Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS e AFM come strumenti di studi Biomolecule metallo

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di studiare il comportamento di assorbimento dell'oro da parte delle proteine dello strato S del ceppo batterico presentato da un punto di vista ecologico e tecnologico. Questi metodi possono rispondere a domande chiave nelle scienze ambientali in tali campi dei processi di assorbimento e della rimozione e recupero dei metalli. Il vantaggio principale di queste tecniche è che è possibile rilevare l'adsorbimento di metalli e l'adsorbimento di nanoparticelle in un altro intervallo di scala.

Utilizzando QCM-D è possibile rilevarlo in una misurazione in tempo reale. Per iniziare questa procedura, dotare le celle del fluido di manichini per sensori. Pompare almeno 20 millilitri per modulo di un detergente liquido alcalino al 2% in acqua ultrapura attraverso il QCM-D e il sistema di tubi.

Successivamente, pompare un volume cinque volte per modulo di acqua ultrapura attraverso il sistema con una portata fino a 300 microlitri al minuto secondo il protocollo del produttore. Pulire i sensori di biossido di silicio all'esterno dei moduli di flusso mediante incubazione in una soluzione di dodecil solfato di sodio al 2% per almeno 20 minuti. Quindi, sciacquare più volte i sensori con acqua ultrapura.

Dopo aver asciugato i cristalli con aria compressa filtrata, metterli in una camera di pulizia all'ozono per 20 minuti. Successivamente, ripetere la procedura di pulizia due volte per rimuovere tutto il contenuto organico. Per rimuovere i metalli legati dalla superficie del sensore, sciacquare i sensori con un molare di acido nitrico.

Quindi sciacquare più volte i sensori con acqua ultrapura. Successivamente, modificare i sensori con tre grammi per litro di strati alternati di polietilenimmina e polistirene solfonato tramite rivestimento a immersione utilizzando la tecnica strato per strato o LBL. Posizionare i sensori all'interno della soluzione polielettrolitica appropriata in piastre a pozzetti profondi e incubarle per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, rimuovere i sensori dalla soluzione polielettrolitica e sciacquarli intensamente tra ogni fase del rivestimento di immersione con acqua ultrapura. Una volta completata la modifica esterna, posizionare i sensori all'interno del modulo di flusso. Equilibrare i sensori sciacquandoli con acqua ultrapura prima di iniziare gli esperimenti.

A questo punto, sciogliere Slp1 precedentemente isolato e purificato in formula urea per convertire i polimeri in monomeri. Centrifugare le proteine monomerizzate a 15.000 volte g e 4 gradi Celsius per un'ora per rimuovere gli agglomerati proteici più grandi. Miscelare il surnatante Slp1 solubilizzato e centrifugato con il tampone di ricristallizzazione fino a una concentrazione proteica finale di 0,2 grammi per litro.

Dopo aver ricristallizzato con successo le proteine sopra i sensori modificati con polielettrolita all'interno dei moduli di flusso, sciacquare intensamente i sensori rivestiti con un tampone di ricristallizzazione con una portata di 125 microlitri al minuto fino a quando non vengono rilevati valori stabili di variazione di frequenza e dissipazione. Dopo il rivestimento di Slp1 nei moduli di flusso, sciacquare intensamente lo strato di Slp1 ottenuto con tampone citrato citrato da 1,6 millimolari pH 5,0 fino a quando non vengono rilevati valori stabili di frequenza e variazioni di dissipazione. Successivamente, pompare una soluzione di nanoparticelle millimolari precedentemente preparata nei moduli di flusso con una portata di 125 microlitri al minuto.

Quindi, tracciare l'adsorbimento di massa sullo strato Slp1. Dopo aver completato l'interazione con nanoparticelle metalliche, sciacquare lo strato con un tampone privo di nanoparticelle per rimuovere i metalli o le nanoparticelle deboli legate. Utilizzando un microscopio a forza atomica o un AFM con un microscopio ottico invertito, è possibile registrare immagini in liquido utilizzando acqua ultrapura direttamente sui sensori QCM-D rivestiti.

Sciacquare i sensori con acqua ultrapura dopo gli esperimenti QCM-D e posizionarli all'interno della cella fluida AFM. Utilizzare un cantilever con una frequenza di risonanza di circa 25 kilohertz in acqua e una rigidità inferiore a 0,1 newton per metro. Regolare la velocità di scansione tra 2,5 e 10 micrometri al secondo.

Scatta immagini in modalità di contatto dinamico mentre il cantilever è eccitato da un piezo alla sua frequenza di risonanza. Infine, determinare la distanza del cantilever dalla superficie mediante lo smorzamento dell'oscillazione. Le capacità massime di legame del metallo dell'oro tre mediante Slp1 sospeso mostrano che è stato legato stabilmente durante l'incubazione di 24 ore all'interno dell'intervallo di pH studiato.

L'immediata diminuzione della frequenza indica un rapido adsorbimento e un'elevata affinità delle proteine alla superficie modificata dal polielettrolita. Anche la dissipazione aumenta immediatamente, il che indica un adsorbimento di molecole viscoelastiche sulla superficie a causa del rapido smorzamento con conseguente aumento dei valori di dissipazione. Le nanoparticelle d'oro zero presintetizzate sono state incubate con Slp1 e analizzate da SDS-PAGE che ha verificato i dati QCM-D dimostrando che le nanoparticelle non disturbano la struttura di Slp1.

L'adsorbimento di nanoparticelle zero di oro metallico presintetizzato è mostrato per esperimenti QCM-D in grafici delta F-delta D e come profili di spessore e massa. Il reticolo proteico di Slp1 ricristallizzato su sensori modificati con polielettrolita è mostrato qui. La costante del reticolo è stata determinata da 13 a 14 nanometri e lo spessore dello strato è risultato essere di 10 più o meno due nanometri.

Gli studi AFM hanno verificato che dopo l'interazione dell'oro tre il reticolo Slp1 è rimasto completamente intatto, il che conferma i risultati QCM-D che hanno previsto la stabilità del rivestimento. L'AFM verifica l'adsorbimento di nanoparticelle d'oro zero sul reticolo di Slp1 ma, a causa della dimensione delle particelle, non seguono la simmetria p4 di Slp1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro un giorno lavorativo se viene eseguita correttamente.

Seguendo questi metodi, è possibile eseguire altre tecniche come la spettroscopia a infrarossi o la microscopia a ioni elio per rispondere a ulteriori domande come specifici mirini di legame o interazione con oro o nanoparticelle d'oro. La tecnica presentata ha spianato la strada all'uzrachem per studiare le interazioni delle biomolecole con i metalli e, ad esempio, il comportamento di adsorbimento e disorbimento su diversi tipi di superfici. Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come studiare le interazioni dei metalli con i solventi biologici e per favore quando usi questo metodo non dimenticare di usare occhiali, camice da laboratorio e, naturalmente, anche guanti.