Quantitative Fundus autofluorescenza per la valutazione delle patologie retiniche

L'obiettivo generale della fluoroscenza autofluorescente quantitativa, o qAF, è valutare il livello complessivo di lipofuscina nelle cellule di supporto della retina, l'epitelio pigmentato retinico, o RPE, sia negli occhi sani che in quelli malati. Questa tecnica può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia cellulare della retina, ad esempio in che modo lo stato di salute dell'epitelio pigmentato retinico interagisce con lo sviluppo della degenerazione maculare legata all'età, o AMD. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di determinare livelli assoluti di autofluorescenza della lipofuscina nel fondo oculare, permettendo quindi un follow-up quantitativo e riproducibile tra pazienti, tra diverse sessioni di imaging dello stesso paziente e all'interno di ampie popolazioni studiate.

Prima dell'acquisizione delle immagini, configurare correttamente la microscopia a scansione confocale con laser ophtalmoscopico, o CSLO, per l'acquisizione dei dati seguendo le istruzioni del produttore. Per montare un riferimento fluorescente interno, acquistato dal produttore, ruotare l'obiettivo per rimuoverlo, svitare l'anello metallico della macchina e sostituirlo con il nuovo anello metallico contenente il riferimento. È essenziale che le pupille siano dilatate almeno a 6 mm per consentire un passaggio ininterrotto della luce.

Con tropicamide allo 0,5% e fenilefrina al 2,5%, dilatare le pupille del paziente fino a un diametro di almeno 6 mm, condizione essenziale per consentire un passaggio ininterrotto della luce necessario per visualizzare e misurare il fondo oculare. Posizionare correttamente il paziente sul CSLO con il mento appoggiato sul sostegno per il mento, la fronte contro l’appoggio frontale e i cantus laterali allineati correttamente con gli indicatori. Per acquisire le immagini di base, iniziare con l’imaging del fondo oculare mediante riflettanza nell’infrarosso vicino, o luce IR, al fine di centrare la telecamera sulla macula e ottenere una messa a fuoco approssimativa.

Una volta posizionato correttamente il paziente, impostare l'apparecchiatura sul pannello di controllo sulla modalità di imaging IR, posizionare manualmente la telecamera finché il fondo oculare non è perfettamente a fuoco ed acquisire un'immagine. Regolare l'impostazione sul pannello di controllo su IROCT, che utilizza la tomografia a coerenza ottica a dominio spettrale, o SDOCT, in combinazione con l'imaging IR, per valutare la macula alla ricerca di patologie sottostanti. Utilizzare le guide presenti nella finestra di imaging per orientare correttamente l'OCT rispetto all'immagine IR del fondo oculare.

Per ottenere una qualità ottimale di SDOCT, posizionare la telecamera in modo che l'immagine OCT si trovi nel terzo superiore della finestra di acquisizione. Acquisire almeno una scansione lineare orizzontale attraverso la fovea, estesa a tutto il campo di imaging. Per impostare l'imaging qAF, utilizzare l'acquisizione di immagini ad alta velocità, che riduce il rischio di perdita di segnale dovuta ai movimenti del paziente e al blocco della luce da parte dell'iride o delle palpebre.

Utilizzare la media di 9 fotogrammi, che acquisisce rapidamente e in sequenza nove immagini che vengono successivamente mediate per ridurre il rumore e gli artefatti. Selezionare un campo di 30 x 30 gradi, che indica i gradi di area retinica acquisiti durante l'acquisizione dell'immagine. Dopo aver avvisato il paziente della luce blu, attivare la modalità AF e allineare l'asse della telecamera in modo che lo schermo sia riempito al massimo dalla autofluorescenza del fondo oculare, con un minimo scurimento dei lati e degli angoli dell'immagine.

Se i pazienti hanno difficoltà a tollerare la luce blu intensa, allontanare la telecamera dall'occhio per iniziare l'acquisizione delle immagini e avvicinarla lentamente al paziente finché il fondo oculare non è completamente visibile. Regolare l'allineamento della telecamera manualmente o tramite il joystick dell'oftalmoscopio, spostando il CSLO in modo da riposizionare la telecamera in modo che il segnale di autofluorescenza (AF) sia al massimo livello in tutto il campo, piuttosto che ottenere l'immagine più nitida possibile. Durante l'acquisizione delle immagini, la presenza di pixel colorati nell'immagine di riferimento interno o nel fondo oculare indica una saturazione eccessiva e, di conseguenza, una perdita di segnale.

Esponi completamente la retina alla luce AF per almeno 20 secondi per ridurre al minimo l'assorbimento della luce dalla rodopsina nella retina sensoriale durante l'acquisizione delle immagini. Utilizza questo periodo per ottimizzare l'allineamento, la messa a fuoco e la sensibilità della telecamera. Chiedi ai soggetti di battere le palpebre prima di ogni acquisizione d'immagine, poiché un film lacrimale fresco migliora la qualità del segnale.

Evitare le palpebre nel piano di acquisizione ed eseguire l'immagine. È importante generare almeno due immagini di alta qualità per ogni sessione di imaging per l'analisi dei dati. Eseguire l'elaborazione post-immagine utilizzando il software CSLO per calcolare la media dello stack di nove fotogrammi, al fine di aumentare il rapporto segnale-rumore.

Eseguire l'analisi delle immagini seguendo il protocollo descritto nel testo. Come mostrato qui, negli occhi sani, la fluorescenza emessa dall'epitelio pigmentato retinico (RPE) è distribuita in modo relativamente uniforme in tutta la regione del fondo oculare. Una ridotta intensità è osservabile nella regione maculare centrale a causa dell'assorbimento della luce da parte del pigmento maculare, e ai lati e agli angoli a causa dell'ottica dell'occhio e della telecamera.

Le strutture vascolari devono essere scure e ben a fuoco. Questa figura rappresenta la presentazione corrispondente sotto forma di mappa termica dei livelli di qAF provenienti da questa figura. I colori più freddi corrispondono a zone con intensità di AF più bassa, mentre i colori più caldi corrispondono a zone con intensità di AF più elevata.

L'intensità massima è generalmente osservata nel secondo anello concentrico composto da otto segmenti, e le intensità medie in quest'area vengono utilizzate per la maggior parte delle analisi dei dati. Qui è mostrata un'analisi rappresentativa dell'occhio con DMAE, che dimostra un'atrofia geografica, una forma avanzata di DMAE. Questa forma di DMAE provoca aree localizzate di perdita dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), evidenziate da una riduzione marcatamente diminuita o assente della fluorescenza autofluorescente (AF), e causa una perdita progressiva della visione centrale.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di selezionare attentamente i pazienti candidati e di ottenere immagini di alta qualità in modo riproducibile per massimizzare la qualità dei dati. L'uso di questa procedura consente un follow-up longitudinale della salute retinica per determinare l'andamento delle degenerazioni retiniche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia per seguire e analizzare le degenerazioni retiniche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'autofluorescenza quantitativa per valutare i tuoi pazienti affetti da degenerazioni retiniche. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.