Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel
12 febbraio 2016
È stata sviluppata un'innovativa tecnica di biofabbricazione per ingegnerizzare costrutti tridimensionali che assomigliano alle caratteristiche architettoniche, ai componenti e alle proprietà meccaniche dei tessuti in vivo. Questa tecnica presenta un materiale sacrificale di nuova concezione, la gomma BSA, che trasferisce caratteristiche spaziali dettagliate, riproducendo le architetture in vivo di un'ampia varietà di tessuti.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di ingegnerizzare scaffold di collagene tridimensionali che possano assomigliare alle caratteristiche architettoniche, alla composizione e alle proprietà meccaniche del tessuto in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale, come le interazioni cellulari ECM, l'influenza delle caratteristiche architettoniche nella creazione di tessuti ingegnerizzati e lo sviluppo di sostituzioni tissutali, tra le altre. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una procedura praticabile per ricapitolare la microgeometria dei canali e dei percorsi di flusso interni con alta fedeltà in un materiale biodegradabile.
A dimostrare la procedura sarà Veronica Rodriguez-Rivera, un'associata post-dottorato nel mio laboratorio. I materiali utilizzati per preparare la gomma BSA devono essere conservati e mantenuti freddi fino al momento dell'uso, in modo che la gomma BSA non si solidifichi prematuramente. Anche la sterilità è molto importante per questa procedura.
Innanzitutto, sterilizzare l'erogatore. In una cappa non per colture cellulari, disporre gli O-ring, la siringa, il tappo, la punta di miscelazione e l'erogatore quattro a uno. Sterilizzare questi materiali con raggi UV per 30 minuti.
Per prima cosa, avvita insieme i due pezzi dello stampo in acciaio inossidabile e fissa il Luer lock. Prima di assemblare l'erogatore, spruzzare le pipette e i reagenti prima di introdurli nella cappa con etanolo al 70%. Per prima cosa collegare il cappuccio della punta al supporto della soluzione.
Quindi, caricare la soluzione BSA al 30% nella camera più grande senza contaminare l'altra camera. Lasciare spazio sufficiente per fissare l'O-ring. Quindi, caricare la camera dell'erogatore più piccola con il tre percento di glutaraldeide e collegare un altro O-ring.
A questo punto, collegare la siringa all'erogatore. Quindi inclinare il gruppo in modo che il tappo sia in alto e sostituire il tappo con un puntale di miscelazione. Quindi picchiettare delicatamente i lati per consentire alle bolle d'aria di viaggiare verso l'alto.
Successivamente, posizionare l'erogatore all'interno di una sacca autoclavata per contenere la soluzione di scarico. Nella sacca, con l'erogatore in posizione verticale, erogare una piccola quantità di soluzione per eliminare tutta l'aria dalla siringa. Rimuovere l'aria è molto importante.
Quindi, rapidamente, collegare il Luer lock dello stampo a Y in acciaio inossidabile alla punta della siringa. Ora, con lo stampo nella mano non dominante, alterna la soluzione di espulsione negli scarichi sinistro e destro dei canali di deflusso. Premere gli scarichi, riempiendo così i vuoti interni con la soluzione.
Quindi, posizionare lo stampo orizzontalmente e iniettarlo con altra soluzione fino a quando non è stata utilizzata metà del volume dell'erogatore. Lo stampo deve ora essere messo in un piatto, avvolto in parafilm e conservato a quattro gradi Celsius per una notte. Questa procedura è scalata a quattro grammi di collagene acidificato.
Tienilo in frigorifero fino al momento dell'uso. Dopo che il collagene è stato pesato, procedere alla sterilizzazione della soluzione mediante radiazioni gamma. In preparazione, preparare una soluzione fresca 0,2 di HEPES normale in acqua.
Quindi trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 millilitri. Regolare il pH a nove utilizzando idrossido di sodio concentrato. Assicurati di sterilizzare il cappuccio con i raggi UV e di sterilizzare in autoclave la pinza, la spatola e il bisturi.
Nella cappa, mescolare 1,5 millilitri della soluzione HEPES con 1,5 millilitri di 10x MEM. Conserva questa miscela con ghiaccio. Inoltre, raffreddare una piastra da 12 pozzetti e una siringa da 20 millilitri nel congelatore per 10 minuti.
Per una maggiore sterilità, spruzzare i tubi e le piastre interessati con etanolo al 70% prima di inserirli nella cappa. Spruzzare la piastra dello stampo e posizionarla nella cappa. Quindi, rimuovere gli stampi in gomma BSA con una pinza.
Quindi, taglia i canali di scarico dallo stampo usando un bisturi. Quindi, agitare brevemente la miscela HEPES-MEM e aggiungere un millilitro al collagene. Quindi, mescolare accuratamente la soluzione con una spatola sterile.
Seguire con un breve vortice e trasferire rapidamente la soluzione nella siringa fredda da 20 millilitri. Ora, mentre fissate la gomma BSA all'interno del pozzetto, erogate metà della soluzione di idrogel di collagene sul fondo del pozzetto. Quindi, utilizzando una pinzetta, posizionare lo stampo in modo che le estremità di afflusso e deflusso della gomma tocchino le pareti del pozzo.
Quindi, coprire lo stampo con idrogel di collagene. Ora, sigillare il pozzetto con parafilm e caricare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius. Attendere un'ora affinché il collagene polimerizzi.
Durante questo periodo, tieni accesa la luce UV nel cappuccio. Inoltre, impostare l'apparato di reticolazione UV per fornire 630.000 microjoule per centimetro quadrato. Ora, spruzza le mani guantate con etanolo al 70% e carica la piastra con gli stampi ricoperti di collagene nel reticolante e avvia il processo di irradiazione.
Dopo l'irradiazione, spruzzare nuovamente i guanti e scaricare la piastra dal reticolante. Quindi, usando una spatola sterile, rimuovi il gel dal pozzo, capovolgilo e reticolazione il fondo dell'idrogel. Dopo il ciclo di reticolazione finale, procedere con la digestione enzimatica.
Per rimuovere la gomma BSA senza disturbare l'impalcatura di collagene, utilizzare una soluzione sterile di tripsina allo 0,25% a pH 7,8 e pressarla attraverso un filtro da 0,20 micron. Trasferire una quantità sufficiente di soluzione di tripsina filtrata in una nuova provetta conica da 50 millilitri. Quindi, trasferire l'idrogel di collagene nel tubo conico che contiene la soluzione enzimatica.
Assicurati che l'idrogel sia completamente coperto con la soluzione. Sigillare il tubo con parafilm e agitarlo delicatamente per circa un minuto. Quindi, incubare la provetta a 30 gradi Celsius e lasciare che la digestione vada avanti per 15-24 ore.
Per le prime quattro ore, rimuovere il tubo ogni 15-30 minuti e agitarlo delicatamente per aiutare a completare la digestione della gomma BSA. Il giorno successivo, la digestione è considerata completa quando non galleggia gomma nella soluzione o non ci sono pezzi di gomma rotti nell'idrogel. Ora, sostituisci la soluzione di tripsina con una soluzione sterile di Mosconas e lascia agitare il tubo a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Successivamente, aspirare la soluzione di Mosconas e ripetere questo passaggio altre due volte per pulire completamente l'impalcatura di collagene. Un ampio numero di test sono stati utilizzati per ottimizzare l'uso della biogomma e descritti in dettaglio nel protocollo di testo. Utilizzando il protocollo ottimizzato e tre pezzi di stampo solidi, gli idrogel di collagene sono stati fabbricati ed esaminati in dettaglio.
Lo stampo a Y necessario è stato realizzato su una macchina Microlution. Lo stampo Y è stato iniettato con il 30% di BSA e il tre percento di glutaraldeide, che ha reagito durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, la gomma BSA è stata fusa con il collagene e riscaldata a 37 gradi Celsius per un'ora.
La gomma è stata digerita con enzimi per 15 ore, il che l'ha indebolita fino al punto di cadere senza intaccare la geometria dell'idrogel di collagene. Il canale di afflusso di quattro millimetri colato dallo stampo è stato misurato con calibri per essere esattamente quattro millimetri nell'idrogel di collagene. Testando la stabilità dello stampo, si è scoperto che dimensioni fino a 300 micron potevano essere progettate in modo affidabile.
Inoltre, gli scaffold sono stati testati per la glutaraldeide residua dopo i lavaggi di Mosconas e non sono stati trovati residui. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare scaffold di collagene 3D con il potenziale di imitare le geometrie in vivo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi che completano questa tecnica, come la creazione di modelli 3D di tessuti in vivo e la fabbricazione di stampi con caratteristiche architettoniche specifiche, per rispondere a ulteriori domande.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare l'interazione tra le caratteristiche architettoniche interne e i componenti della matrice con le cellule in modelli in vitro.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica innovativa di biofabbricazione per l'ingegnerizzazione di impalcature tridimensionali in collagene che imitano le caratteristiche architettoniche e le proprietà meccaniche del tessuto in vivo. Il metodo utilizza un nuovo materiale sacrificabile, il BSA rubber, per riprodurre con precisione la microgeometria di vari tessuti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Biomanipolazione
- Sviluppo di impalcature
Sfondo
- Lo studio affronta la necessità di modelli tissutali realistici nella ricerca.
- Esplora le interazioni tra cellule e matrice extracellulare e la loro importanza nei tessuti ingegnerizzati.
- La tecnica mira a migliorare la fedeltà delle sostituzioni tissutali.
- Mantenere la sterilità e un corretto stoccaggio dei materiali è fondamentale per il successo.
Scopo dello studio
- Progettare scaffold che assomiglino strettamente ai tessuti in vivo.
- Studiare l'influenza delle caratteristiche architettoniche sull'ingegneria tissutale.
- Sviluppare un metodo affidabile per la creazione di scaffold biodegradabili.
Metodi Utilizzati
- Preparazione della gomma di BSA in condizioni controllate.
- Utilizzo di un materiale sacrificabile per il trasferimento dettagliato di caratteristiche spaziali.
- Dimostrazione della procedura da parte di un associato post-dottorato esperto.
- Garanzia di sterilità e corretto stoccaggio dei materiali.
Risultati principali
- La tecnica replica con successo la microgeometria dei tessuti.
- È stata raggiunta un'elevata fedeltà nella creazione di canali interni per il flusso.
- I risultati indicano possibili applicazioni nell'ingegneria tissutale e nelle protesi.
- Ha dimostrato l'importanza della manipolazione dei materiali nel processo.
Conclusioni
- Questo metodo offre un approccio praticabile per affrontare le sfide dell'ingegneria tissutale.
- Migliora la comprensione delle interazioni della matrice extracellulare nei tessuti ingegnerizzati.
- I risultati potrebbero portare a progressi nelle tecnologie di sostituzione dei tessuti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica di biofabbricazione consente una riproduzione precisa della microarchitettura dei tessuti in idrogeli di collagene, affrontando una lacuna critica nella fedeltà dei modelli preclinici. Fornendo un metodo scalabile per ingegnerizzare canali definiti su scala microscopica e macroscopica, supporta la riduzione del rischio meccanicistica nello sviluppo di terapie mirate ai tessuti. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva nella valutazione delle interazioni farmaco-tessuto all'interno di ambienti tridimensionali fisiologicamente rilevanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di come le caratteristiche architettoniche influenzino le interazioni tra ECM e cellule e l'attivazione dei percorsi in sistemi rilevanti per le malattie.
- Valore operativo: Fornisce geometrie di impalcature riproducibili per saggi di convalida degli obiettivi coerenti tra diversi lotti sperimentali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera scaffold di collagene standardizzati con dimensioni dei canali quantificabili per schermate affidabili di composti in ambienti biomimetici.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi mediante modellazione sacrificale, riducendo la variabilità nei modelli di tessuto di tipo microfluidico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita lo studio dei fenomeni di perfusione e trasporto in scaffold che imitano l'architettura tissutale in vivo, migliorando la rilevanza traslazionale dei biomarcatori.
- Valore operativo: Permette una continuità preclinica creando scaffold con geometrie definite, adatti a studi longitudinali sulla maturazione dei tessuti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo impalcature regolabili e biodegradabili che fungono da ponte tra modelli semplici in 2D e organoidi complessi, sostenendo la validazione degli obiettivi guidata da ipotesi.
- Biologia della Scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico consentendo test controllati su come l'architettura dello scaffold moduli le risposte cellulari ai candidati terapeutici.
- Screening: Fornisce idrogeli riproducibili e definiti a livello architettonico per la valutazione quantitativa della penetrazione dei composti e del legame al bersaglio.
- Analisi: Consente misurazioni precise delle dimensioni dei canali (ad esempio, 3 mm e 4 mm) e dell'integrità strutturale fino a 300 micrometri, fornendo letture morfometriche oggettive.
- Ricerca Translazionale: Si allinea alla continuità preclinica generando scaffold le cui caratteristiche architettoniche possono essere correlate con esiti funzionali del tessuto.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma in grado di generare modelli di tessuto standardizzati in diversi progetti mediante stampi progettati con CAD e stampaggio in gomma BSA.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli ingegnerizzati di tessuti isolando le variabili architetturali negli studi sulle interazioni tra ECM e segnalazione cellulare.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso la fabbricazione standardizzata della gomma BSA e la rimozione enzimatica, minimizzando la variabilità tra un lotto e l'altro.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati ottenuti da impalcature che riproducono in modo più accurato i vincoli tissutali in vivo sulla distribuzione dei farmaci e sul comportamento cellulare.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei farmaci in base al rischio, basandosi sulle prestazioni in sistemi con architettura definita e rilevanti per la patologia.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di biomateriali, nella tecnica asettica e nell'ottimizzazione della digestione enzimatica.
- È subordinato all'accesso a software CAD, a attrezzature per la stampatura di precisione (ad esempio Microlution) e a sistemi di incubazione/reticolazione controllati.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la progettazione degli stampi, la preparazione della gomma di BSA e i protocolli per gli idrogel di collagene, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si trasferisce la tecnica a diverse concentrazioni di collagene o a polimeri naturali alternativi.
- I limiti pratici includono la necessità di conservare i precursori della gomma di BSA a freddo e tempi di digestione prolungati (15–24 ore) per rimuovere completamente il materiale sacrificabile.
