Quantitative Fundus autofluorescenza per la valutazione delle patologie retiniche

L'obiettivo generale dell'autofluorescenza quantitativa, o qAF, è valutare il livello complessivo di lipofuscina nelle cellule di supporto della retina, l'epitelio pigmentato retinico o RPE, sia negli occhi sani che in quelli malati. Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia delle cellule retiniche, come ad esempio il modo in cui la salute dell'epitelio pigmentato retinico interagisce con lo sviluppo della degenerazione maculare legata all'età, o AMD. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la determinazione dei livelli assoluti di autofluorescenza della lipofuscina nel fondo oculare, e quindi il follow-up quantitativo e riproducibile tra i pazienti, tra le sessioni di imaging dei pazienti e in ampie popolazioni di studio.

Prima dell'imaging, impostare in modo appropriato l'ofcromatoscopia laser a scansione confocale, o CSLO, per l'acquisizione dei dati secondo le istruzioni del produttore. Per montare un riferimento fluorescente interno, acquistato dal produttore, ruotare l'obiettivo per rimuoverlo, svitare l'anello metallico della macchina e sostituirlo con il nuovo anello metallico contenente il riferimento. È essenziale che le pupille siano dilatate ad almeno 6 mm per un passaggio ininterrotto della luce.

Con lo 0,5% di tropicamide e il 2,5% di fenilefrina, dilata le pupille del paziente di almeno 6 mm, il che è essenziale per il passaggio ininterrotto della luce per vedere e misurare il fondo oculare. Posizionare correttamente il paziente sul CSLO con il mento appoggiato sulla mentoniera, la fronte appoggiata contro il poggiafronte e i canti laterali correttamente allineati con gli indicatori. Per acquisire le immagini di base, è necessario acquisire prima un'immagine del fondo oculare con la riflettanza nel vicino infrarosso, o luce IR, al fine di centralizzare la telecamera sulla macula e ottenere una messa a fuoco approssimativa.

Con il paziente posizionato correttamente, impostare l'hardware sul pannello di controllo in modalità di imaging IR, posizionare manualmente la telecamera fino a quando il fondo oculare non è completamente a fuoco e scattare un'immagine. Regolare l'impostazione sul pannello di controllo su IROCT, che utilizza la tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale, o SDOCT, in combinazione con l'imaging IR, per valutare la macula per la malattia sottostante. Utilizzare le guide presenti nella finestra di imaging per orientare correttamente l'OCT rispetto all'immagine IR del fondo oculare.

Per ottenere una qualità SDOCT ottimale, posizionare la fotocamera in modo che l'immagine OCT si trovi nel terzo superiore della finestra di imaging. Acquisisci almeno una scansione a linee orizzontali attraverso la fovea e che copre l'intero campo di imaging. Per impostare l'imaging qAF, utilizzare l'acquisizione di immagini ad alta velocità, che riduce il rischio di perdita di segnale dovuta al movimento del paziente e il blocco della luce da parte dell'iride o delle palpebre.

Usa la media di 9 fotogrammi, che acquisisce rapidamente e in sequenza nove fotogrammi dell'immagine che vengono poi mediati per ridurre il rumore e gli artefatti. Scegliere un campo di 30 x 30 gradi, che si riferisce ai gradi di area retinica catturati durante l'acquisizione dell'immagine. Dopo aver avvertito il paziente della luce blu, attivare la modalità AF e allineare l'asse della fotocamera in modo che lo schermo sia riempito al massimo di fundus AF, con un oscuramento minimo dei lati e degli angoli dell'immagine.

Se i pazienti hanno difficoltà a tollerare la luce blu intensa, allontanare la telecamera dall'occhio per avviare l'imaging e portare lentamente la telecamera verso il paziente fino a quando il fondo oculare non è completamente visibile. Manualmente o con il joystick dell'otturatore, regolare l'allineamento della fotocamera spostando il CSLO per riposizionare la fotocamera in modo che il segnale AF sia al massimo livello in tutto il campo, piuttosto che ottenere l'immagine più nitida. Durante l'acquisizione dell'immagine, i pixel colorati visibili nel riferimento interno o nel fondo oculare indicano una saturazione eccessiva e quindi una perdita di segnale.

Esporre completamente la retina alla luce AF per almeno 20 secondi per ridurre al minimo l'assorbimento della luce da parte della rodopsina nella retina sensoriale durante l'imaging. Utilizzare questo periodo per ottimizzare l'allineamento, la messa a fuoco e la sensibilità della fotocamera. Fai sbattere le palpebre ai soggetti prima di ogni acquisizione di immagini, poiché una nuova pellicola lacrimale migliora la qualità del segnale.

Evitare le palpebre nel piano di acquisizione e scattare l'immagine. È importante generare almeno due immagini di alta qualità per sessione di imaging per l'analisi dei dati. Esegui la post-elaborazione delle immagini utilizzando il software CSLO per calcolare la media dello stack di nove fotogrammi, per aumentare il rapporto segnale/rumore.

Eseguire l'analisi delle immagini secondo il protocollo di testo. Come mostrato qui, in occhi sani, la FA emessa dall'RPE è distribuita in modo relativamente uniforme in tutto il fondo oculare. L'intensità ridotta si osserva nella regione maculare centrale a causa del blocco della luce da parte del pigmento maculare, e ai lati e agli angoli a causa dell'ottica dell'occhio e della fotocamera.

I vasi devono essere scuri e ben a fuoco. Questa figura rappresenta una corrispondente presentazione della mappa di calore dei livelli di qAF da questa figura. I colori più freddi corrispondono alle aree di intensità AF inferiore, mentre i colori più caldi corrispondono alle aree di intensità AF più elevata.

L'intensità massima è generalmente osservata nel secondo anello concentrico a otto segmenti e le intensità medie in quest'area sono utilizzate per la maggior parte dell'analisi dei dati. Qui è mostrata un'analisi rappresentativa dell'occhio con AMD, che dimostra l'atrofia geografica, una forma avanzata di AMD. Questa forma di AMD provoca aree localizzate di perdita di RPE, evidenziata da FA marcatamente ridotta o assente, e provoca una progressiva perdita della visione centrale.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare attentamente i pazienti candidati e di ottenere immagini di alta qualità in modo riproducibile per massimizzare la qualità dei dati. L'uso di questa procedura può consentire il follow-up longitudinale della salute della retina per determinare il progresso delle degenerazioni retiniche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia per seguire e analizzare le degenerazioni retiniche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'autofluorescenza quantitativa per valutare i tuoi pazienti con degenerazioni retiniche. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.