Name: Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Scopri come ingegnerizzare scaffold tridimensionali in collagene che replicano le proprietà meccaniche e architettoniche dei tessuti in vivo utilizzando la tecnica del BSA rubber. Questo metodo avanzato consente di ricreare con alta fedeltà la microgeometria dei canali interni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da NIH-NIDCR IRO1DE019355 (MJ Yost, PI) e NSF-EPSCoR (EPS-0903795).

1. Determinare la percentuale di solidi in batch Collagene <ol><li> Estrarre il collagene seguito di una procedura precedentemente pubblicato 13. Scongelare un minimo di 20 ml di collagene. Determinare la percentuale iniziale di solidi collagene nel batch per manipolare la concentrazione collagene nel idrogel formati. <ol><li> Tagliare tre pezzi di foglio di alluminio (circa 6 x 6 cm) e la forma ciascuno come una vaschetta utilizzando il fondo di un bicchiere 25 ml. Registrare il peso di ciascun piatto. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di collagene per ogni vaschetta e registrare il peso totale della vaschetta di alluminio e collagene. Aggiungere 0,5 - 0,8 g di collagene su ogni vaschetta di alluminio. Nota: Dopo questo passo, ci sono tre vaschette foglio di alluminio e ognuno dovrebbero avere una piccola quantità di collagene. Assicurarsi di registrare il peso di ciascuna (totale 3) vaschetta di alluminio vuota e il peso della padella dopo l&#39;aggiunta di collagene. </li><li> Calcolare il peso del collagene in ciascuna vaschetta usando l&#39;fopo formula: peso Collagene = Pan e peso collagene - peso Pan </li><li> Posizionare i tre pentole in alluminio che trattengono il collagene in forno a 100 ° C per 24 ore. </li><li> Dopo 24 ore, registrare il peso di ciascuna vaschetta di alluminio e il collagene disidratato. </li><li> Calcolare il peso del collagene disidratato mediante la seguente equazione: Disidratata peso collagene = Pan e peso collagene disidratato - peso Pan </li><li> Calcolare la percentuale di solido per i tre campioni per determinare la concentrazione di solidi collagene utilizzando la seguente formula: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53578/53578eq2.jpg" /></li><li> Calcolare il contenuto medio collagene solida del batch utilizzando la percentuale di solidi collagene per ciascuno dei tre campioni. Nota: Il collagene che verrà utilizzato è ciò che resta del collagene idratato. sarà utilizzato Nessuno di collagene disidratato. </li><li> Dopo la determinazione della percentuale di collagene solido (ila concentrazione di collagene nitial) del lotto, continuare a utilizzare il collagene idratato rimanente. Utilizzare un pHmetro calibrato per regolare il pH del lotto collagene per 3. <ol><li> Aggiungere piccole quantità (2-5 ml per volta) di 12 N acido cloridrico (HCl). Tenere in ghiaccio in ogni momento. Non aggiungere cloridrico direttamente al collagene - aggiungere l&#39;acido al lato del tubo. Dopo aver aggiunto l&#39;acido, utilizzare la spatola per spingere l&#39;acido al collagene e rapidamente mescolare. </li></ol></li><li> Una volta raggiunto un pH di 3, lasciate riposare il collagene O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del BSA gomma <ol><li> Preparare la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) seguendo la procedura di seguito elencati. <ol><li> Preparare la soluzione 2x tampone fosfato (PBS). Aggiungere due compresse PBS a 100 ml di acqua per fare 0,02 soluzione M PBS. </li><li> Combinare BSA con 2x PBS per creare una soluzione di BSA 30% utilizzando la procedura di seguito elencati. <ol><li> Ad esempio, per effettuare una BSA 30% con 30 ml di PBS 2x, utilizzare 12,9 g di BSA. Aggiungere 1/3 del 2x PBS (ad esempio, 10 ml) in un pallone con un ancoretta. Aggiungere 1/2 della BSA (ad esempio, 6,45 g BSA) al pallone e con una spatola, bagnare il soluto secca. </li><li> Ripetere questo processo di aggiunta di PBS e BSA finché tutto il soluto e solvente è nel pallone. Utilizzare la spatola per bagnare tutto il soluto. Si sarà simile a una miscela di un liquido e grumi. Lasciate riposare per circa 30 minuti. </li><li> Quindi, accendere l&#39;agitatore su un ciclo basso e fare in modo che non ci siano grumi di tutto il ancoretta. Si dovrebbero prendere 90 minuti per ottenere tutto in soluzione o può essere lasciata mescolando O / N a 4 ° C. Dopo il soluto è tutto dissolto, porre la soluzione in una siringa da 20 ml e ricoperto con un filtro a siringa 0.20 micron. Premere il pistone per espellere liquido attraverso il filtro e raccogliere la soluzione sterilizzata in una nuova provetta. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare 3% soluti glutaraldeideil diluendo soluzione di glutaraldeide al 25% con sterile filtrata 2x PBS. Ad esempio, per 10 ml di soluzione di glutaraldeide al 3%, usare 2 ml di 25% glutaraldeide e 8 ml di PBS 2x. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Trattamento Stampi Nota: Il prototipo descritto in questo articolo utilizza un acciaio inox Y pezzo stampo su misura. Lo stampo contiene un afflusso e due canali di deflusso di 4 e 3 mm, rispettivamente. In primo luogo, stampi puliti, spruzzarli con lo strutto insaturi, e sterilizzare. Preparare gli stampi seguendo la procedura descritta di seguito. <ol><li> Pulire stampi in acciaio inox con sonicatore ad una frequenza di 35 kHz. Mettere gli stampi nel sonicatore e sommergere con acqua e ghiaccio. Mantenere gli stampi a freddo in ogni momento durante il sonicatore è in funzione. Eseguire il sonicatore per 2 periodi di 90 min. <ol><li> Dopo ogni periodo, utilizzare un ago per assicurarsi che non vi sia materiale nel Luer Lock acciaio inossidabile o bConnettore Rass. Usare acqua e sapone per pulire l&#39;intera superficie dei due lati degli stampi. Verificare che non vi siano ostruzioni nei canali. </li></ol></li><li> Posizionare la stampi, viti, e connettore Luer lock in un sacchetto autoclave e si. </li><li> Riempire la bottiglia che si attacca a un a metà strada spruzzatore d&#39;aria con lardo disponibile in commercio (misto distaccante di acidi grassi). Sostituire il tappo con una bottiglia tappo normale. Mettere in un sacchetto di autoclave e metterla in esso. Nota: lardo viene utilizzato per facilitare il rilascio del materiale che sarà reazione iniettato successivamente (gomma BSA). Non posizionare il coperchio della bottiglia spruzzatore in autoclave- può danneggiare la tenuta interna. </li><li> Riscaldare il lardo per 45 secondi o fino a quando il suo chiaro e liquido in un forno a microonde. Avvitare il coperchio spruzzatore d&#39;aria alla bottiglia lardo. Collegare il coperchio con lo spruzzatore. Collegare lo spruzzatore alla fonte di aria al banco di laboratorio. Aprire la valvola dell&#39;aria, e aprire l&#39;ugello dello spruzzatore fino a quando non inizia a bagnare la superficiedi un tovagliolo di carta. </li><li> Spray lardo perpendicolare alla superficie dello stampo fino a quando la superficie è completamente coperta. Dopo che ogni pezzo è stato spruzzato, metterli in una capsula di Petri e sigillarla. Posizionare gli stampi a 4 ° C per 2 ore. </li><li> Procedere per sterilizzare gli stampi esponendo la superficie di luce UV per 30 min. Riposizionarle a 4 ° C fino a quando non sono pronti per essere iniettato reazione. </li></ol> 4. Reazione iniezione della gomma BSA Nota: Tutti i materiali e le soluzioni devono essere tenere freddo fino al momento dell&#39;uso per impedire l&#39;impostazione prematura della gomma BSA nei passaggi successivi. <ol><li> Preparare il dispenser per la distribuzione la gomma BSA agli stampi di seguito questi passaggi. <ol><li> Sterilizzare tutti i componenti di miscelazione (due O ring, cap siringa, doppia siringa, miscelare punta e 4: 1 dispenser) esponendoli a luce UV per 30 minuti nella cappa reazione a catena della polimerasi (PCR). Nota: Una cappa PCR è stata utilizzata perché tla procedura prevede fissativi. Questi prodotti chimici non possono essere utilizzati nel cofano coltura cellulare / tissutale a causa del rischio di esposizione e tossicità per le cellule. Qualsiasi altra cappa che contiene una luce UV sarà adatto. </li><li> Posizionare il cappuccio punta sul supporto soluzione. </li><li> Eseguire la miscelazione e l&#39;iniezione in un rapporto di 4: 1 di BSA: glutaraldeide. Aggiungere la BSA 30% alla camera doppia siringa, che consegnerà la più alta quantità di soluzione (Ci vorranno circa 4 ml per riempire). Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio per posizionare l&#39;O-ring, al fine di prevenire la contaminazione traboccante e della camera adiacente. </li><li> Aggiungere la soluzione di glutaraldeide al 3% per l&#39;altra camera (ci vorranno circa 1 ml per riempire). Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio per posizionare l&#39;O-ring per prevenire la contaminazione traboccante e della camera adiacente. </li><li> Posizionare la doppia siringa sul dispenser. Inclinare il gruppo verticalmente in modo che il tappo della siringa è in cima. Sostituire il tappo con la punta di miscelazione. </li><li> ScRew i due pezzi dello stampo in acciaio inox insieme. </li><li> Posizionare il gruppo all&#39;interno di un sacchetto di autoclave. </li><li> Per rimuovere eventuale aria nel distributore, tenerlo in posizione verticale e rapidamente stringere il manico una volta per rilasciare una piccola quantità di BSA mescolato con la glutaraldeide. Poi rapidamente collegare il connettore Luer lock di acciaio inox Y dello stampo per la punta della siringa. </li><li> Tenere stampo in acciaio inox Y con la mano sinistra e l&#39;erogatore miscela di BSA-glutaraldeide sulla destra. copre Alternate ciascuno di scarico sinistro e destro dei canali di deflusso premendo scarico ai lati della borsa autoclave per assicurarsi che i vuoti all&#39;interno sono pieni di soluzione. Poi, posizionare gli stampi in orizzontale e iniettare di nuovo. </li><li> Staccare gli stampi dal distributore e mettere in un piatto 25 millimetri Petri. </li><li> Posizionare Parafilm intorno alla piastra di Petri per prevenire la disidratazione della gomma. </li><li> Mettere lo stampo in 4 ° C frigo O / N. </li></ol></li></ol> Nota: Il collagene deve essere tenuta in ghiaccio in ogni momento durante il processo. <ol><li> Modificare la concentrazione di collagene utilizzando la percentuale di solidi di collagene. <ol><li> Rendere 10 ml di 1,75% collagene, regolando la concentrazione di collagene iniziale con acqua fredda. </li><li> Utilizzando un pHmetro calibrato, regolare il pH a 3 con 12 N di acido cloridrico. Non aggiungere cloridrico direttamente al collagen- aggiungere acido al lato del tubo. Dopo aver aggiunto l&#39;acido, utilizzare la spatola per spingere l&#39;acido in collagene e rapidamente mescolare. </li><li> Pesare 4 g di collagene in una provetta conica separata. </li><li> Centrifugare il collagene per rimuovere aria a 4 ° C e 9.343 xg per 20-30 min. </li><li> UV sterilizzare la cappa di coltura cellulare per 30 min, e aggiungere 14 ml di laminina al collagene 4 ml. Questo si tradurrà in una concentrazione laminina finale di 10 mg / mL. Nota: Laminina fornisce sintegrità STRUTTURALI, adesione, e promuove varie risposte cellulari. </li><li> Ruotare la PCR UV luce accesa per 20-30 minuti prima di utilizzare il cappuccio per la sterilizzazione. </li><li> Posizionare il tappo Luer lock, per collegare ad una siringa da 20 ml, in etanolo per 2 ore. Poi, lasciare asciugare e mettere in luce UV. </li><li> Gamma irradiare il collagene per 8.6 minuti per raggiungere 1.200 cGy. Nota: Il tempo dipenderà il decadimento della sorgente cesio. Regolare il tempo per raggiungere lo stesso dosaggio. </li></ol></li></ol> 6.Casting collagene su BSA gomma <ol><li> Per polimerizzare il collagene, utilizzare un 8: 1 ratio: 1 (collagene: HEPES: MEM). La procedura che segue si basa su un primo 4 g di collagene acidificato (dal punto 5.1.8). <ol><li> Fare una soluzione 0,2 N HEPES in acqua, e regolare il pH a 9 con l&#39;aggiunta di piccole quantità (1-5 microlitri) di M di idrossido di sodio 1-5 (NaOH). Utilizzando un pHmetro calibrato, controllare il pH della soluzione dopo ogni aggiunta. Conservare a 4 ° C o keep su ghiaccio. </li><li> Accendere la luce UV della cappa coltura tissutale per 20-30 min per sterilizzare la cappa. </li><li> forcipe autoclave, spatola, e bisturi per la sterilizzazione. </li><li> Mescolare 1,5 ml di 0,2 N HEPES (pH 9) e 1,5 ml di MEM 10x utilizzando la cappa coltura tissutale. Assicurati di tenerlo in ghiaccio e vortex per 5 secondi prima dell&#39;uso. Conservare a 4 ° C o tenere in ghiaccio. </li><li> Per sterilizzare il cofano PCR, accendere la luce UV per 30 min. </li><li> Posizionare una piastra 12 pozzetti e una siringa da 20 ml in -20 ° C per 10 minuti, o fino al momento di continuare. Nota: Conservare tutto il materiale freddo fino al momento dell&#39;uso. L&#39;aumento della temperatura induce prematura fibrillogenesi collagene. </li><li> Spruzzare tutti i tubi e le piastre così che stanno per essere nella cappa con il 70% di etanolo e lasciare asciugare per la sterilizzazione. Posizionare una siringa da 20 ml in ghiaccio per raffreddare per un uso successivo. </li><li> Nella cappa PCR, aprire gli stampi in acciaio inox per rilasciare la gomma BSA e utilizzando un bisturi, tagliare i canali di scarico del BSA rmuffa ubber. </li><li> Sotto il cofano della PCR, aprire i tubi di collagene sterili e aggiungere 1 ml di soluzione HEPES-MEM (fare in modo che prima di estrarre la soluzione HEPES-MEM, che è ben amalgamato e non ci sono depositi solidi). </li><li> Utilizzando la spatola sterile, mescolare bene la soluzione di collagene e di buffer. </li><li> Chiudere e vortex rapidamente per garantire un idrogel ben miscelato. </li><li> Trasferire in un fredda siringa da 20 ml. </li><li> Con una mano, tenere il BSA gomma all&#39;interno del pozzo e, con l&#39;altra, dispensare metà della soluzione collagene idrogel sul fondo del pozzo. </li><li> Utilizzando le pinzette sterili, in modo che le estremità di afflusso e deflusso di gomma tocchino i lati del pozzo. </li><li> Versare soluzione di collagene sulla cima della gomma fino è completamente coperto. </li><li> Assicurarsi che la gomma BSA è sospesa all&#39;interno del collagene e che non vi siano bolle, soprattutto in prossimità delle estremità della gomma. </li><li> Mettere il coperchio e avvolgere intorno al Parafilmcirconferenza del pozzo. </li><li> Mettere in incubatrice per 1 ora a 37 ° C. Tenere la luce UV PCR su. </li></ol></li><li> Dopo la polimerizzazione del collagene, UV reticolare il idrogel mediante la seguente procedura. Nota: La reticolazione del collagene sarà effettuata utilizzando un&#39;apparecchiatura reticolante UV in cui la quantità di energia può essere controllata. <ol><li> Accendere il reticolante UV e utilizzare l&#39;impostazione energia per irradiare la camera vuota con 630.000 μJ / cm 2. </li><li> Rimuovere il gel dal termostato. </li><li> Spruzzare mani con etanolo, e, all&#39;interno della camera, rimuovere il coperchio più rapidamente possibile. </li><li> Chiudere la camera e UV reticolare idrogel selezionando l&#39;impostazione di energia e irradiando 630.000 μJ / cm 2. </li><li> Dopo il ciclo di reticolazione, spegnere la luce UV sul cofano PCR </li><li> Spruzzare le mani con etanolo e aprire la camera, mettendo rapidamente il coperchio sulla piastra bene. Spostare la piastra benalla cappa PCR. </li><li> Utilizzando la spatola sterile, allentare delicatamente e rimuovere il gel dal pozzo. Capovolgere il gel sotto il cofano per reticolare il fondo della idrogel. Ripetere il passaggio 6.2.3 e 6.2.4. </li></ol></li></ol> 7. Digestione enzimatica della BSA in gomma <ol><li> Per avere un ponteggio collagene cava, rimuovere BSA gomma in modo che non influenza le dimensioni incorporati nel idrogel. La procedura è descritta di seguito. <ol><li> Accendere la luce UV per 20-30 minuti per sterilizzare il cofano coltura di tessuti. </li><li> Fare 0,25% tripsina soluzione a pH 7.8. Ad esempio, per 15 ml di acqua, aggiungere 0,0376 g di tripsina in una provetta conica da 50 ml. Aggiustare il pH a 7,8 con l&#39;aggiunta di piccole quantità (2-5 microlitri) di 1 M NaCl. Posizionare la soluzione in una siringa da 20 ml e ricoperto con un filtro a siringa 0.20 micron. Premere il pistone per espellere liquido attraverso il filtro e raccogliere la soluzione sterile in una nuova provetta. </li><li> Accendere il bagnomaria e impostare la temperatura a 30° C. </li><li> Dopo 30 minuti, spegnere la luce UV. Spruzzare etanolo su tutti i tubi e materiali che verranno utilizzati nella cappa. </li><li> Trasferire l&#39;idrogel di collagene sotto il cofano e il luogo in tubo conico separata. </li><li> Aggiungere circa 3-5 ml (appena sufficiente a coprire i gel) di soluzione tripsina 0,25% con un pH di 7,8 a ciascuna provetta. </li><li> Sigillare i tubi con Parafilm e vortex leggermente per circa 1 minuto. </li><li> Posto nella 30 ° C bagnomaria per 15-24 ore. Mentre nel bagnomaria, leggermente vortice i gel spesso fino alla gomma BSA è stato digerito o rimosso dal idrogel. Nota: Per determinare se la gomma BSA è stato rimosso, sia la gomma fluttua nella soluzione tripsina o ci sono parti panne. Non ci devono essere zone scure visivi all&#39;interno della idrogel. </li></ol></li><li> Per garantire che tutta la gomma BSA e tripsina è stata rimossa dai idrogel, risciacquo come descritto di seguito. <ol><li> Accendere il hoo PCRd luce UV per 20-30 minuti. </li><li> Preparare la soluzione Mosconas. Combinare cloruro di potassio (KCl, 28,6 mM), (NaHCO 3, 11,9 mM), glucosio (9,4 mM) e (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) in acqua. Aggiustare il pH a 7,4 con 1 M NaOH o 12 soluzione M HCl. Posizionare la soluzione in una siringa da 20 ml e utilizzare un filtro a siringa da 0,20 micron per sterilizzare la soluzione. </li><li> Spruzzare il tutto con etanolo prima della loro immissione sul cofano e consentire l&#39;etanolo si asciughi. </li><li> Aprire la provetta e trasferire 5-10 ml di soluzione sterile Mosconas in un tubo da 50 ml. </li><li> Trasferire il idrogel collagene per tubo conico che contiene la soluzione enzimatica. Assicurarsi che l&#39;idrogel è completamente coperto con la soluzione. Lasciare il tubo nella shaker in frigorifero a 4 ° C per 30 min. </li><li> Aspirare la soluzione Mosconas e ripetere il passo 7.2.5 per due volte. </li><li> Conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKundu%2C+J+%22Biofabrication%22">Biofabrication</a>. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).</li>
<li>Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+and+biomaterials+for+tissue+engineering%3A+a+review+of+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications.</a> Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).</li>
<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+in+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+tissue-specific+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).</li>
<li>Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+pore+structure+of+PCL+scaffolds+for+tissue+engineering+prepared+via+gas+foaming+of+multi-phase+blends%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porous+Mater%22%5BJournal%5D)">Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends.</a> J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).</li>
<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.</a> Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).</li>
<li>Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+polymer+nanofibers+by+electrospinning+and+their+applications+in+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Compos.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.</a> Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).</li>
<li>Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+collagen%2Fbiopolymers+for+regenerative+medicine+and+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).</li>
<li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Collagen+Nanofibrous+Materials+for+Bone+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Eng.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering.</a> Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).</li>
<li>Cao, H., Kuboyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biodegradable+porous+composite+scaffold+of+PGA%2Fbeta-TCP+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering.</a> Bone. 46, 386-395 (2010).</li>
<li>Ankam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+topography+and+size+determine+the+fate+of+human+embryonic+stem+cells+to+neuronal+or+glial+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage.</a> Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).</li>
<li>Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+tissue+engineering+using+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Bone tissue engineering using 3D printing.</a> Mater. Today. 16, 496-504 (2013).</li>
<li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+trends+and+limitations+in+hydrogel-rapid+prototyping+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering.</a> Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).</li>
<li>Yost, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tubular+scaffold+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).</li>
<li>Habeeb, A. J., Hiramoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+of+proteins+with+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Reaction of proteins with glutaraldehyde.</a> Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).</li>
<li>Tanford, C., Buzzell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Viscosity+of+Aqueous+Solutions+of+Bovine+Serum+Albumin+between+pH+4.3+and+10.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5.</a> J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).</li>
<li>Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscosity+analysis+of+high+concentration+bovine+serum+albumin+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions.</a> Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).</li>
<li>Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+viscosity+of+polyelectrolytes+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Int%22%5BJournal%5D)">The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited.</a> Polym. Int. 44, 338-347 (1997).</li>
<li>Arakawa, T., Timasheff, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+protein+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Theory of protein solubility.</a> Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37, 790-796 (2004).</li>
<li>Burmeister, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde+cross-linked+glutamate+oxidase+coated+microelectrode+arrays%3A+selectivity+and+resting+levels+of+glutamate+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS.</a> ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).</li>
<li>Chatterji, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+with+hydrophilic%2Fhydrophobic+grafts+and+glutaraldehyde+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks.</a> J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).</li>
<li>Freije, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified%2C+immobilized+trypsin+reactor+with+improved+digestion+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency.</a> J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).</li>
<li>Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+gels+for+intratumoral+delivery+of+beta-lapachone%3A+effect+of+cyclodextrins+and+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol.</a> ScientificWorldJournal. 2012, 126723(2012).</li>
<li>Basak, R., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+hydrophobic+drugs+in+Pluronic+F127+micelles%3A+effects+of+drug+hydrophobicity%2C+solution+temperature%2C+and+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH.</a> Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Biofabrication è un settore altamente multidisciplinare in cui i principi biologia e ingegneria si fondono per generare materiali complessi che imitano il tessuto nativo. Per realizzare questo, vi è la necessità di sviluppare tecniche che utilizzano le informazioni raccolte dal tessuto in vivo e tradurlo in un scaffold in vitro. In questo modo, una piattaforma può essere progettato che ricorda da vicino le proprietà architettonici, funzionali e meccaniche del tessuto in vivo. Il materiale otti...

Nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti la capacità di fabbricare scaffold tessuto è vitale. Un ponteggio tessuto adatto ha una struttura 3D, è composto da materiali biocompatibili, e mima dell&#39;architettura tessuto vivo per facilitare cellule e tessuti crescita e rimodellamento. Questo ponteggio deve consentire il trasporto delle sostanze nutritive e la rimozione dei rifiuti 1-4. Uno dei principali ostacoli nella produzione di questi scaffold è la capacità di ricapitolare specifiche caratteristiche geometriche in un materiale biocompatibile. Diverse tecniche biofabrication sono stati segnalati per controllare le caratteristiche geometriche di questi ponteggi, esempi sono electrospinning 5-8, solvente colata 9, stereolitografia 10, e 3D-stampa 11, tra gli altri. Queste tecniche sono inferiori nel fornire una relativamente facile trasferimento di controllabili elementi architettonici interni ed esterni, sono costosi, sono limitati dalla risoluzione e la stampabilità ( <em&gt; ad esempio, calibro ugello, limitazione di materiale), o richiedono tecniche di post-fabbricazione che richiede un lungo periodo di tempo per produrre impalcature vitali 12. In molti sistemi di fabbricazione commerciali, la creazione di vuoti interni, canali e caratteristiche si ottiene utilizzando sabbia o altri materiali rimovibili o sacrificali adatti. La parte metallica o plastica è formata intorno allo stampo di sabbia, e una volta solidificato, la sabbia viene rimosso. Più o meno allo stesso modo, la prossima generazione di biomateriali ha bisogno della BioSand equivalente. Pertanto, la gomma BSA è stato sviluppato come un sostituto per BioSand. La gomma BSA è un materiale di nuova formulazione che consiste di albumina di siero bovino reticolata con glutaraldeide. L&#39;obiettivo finale è quello di ricreare specifiche caratteristiche architettoniche in una impalcatura di collagene biodegradabile. Le caratteristiche del biorubber sacrificale che mantiene la fedeltà dimensionale con lo stampo del tessuto originale vengono descritti. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Diverse combinazioni di concentrazioni BSA e glutaraldeide sono stati testati utilizzando una varietà di solventi. Questo materiale è stato creato dalla reazione tra BSA e glutaraldeide. gomma BSA può essere reazione iniettato nelle geometrie complesse degli stampi tessuto. Reticolato BSA è tripsina labile e prontamente digeriti dall&#39;enzima in condizioni di pH e temperatura miti. Al contrario, il tipo intatta collagene è molto resistente alla tripsina digestione. Queste caratteristiche sono stati capitalizzati per rimuovere selettivamente la gomma BSA lasciando dietro di sé il collagene. Il presente lavoro consisteva determinare i parametri ideali necessari per ottenere uno stampo labile in grado di fornire specifiche caratteristiche architettoniche di un&#39;impalcatura biocompatibile. Le caratteristiche specifiche che sono stati valutati inclusi miscibilità, digestione enzimatica, portante, e la capacità di essere reazione iniettato in uno stampo negativo. La combinazione del 30% BSA e 3% glutaraldeide soddisfa questi requisiti. Questo protocollo prevede la necesslinee guida ary per creare queste impalcature tridimensionali. Il prototipo è costituito da un ponteggio collagene che rappresenta un&#39;architettura ramificato con un afflusso e deflusso due canali con diametri rispettivamente 4 e 3 mm,. Questa tecnica ha il potenziale per imitare macro e micro-ambienti del tessuto di interesse. Questa tecnologia fornisce una tecnica praticabile per fornire una determinata istruttivo geometrico di un materiale biodegradabile in una questione relativamente facile e tempestiva con alta fedeltà, che può essere sintonizzata per imitare il vivo elasticità dei tessuti e altre caratteristiche del tessuto di interesse.

<table><tbody><tr><td>Collagene di tipo I</td><td></td><td></td><td>Collagene estratto dalla pelle di vitello</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone fosfato (PBS Compresse)</td><td>MP Biomedical</td><td>U5378</td><td>1 compressa per 100 ml per 1x PBS</td></tr><tr><td>Albumium da siero bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>G5882</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Lard</td><td>Fields</td><td>3090</td><td></td></tr><tr><td>Stampi</td><td></td><td></td> in acciaio inossidabile <td>fresati utilizzando Microlution Machine</td></tr><tr><td>Air Brush Kit</td><td>Pneumatico centrale</td><td>47791</td><td></td></tr><tr><td>Punta di miscelazione per doppia siringa</td><td>Medmix</td><td>ML2.5-16-LLM</td><td>Mixer, DN2,5X16, 4:1 marrone, med</td></tr><tr><td>Piccolo O-ring per doppia siringa</td><td>Medmix</td><td>PPB-X05-04-02SM</td><td>Pistone B, 5 ml, 4:1, PE naturale</td></tr><tr><td>Tappo a doppia siringa</td><td>Medmix</td><td>VLX002-SM</td><td>Tappo, 4:1/10:1, PE marrone, med</td></tr><tr><td>Grande O-ring per doppia siringa</td><td>Medmix</td><td>PPA-X05-04-02SM</td><td>Pistone A, 5 ml, 4:1</td></tr><tr><td>Siringa doppia</td><td>Medmix</td><td>SDL X05-04-50M</td><td>Siringa doppia, 5 ml, 4:1</td></tr><tr><td>Dispenser doppia siringa</td><td>Medmix</td><td>DL05-0400M</td><td>Dispenser, 5 ml, 4:1, med, semplice</td></tr><tr><td>Laminim</td><td></td><td></td><td>3,6 mg/ml - estratto USC lab</td></tr><tr><td>Siringa da 20 ml Luer Lock Tip</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Caps</td><td>Fisher</td><td>JGTCBLLX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Minimo Essenziale Terreni 10x (MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>1143-030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Life Technologies</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker&nbsp;</td><td>Spectroline UV</td><td>XLE1000</td><td></td></tr><tr><td>Cloride di sodio (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td>Per preparare Mosconas</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P5405-250</td><td>Per preparare Mosconas</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td>Per preparare Mosconas</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>G-8270</td><td>Per preparare Mosconas</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7907</td><td>Per preparare Mosconas</td></tr><tr><td>Filtro sterile per siringhe</td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr></tbody></table>

tridimensionale tecnologia biomimetica: novel biorubber consente di creare definito micro e macro scala architetture in collagene idrogel

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

ponteggi tessuti giocano un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dei tessuti. L&#39;impalcatura ideale deve soddisfare alcuni requisiti, come avere la composizione corretta, il modulo di mira, e le caratteristiche architettoniche ben definiti. Biomaterials che ricapitolano l&#39;architettura intrinseca del tessuto vivo sono essenziali per lo studio delle malattie e per facilitare la rigenerazione del tessuto molle perduto e valido. Una tecnica biofabrication romanzo è stato sviluppato che combina stato di imaging arte, stampa tridimensionale (3D), e l&#39;attività enzimatica selettiva per creare una nuova generazione di biomateriali per la ricerca e l&#39;applicazione clinica. Il materiale sviluppato, gomma Bovine Serum Albumin, è reazione iniettato in uno stampo che sostiene specifiche caratteristiche geometriche. Questo materiale sacrificale permette l&#39;adeguato trasferimento di caratteristiche architettoniche di un materiale impalcatura naturale. Il prototipo è costituito da un ponteggio collagene 3D con 4 e 3 canali mm che ReprESENT un&#39;architettura ramificata. Questo documento enfatizza l&#39;uso di questa tecnica biofabrication per la generazione di costrutti naturali. Questo protocollo utilizza un software per computer (CAD) per produrre uno stampo solido che sarà reazione iniettato con gomma BSA seguita dalla digestione enzimatica della gomma, lasciando le sue caratteristiche architettoniche all&#39;interno del materiale scaffold.

I risultati dimostrano che questa tecnica biofabrication è efficiente nel generare scaffold 3D che possono mimare la disposizione spaziale visto in vivo tessuto. Le caratteristiche architettoniche sono parametri vitali per l&#39;applicazione ingegneria tissutale, che giocano un ruolo cruciale nell&#39;interazione delle cellule in vivo e la funzionalità del tessuto. La consistenza e miscibilità della gomma BSA...

È stata sviluppata un'innovativa tecnica di biofabbricazione per ingegnerizzare costrutti tridimensionali che assomigliano alle caratteristiche architettoniche, ai componenti e alle proprietà meccaniche dei tessuti in vivo. Questa tecnica presenta un materiale sacrificale di nuova concezione, la gomma BSA, che trasferisce caratteristiche spaziali dettagliate, riproducendo le architetture in vivo di un'ampia varietà di tessuti.

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è progettare impalcature tridimensionali in collagene che possano riprodurre le caratteristiche architettoniche, la composizione e le proprietà meccaniche dei tessuti in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale, come le interazioni tra cellule e matrice extracellulare (ECM), l'influenza delle caratteristiche architettoniche nella creazione di tessuti ingegnerizzati e lo sviluppo di sostituti tissutali, tra gli altri. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una procedura praticabile per riprodurre con elevata fedeltà la microgeometria dei canali e dei percorsi interni di flusso in un materiale biodegradabile.La procedura sarà dimostrata da Veronica Rodriguez-Rivera, ricercatrice post-dottorato nel mio laboratorio. I materiali utilizzati per preparare la gomma di BSA devono essere conservati al freddo fino al momento dell'uso, in modo che la gomma di BSA non si solidifichi prematuramente. È inoltre fondamentale mantenere la sterilità durante tutta la procedura.Per prima cosa, sterilizzare il dispenser. In una cappa non dedicata alla coltura cellulare, disporre le guarnizioni ad O, la siringa, il suo cappuccio, la punta miscelatrice e il dispenser quattro a uno. Sterilizzare questi materiali con raggi UV per 30 minuti.Per prima cosa, avvitare insieme i due pezzi dello stampo in acciaio inossidabile e collegare il blocco Luer. Prima di assemblare l'erogatore, spruzzare le pipette e i reagenti con etanolo al 70% prima di introdurli nell'incubatore. Attaccare per prima cosa il tappo della punta al contenitore della soluzione.Successivamente, caricare la soluzione di BSA al 30% nella camera più grande senza contaminare l'altra camera. Lasciare spazio sufficiente per fissare l'O-ring. Quindi, caricare la camera dispenser più piccola con glutaraldeide al tre percento e fissare un altro O-ring.Ora, attaccare la siringa al dispenser. Successivamente, inclinare l'insieme in modo che il cappuccio sia in alto e sostituire il cappuccio con una punta miscelatrice. Poi, battere delicatamente sui lati per permettere alle bolle d'aria di risalire verso l'alto.Successivamente, posizionare l'erogatore all'interno di un sacchetto autoclavato per contenere la soluzione di scarico. All'interno del sacchetto, con l'erogatore in posizione verticale, erogare una piccola quantità di soluzione per eliminare tutta l'aria dalla siringa. L'eliminazione dell'aria è molto importante.Quindi, collegare rapidamente il blocco Luer dello stampo in acciaio inossidabile a forma di Y alla punta della siringa. Ora, tenendo lo stampo nella mano non dominante, alternare l'espulsione della soluzione nei due canali di uscita sinistro e destro. Premere sugli scarichi, riempiendo così le cavità interne con la soluzione.Successivamente, posizionare lo stampo in orizzontale e iniettare ulteriore soluzione fino a quando non &egrave; stata utilizzata met&agrave; del volume del dispenser. Lo stampo deve ora essere collocato in una piastra, avvolto nella pellicola parafilm e conservato a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Questa procedura &egrave; proporzionata a quattro grammi di collagene acidificato.Mantenerlo freddo fino al momento dell'uso. Dopo aver pesato il collagene, procedere a sterilizzare la soluzione mediante radiazione gamma. A tale scopo, preparare una soluzione fresca di HEPES 0,2 normali in acqua.Quindi trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 millilitri. Regolare il pH a nove utilizzando idrossido di sodio concentrato. Assicurarsi di sterilizzare l'ambiente a raggi UV e di autoclavare le pinzette, la spatola e il bisturi.Nella cappa, mescolare 1,5 millilitri della soluzione HEPES con 1,5 millilitri di MEM 10x. Conservare questa miscela sul ghiaccio. Inoltre, raffreddare una piastra a 12 pozzetti e una siringa da 20 millilitri nel congelatore per 10 minuti.Per una maggiore sterilità, spruzzare le provette e le piastre con etanolo al 70% prima di posizionarle nell'incubatore. Spruzzare la piastra per stampi e posizionarla nell'incubatore. Successivamente, rimuovere gli stampi in gomma di BSA con pinzette.Quindi, rimuovere i canali di scarico dallo stampo utilizzando un bisturi. Successivamente, vortexare brevemente la miscela HEPES-MEM e aggiungere un millilitro al collagene. Poi, mescolare accuratamente la soluzione con una spatola sterile.Procedere con un breve vortex e trasferire rapidamente la soluzione nella siringa fredda da 20 millilitri. Successivamente, mentre si tiene ferma la gomma BSA all'interno del pozzetto, dispensare metà della soluzione di idrogel al collagene sul fondo del pozzetto. Quindi, utilizzando pinzette, posizionare lo stampo in modo che le estremità di ingresso e uscita della gomma tocchino le pareti del pozzetto.Quindi, coprire lo stampo con idrogel di collagene. Ora sigillare la pozzetta con pellicola parafilm e inserire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius. Attendere un'ora per consentire al collagene di polimerizzare.Durante questo periodo, mantenere accesa la luce UV nella cappa. Inoltre, impostare l'apparato di cross-linking UV in modo che eroghi 630.000 microjoule per centimetro quadrato. Ora, spruzzare le mani guantate con etanolo al 70% e caricare la piastra con gli stampi rivestiti di collagene nel cross-linker, quindi avviare il processo di irradiazione.Dopo l'irradiazione, spruzzare nuovamente le manopole e rimuovere la piastra dal crosslinker. Quindi, utilizzando una spatola sterile, rimuovere il gel dal pozzetto, capovolgerlo e sottoporre il fondo dell'idrogel a crosslinking. Al termine del ciclo finale di crosslinking, procedere con la digestione enzimatica.Per rimuovere la gomma di BSA senza disturbare l'impalcatura di collagene, utilizzare una soluzione sterile di tripsina 0,25% a pH 7,8 e filtrarla attraverso un filtro da 0,20 micron. Trasferire una quantità sufficiente di soluzione di tripsina filtrata in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, trasferire l'idrogel di collagene nel tubo conico contenente la soluzione enzimatica.Assicurarsi che l'idrogel sia completamente ricoperto dalla soluzione. Sigillare il tubo con parafilm e agitare delicatamente al vortex per circa un minuto. Successivamente, incubare il tubo a 30 gradi Celsius e lasciare procedere la digestione per 15-24 ore.Per le prime quattro ore, rimuovere il tubo ogni 15-30 minuti e vorticare delicatamente per favorire il completamento della digestione della gomma con BSA. Il giorno successivo, la digestione si considera completa quando nessun pezzo di gomma galleggia nella soluzione o non sono presenti frammenti di gomma degradati nell'idrogel. A questo punto, sostituire la soluzione di tripsina con soluzione sterile di Mosconas e lasciare agitare il tubo a quattro gradi Celsius per 30 minuti.In seguito, aspirare la soluzione Mosconas e ripetere questo passaggio altre due volte per pulire completamente l'impalcatura di collagene. Un numero elevato di test è stato utilizzato per ottimizzare l'uso del biorubber e descritto in dettaglio nel protocollo testuale. Utilizzando il protocollo ottimizzato e tre pezzi di stampo solidi, sono stati realizzati idrogeli di collagene ed esaminati in dettaglio.Lo stampo a forma di Y necessario è stato realizzato su una macchina Microlution. Lo stampo a forma di Y è stato iniettato con BSA al 30% e tre percento di glutaraldeide, che hanno reagito per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, la gomma di BSA è stata colata con il collagene e riscaldata a 37 gradi Celsius per un'ora.La gomma è stata digerita enzimaticamente per 15 ore, indebolendola fino al punto di staccarsi senza alterare la geometria dell'idrogel di collagene. Il canale di ingresso di quattro millimetri ottenuto mediante stampo è stato misurato con un calibro ed è risultato essere precisamente di quattro millimetri nell'idrogel di collagene. Testando la stabilità dello stampo, si è scoperto che dimensioni piccole fino a 300 micrometri potevano essere realizzate in modo affidabile.Inoltre, i supporti sono stati sottoposti a test per rilevare la presenza di glutaraldeide residua dopo i lavaggi Mosconas, e non &egrave; stato trovato alcun residuo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare supporti tridimensionali in collagene con la potenzialit&agrave; di mimare geometrie in vivo. Seguendo questa procedura, &egrave; possibile eseguire altri metodi complementari a questa tecnica, come la creazione di modelli tridimensionali di tessuti in vivo e la fabbricazione di stampi con caratteristiche architettoniche specifiche, al fine di rispondere a ulteriori domande.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare l'interazione tra le caratteristiche architettoniche interne e i componenti della matrice con le cellule in modelli in vitro.

three-dimensional-biomimetic-technology-novel-biorubber-creates

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Un bioprinter stato usato per creare idrogel patterned basato su uno stampo sacrificale. Lo stampo poloxamer stata riempita con un secondo idrogel e quindi eluita, lasciare vuoti che sono stati riempiti con una terza idrogel. Questo metodo utilizza eluizione veloce e buona stampabilità di polossalene di generare architetture complesse di biopolimeri.

La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D

In questo lavoro, presentiamo una tecnica per la rapida fabbricazione di tessuti vascolari viventi mediante coltura diretta di collagene, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. Inoltre, viene descritto un nuovo protocollo per la caratterizzazione meccanica di tessuti vascolari ingegnerizzati.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

La creazione di microtessuti funzionali all'interno di dispositivi microfluidici richiede la stabilizzazione dei fenotipi cellulari adattando le tecniche tradizionali di coltura cellulare alle limitate dimensioni spaziali dei microdispositivi. La modifica del collagene consente la deposizione strato per strato di assemblaggi di collagene ultrasottili in grado di stabilizzare le cellule primarie, come gli epatociti, come modelli di tessuto microfluidico.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Un bioprinter cartesiano è stato progettato e fabbricato per consentire la deposizione di più materiali in geometrie precise e riproducibili, consentendo anche il controllo dei fattori ambientali. Utilizzando il bioprinter tridimensionale, è possibile stampare e riprodurre facilmente costrutti complessi e fattibili.

Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

Il collagene è una componente fondamentale della ECM, e fornisce spunti essenziali per molti processi cellulari che vanno dalla migrazione verso la differenziazione e la proliferazione. Qui fornito è un protocollo per l'incorporamento celle all'interno di idrogel di collagene 3D, e una tecnica più avanzata per la generazione di matrici di collagene randomizzati o allineati con microcanali PDMS.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Presentato qui è un metodo per la biostampa 3D di gelatina methacryloyl.

Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

Questo protocollo dimostra l'uso di un canale microfluidico con geometria variabile lungo la direzione del flusso del fluido per generare tensione estensionale (stretching) per allineare le fibre in un idrogel di collagene 3D (&lt;250 μm di spessore). L'allineamento risultante si estende su diversi millimetri ed è influenzato dalla velocità di deformazione estensionale.

Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Questo studio introduce un nuovo bagno di sospensione sub-microgel di κ-carragenina, che mostra notevoli proprietà di transizione reversibile di inceppamento-sbloccaggio. Questi attributi contribuiscono alla costruzione di tessuti e organi biomimetici nel bioprinting 3D incorporato. La stampa di successo di tessuti simili al cuore/all'esofago con alta risoluzione e crescita cellulare dimostra applicazioni di bioprinting e ingegneria tissutale di alta qualità.

Bioprinting incorporato di strutture simili a tessuti utilizzando il terreno sub-microgel di κ-carragenina

Il seguente protocollo presenta un metodo di estrusione basato sul taglio per la fabbricazione di idrogel di collagene con fibrille modellate su scala nanometrica, che può essere applicato a un'ampia gamma di applicazioni di ingegneria tissutale.

Produzione di collagene nanofibrillare per l'ingegneria tissutale

Creazione di micro-tessuti con gel di collagene cilindriche, chiamati moduli, che contengono cellule embedded e la cui superficie è rivestita con le cellule endoteliali.

Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

Scopri come ingegnerizzare scaffold tridimensionali in collagene che replicano le proprietà meccaniche e architettoniche dei tessuti in vivo utilizzando la tecnica del BSA rubber. Questo metodo avanzato consente di ricreare con alta fedeltà la microgeometria dei canali interni.

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel (Video) | JoVE Journal

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel

Esplora altri video