ora per rimuovere gli agglomerati proteici più grandi. Mescolare il surnatante di Slp1 solubilizzato e centrifugato con il buffer di ricristallizzazione fino a raggiungere una concentrazione proteica finale di 0,2 grammi per litro.Dopo una corretta ricristallizzazione della proteina sulla superficie dei sensori modificati con polielettroliti all'interno dei moduli a flusso, risciacquare i sensori rivestiti con tampone di ricristallizzazione in modo intenso a una portata di 125 microlitri al minuto fino al rilevamento di valori stabili di frequenza e variazioni di dissipazione. Dopo un efficace rivestimento con Slp1 nei moduli a flusso, risciacquare il livello ottenuto di Slp1 in modo intenso con tampone citrato 1,6 millimolare a pH 5,0 fino al rilevamento di valori stabili di frequenza e variazioni di dissipazione. Successivamente, inviare ai moduli a flusso una soluzione di nanoparticelle precedentemente preparata a concentrazione di un millimolare con una portata di 125 microlitri al minuto.Quindi, monitorare l'adsorbimento di massa sullo strato di Slp1. Al termine dell'interazione con le nanoparticelle metalliche, risciacquare lo strato con un tampone privo di nanoparticelle per rimuovere i metalli o le nanoparticelle debolmente legati. Utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM) abbinato a un microscopio ottico capovolto, acquisire immagini in ambiente liquido impiegando acqua ultrapura direttamente sui sensori QCM-D rivestiti.Sciacquare i sensori con acqua ultrapura dopo gli esperimenti con QCM-D e posizionarli all'interno della cella fluida dell'AFM. Utilizzare una mensola con una frequenza di risonanza di circa 25 chilohertz in acqua e una rigidità inferiore a 0,1 newton per metro. Regolare la velocità di scansione tra 2,5 e 10 micrometri al secondo.Acquisire immagini in modalità a contatto dinamico mentre il cantilever viene eccitato da un piezoelettrico alla sua frequenza di risonanza. Infine, determinare la distanza tra il cantilever e la superficie mediante l'attenuazione dell'oscillazione. Le capacità massime di legame con metalli dell'oro tre da Slp1 sospeso mostrano che era legato in modo stabile durante l'incubazione di 24 ore nell'intervallo di pH esaminato.La diminuzione immediata della frequenza indica un'adsorbimento rapido e un'elevata affinità delle proteine verso la superficie modificata con polielettrolita. Anche la dissipazione aumenta immediatamente, il che indica l'adsorbimento di molecole viscoelastiche sulla superficie a causa di un rapido smorzamento che porta a valori crescenti di dissipazione. Nanoparticelle d'oro pre-sintetizzate sono state incubate con Slp1 e analizzate mediante SDS-PAGE, confermando i dati ottenuti con QCM-D e dimostrando che le nanoparticelle non alterano la struttura di Slp1.Viene mostrata l'adsorbimento di nanoparticelle di oro metallico allo stato zero pre-sintetizzate in esperimenti QCM-D mediante grafici delta F-delta D e come profili di spessore e massa. Viene qui mostrato il reticolo proteico di Slp1 ricristallizzato su sensori modificati con polielettroliti. La costante di reticolo è stata determinata in 13-14 nanometri e lo spessore dello strato è risultato di 10 ± 2 nanometri.Gli studi mediante AFM hanno verificato che, dopo l'interazione con l'oro tre, il reticolo Slp1 è rimasto completamente intatto, confermando i risultati ottenuti con QCM-D che avevano predetto la stabilità del rivestimento. L'AFM conferma l'adsorbimento di nanoparticelle di oro zero sul reticolo Slp1, ma a causa delle dimensioni delle particelle, queste non seguono la simmetria p4 di Slp1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro una giornata lavorativa, se effettuata correttamente.Seguendo questi metodi, è possibile eseguire altre tecniche come la spettroscopia infrarossa o la microscopia a ioni di elio per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sui siti specifici di legame o sull'interazione con l'oro o con nanoparticelle d'oro. La tecnica presentata ha aperto la strada allo studio delle interazioni tra biomolecole e metalli da parte dello uzrachem, e per esempio sul comportamento di adsorbimento e desorbimento su diversi tipi di superfici. Dopo aver visto questo video, ora dovreste avere una buona comprensione di come indagare le interazioni tra metalli e solventi biologici; quando utilizzerete questo metodo, ricordatevi di usare occhiali protettivi, camice da laboratorio e naturalmente anche guanti.

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