Name: 세 가지 차원 생체 모방 기술 : 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 배우세요 생체 모방 기술을 활용한 3차원 콜라겐 스캐폴드 제작 방법입니다. BSA 고무를 희생 재료로 사용하여 조직의 미세 구조와 내부 유로 채널을 고충실도로 재현할 수 있습니다. 이 기술은 조직 공학 및 세포 외 기질 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 NIH-NIDCR IRO1DE019355(MJ Yost, PI) 및 NSF-EPSCoR(EPS-0903795)의 지원을 받았습니다.

1. 콜라겐 배치에서 고체의 비율을 결정 <ol><li> 이전에 게시 된 절차 (13) 다음 콜라겐을 추출합니다. 콜라겐 20ml의 최소 해동. 형성된 하이드로 겔에서 콜라겐 농도를 조작하기 위해 배치 콜라겐 고체의 초기 비율을 결정한다. <ol><li> 알루미늄 호일 (약 6 × 6cm)의 세 가지 컷 25 ㎖ 비이커의 바닥을 사용하여 팬과 같은 각을 형성. 각 팬의 무게를 기록한다. </li><li> 각 팬에 콜라겐을 소량 첨가하고 알루미늄 팬 콜라겐의 총 중량을 기록한다. 각 알루미늄 팬에 콜라겐의 0.8 g - 0.5를 추가합니다. 주 :이 단계 후에,이 세 알루미늄 포일 팬은 각각 하나가 콜라겐의 소량을 가져야한다. 각 (총 3) 빈 알루미늄 팬의 무게와 콜라겐을 첨가 한 후 팬의 무게를 기록해야합니다. </li><li> F를 사용하여 각 팬에서 콜라겐의 중량을 계산공식을 따르게 : 콜라겐 무게 = 팬과 콜라겐 중량 - 팬 중량 </li><li> 24 시간 동안 100 ° C에서 오븐에 콜라겐을 보유하고있는 세 개의 알루미늄 팬을 놓습니다. </li><li> 24 시간 후, 각각 알루미늄 팬의 중량 및 탈수 콜라겐을 기록한다. </li><li> 다음 식을 이용하여 탈수 콜라겐의 중량을 계산한다 : 탈수 콜라겐 무게 = 팬 탈수 콜라겐 중량 - 팬 중량 </li><li> 3 개의 시료는 아래 공식을 사용하여 콜라겐 고형분 농도를 결정하기 위해 고체의 비율을 계산한다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53578/53578eq2.jpg" /></li><li> 3 개의 시료 각각 콜라겐 고형분의 비율을 이용하여 배치의 평균 콜라겐 고체 함량을 계산한다. 참고 : 사용되는 콜라겐 수화 콜라겐 남아있는 것입니다. 탈수 콜라겐 중 어느 것도 사용되지 않습니다. </li><li> 콜라겐 고체 (난의 비율을 결정한 후일괄 nitial 콜라겐 농도)을 남아있는 수화 된 콜라겐을 계속. 3 콜라겐 배치의 pH를 조정하는 보정 pH 미터를 사용한다. <ol><li> 소량 (12) N 염산 (HCL)의 (한 번에 2-5 μL)를 추가합니다. 항상 얼음에 보관하십시오. 콜라겐에 직접 염산 없어 - 튜브의 측면에 의해 산을 추가한다. 산을 첨가 한 후, 콜라겐 산 밀어 주걱을 사용하여 신속하게 혼합 교반한다. </li></ol></li><li> 이 3의 pH에​​ 도달하면, 콜라겐은 4 ℃에서 O / N을 앉아 보자. </li></ol></li></ol> BSA 고무 2. 준비 <ol><li> 아래의 절차에 따라 소 혈청 알부민 (BSA) 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 0.02 M PBS 용액을 만들기 위해 물 100ml에 두 개의 PBS 정제를 추가합니다. </li><li> 아래 절차를 이용하여 30 %의 BSA 용액을 만들기 위해 2 × PBS로 BSA를 결합. <ol><li> 예를 들어, 2 × PBS 30 ㎖로 30 % BSA을 BSA 12.9 g을 사용한다. 교반 막대와 플라스크에 2 배 PBS (예를 들어, 10 ㎖)의 1/3을 추가합니다. 플라스크에 BSA (예를 들어, 6.45 g의 BSA)의 1/2을 추가하고 주걱을 사용하여 건조 용질 젖은. </li><li> 모든 용질 때까지 PBS 다음 BSA를 추가하는이 과정을 반복하고 용매 플라스크에있다. 모든 용질 젖은 주걱을 사용합니다. 그것은 몇 가지 액체 덩어리의 혼합물과 같이 표시됩니다. 이 약 30 분 동안 앉아 보자. </li><li> 그런 다음, 낮은 사이클에 교반기를 켜고 교반 막대 주위에 덩어리가 없는지 확인합니다. 이 솔루션의 모든 것을 얻기 위해 90 분 소요 또는 4 ℃에서 O / N 감동을 둘 수 있습니다. 용질 모두 용해 된 후, 20 ml의 시린지에 넣고 용액을 0.20 μm의 주사기 필터로 덮인. 필터를 통해 액체를 추방하고 새로운 튜브에 멸균 솔루션을 수집하는 플런저를 누르십시오. 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 3 % 글루 타르 알데히드의 soluti 준비멸균 여과 배 PBS와 25 % 글루 타르 알데히드 용액을 희석하여합니다. 예를 들어, 3 % 글루 타르 알데하이드 용액 10㎖를 들면, 2 내지 25 %의 글루 타르 알데히드 ㎖의 2 × 8 ml의 PBS를 사용한다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 금형 치료 참고 :이 문서에 설명 된 프로토 타입은 사용자 정의 만든 스테인리스 Y 금형 조각을 사용합니다. 금형 유입 각각 4, 3mm, 두 유출 채널이 포함되어 있습니다. 첫째, 깨끗한 금형, 불포화 라드로 스프레이, 그들을 소독. 아래에 설명 된 절차에 따라 금형을 준비한다. <ol><li> 35 kHz의 주파수에서 초음파기를 사용하여 면도 스테인리스 금형. 소니 케이의 금형을 놓고 물과 얼음을 잠수함. 초음파 처리기가 실행되는 동안 항상 감기 금형을 유지합니다. 90 분 2 시간 동안 초음파 처리를 실행합니다. <ol><li> 각 기간 후에, 루어에는 재료는 스테인레스 강 또는 b을 잠글 수 없습니다가 있는지 확인하기 위해 바늘을 사용의 RAS 연결합니다. 금형의 양측의 전체 표면을 청소 비누와 물을 사용합니다. 채널에 장애물이 없는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 오토 클레이브 봉지 형, 나사, 루어 락 커넥터를 배치하고 오토 클레이브. </li><li> 시중에서 판매하는 돼지 기름 (혼합 지방산 이형제)와 공기 분무기 반 방식에 부착 병을 채 웁니다. 일반 캡 병 뚜껑을 교체합니다. 오토 클레이브 가방에 배치하고 오토 클레이브. 주 : 라드 나중에 주입 반응 될 재료 (BSA 고무)의 방출을 용이하게하기 위해 사용된다. 이 내부 씰을 손상시킬 수 있습니다 autoclave-에 분무기 병 뚜껑을 올려 놓지 마십시오. </li><li> 45 초 동안이나 전자 레인지에서의 명확하고 액체 때까지 돼지 기름을 따뜻하게. 돼지 기름 병에 공기 분무기 뚜껑을 나사. 분무기와 뚜껑을 연결합니다. 실험실 벤치에서 공기 소스에 분무기를 연결합니다. 공기 밸브를 개방하고,이 표면을 습윤 시작할 때까지 분무기의 노즐을 열고종이 수건. </li><li> 표면이 완전히 피복 될 때까지 금형 표면에 수직 라드 스프레이. 각 조각은 분무 된 후, 배양 접시에 배치하고 밀봉. 2 시간 동안 4 ° C에서 금형을 놓습니다. </li><li> 30 분 동안 UV 광에 노출시킴으로써 표면을 주형 살균 진행. 그들이 반응 주입 할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 그들을 다시 놓습니다. </li></ol> BSA 고무 4. 반응 사출 참고 : 다음 단계에서 BSA 고무의 조기 설정을 방지하기 위해 사용할 준비가 될 때까지 모든 자료와 솔루션은 차가운 유지되어야한다. <ol><li> 다음 단계를 수행하여 금형에 BSA 고무를 전달하기위한 디스펜서를 준비합니다. <ol><li> 혼합 성분 모두 멸균 : 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 후드에서 30 분 동안 UV 광에 노출하여 (두 개의 O 링, 주사기 캡 이중 주사기 팁을 혼합하고, 4 일 디스펜서). 참고 : PCR 후드가 t 있기 때문에 사용그 절차는 고정 제를 포함한다. 이러한 화학 물질로 인해 세포 독성에 대한 노출의 위험을 세포 / 조직 배양 후드에서 사용될 수 없다. 자외선이 포함되어 다른 후드가 적합 할 것이다. </li><li> 솔루션 홀더에 끝 캡을 배치합니다. </li><li> BSA의 1 비율 : 4로 혼합 및 주입을 수행 글루 타르 알데히드를. 솔루션의 가장 높은 금액을 제공 할 것입니다 이중 주사기 챔버에 30 % BSA를 추가 (그것은 채우기 위해 약 4 mL를 취하여 것입니다). 인접 실의 범람과 오염을 방지하기 위해 O 링을 배치하기에 충분한 공간을 남겨해야합니다. </li><li> 다른 챔버에 3 % 글루 타르 알데히드 용액을 추가 (그것은 채우기 위해 약 1 mL를 취하여 것입니다). 인접 실의 범람과 오염을 방지하기 위해 O 링을 배치하기에 충분한 공간을 남겨해야합니다. </li><li> 디스펜서에 이중 주사기를 놓습니다. 주사기 캡 상단에 위치하도록 수직으로 어셈블리를 기울입니다. 믹싱 팁 캡을 교체합니다. </li><li> 사우스 캐롤라이나두 함께 스테인리스 금형 조각 REW. </li><li> 오토 클레이브 가방의 내부 어셈블리를 놓습니다. </li><li> 디스펜서의 모든 공기를 제거하려면 수직 위치에 고정 빠르게 핸들을 글루 타르 알데히드와 혼합 BSA의 작은 금액을 해제 한 시간을 짠다. 그런 다음 신속하게 주사기 팁에 스테인리스 Y 금형의 루어 락 커넥터를 연결합니다. </li><li> 왼쪽과 오른쪽에 BSA-글루 타르 알데히드 혼합물을 디스펜서 스테인리스 Y 금형 잡아. 다른 내부 보이드 용액으로 채워 확인 압력솥 백 측면에 배기를 누름으로써 유출 채널의 좌우의 배기를 각각 덮는. 그리고, 가로 금형을 배치 한 후 다시 주입. </li><li> 25mm 페트리 접시에 디스펜서와 장소에서 금형을 분리합니다. </li><li> 고무의 탈수를 방지하기 위해 페트리 접시 주위에 파라 필름을 배치합니다. </li><li> 4 ° C 냉장고 O / N의 금형을 놓습니다. </li></ol></li></ol> 주 : 콜라겐 과정 항상 얼음에 보관해야한다. <ol><li> 콜라겐 고형분의 비율을 사용하여 콜라겐 농도를 수정한다. <ol><li> 찬물로 초기 콜라겐 농도를 조정하여 1.75 %의 콜라겐 10 ㎖를 확인합니다. </li><li> 조정 pH 측정기를 사용하여, 12 N 염산을 사용하여 pH 3를 조정한다. 콜라겐에 직접 염산 않는다 튜브의 측면에 의해 산을 추가한다. 산을 첨가 한 후, 콜라겐에 의해 산을 밀어 주걱을 사용하여 신속하게 혼합 교반한다. </li><li> 별도의 원뿔 튜브에 콜라겐 4g의 무게를. </li><li> 4 ° C와 20 ~ 30 분 동안 9,343 XG에서 공기를 제거하기 위해 콜라겐을 원심 분리기. </li><li> 30 분 동안 세포 배양 후드 살균 및 4 ml의 콜라겐 라미닌의 14 μL를 추가 UV. 이 10 μg의 / μL의 최종 라미닌 농도가 발생합니다. 참고 : 라미닌이들 제공tructural 무결성, 접착 및 다양한 세포 반응을 촉진한다. </li><li> 이전 살균 후드를 사용하여 PCR UV는 20 ~ 30 분에 불을 켭니다. </li><li> 2 시간 동안 에탄올, 20 ML의 주사기에 부착, 루어 잠금 캡을 놓습니다. 그리고, 건조 및 자외선에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 감마 1200 cGy의 도달하도록 8.6 분간 콜라겐을 조사. 주 : 시간 ​​세슘 소스의 감쇠에 의존 할 것이다. 동일한 투여 량에 도달하는 시간을 조정한다. </li></ol></li></ol> BSA 고무에 콜라겐을 6.Casting <ol><li> 1 : 1의 비율 (콜라겐 : HEPES : MEM) 콜라겐을 중합하려면 8을 사용합니다. 다음 절차 (단계 5.1.8)에서 산성화 콜라겐의 초기 4g에 기초한다. <ol><li> 물에 0.2 N HEPES 용액을 만들고, 1-5 M 수산화 나트륨 (NaOH) 용액을 소량의 (1-5 μL)을 첨가하여 9 pH를 조정한다. 조정 pH 측정기를 사용하여, 각각을 첨가 한 후, 용액의 pH를 모니터링한다. 4 ° C 또는 케에서 보관얼음에 EP. </li><li> 후드를 소독하기 위해 20 ~ 30 분 동안 조직 문화 후드의 자외선을 켭니다. </li><li> 오토 클레이브 집게, 주걱, 살균 용 메스. </li><li> 조직 문화 후드를 사용하여 0.2 N HEPES (pH가 9) 및 ml의 10 배 MEM 1.5의 1.5 ml의 혼합. 사용하기 전에 5 초 동안 얼음과 소용돌이를 잘 보관해야합니다. 4 ° C에서 보관 또는 얼음에 보관하십시오. </li><li> PCR 후드를 소독하기 위해 30 분 동안 자외선을 켭니다. </li><li> 10 분 동안 -20 ° C에서 12 웰 플레이트와 20 ML의 주사기를 놓고, 또는 준비가 될 때까지 계속합니다. 참고 : 사용할 준비가 될 때까지 차가운 모든 자료를 보관하십시오. 온도의 증가는 조기 콜라겐 fibrillogenesis를 유도한다. </li><li> 70 % 에탄올로 후드에 살균하기에 건조 할 예정 모든 튜브와 웰 플레이트 스프레이. 나중에 사용하기 위해 냉각 얼음에 20 ML의 주사기를 놓습니다. </li><li> PCR 후드, BSA 고무 메스를 사용 해제하는 스테인리스 금형을 열 BSA (R)의 배출 채널 컷ubber 금형. </li><li> PCR 후드에서 HEPES-MEM 용액 1 ㎖를 멸균 콜라겐 튜브를 열고 추가 (확인 그것이 잘 혼합 더 단단한 보증금은 없는지, HEPES-MEM 솔루션을 추출하기 전에). </li><li> 멸균 주걱을 사용하여, 철저하게 콜라겐과 완충 용액을 혼합한다. </li><li> 닫기과 소용돌이 신속하게 잘 혼합 된 하이드로 겔을 보장합니다. </li><li> 차가운 20 ML의 주사기에 전송합니다. </li><li> 한 손으로도 내부 BSA 고무를 누르고, 다른 쪽을 이용하여, 웰의 바닥에 콜라겐 겔 용액의 절반을 분배. </li><li> 멸균 핀셋을 사용하여, 고무 유입과 유출 끝이 아니라의 측면에 접촉되어 있는지 확인합니다. </li><li> 완전히 덮여 때까지 고무의 상단에 콜라겐 솔루션을 따르십시오. </li><li> BSA 고무가 콜라겐 내에서 정지되어 있고, 특히 고무의 끝 근처에 거품이 없는지 확인합니다. </li><li> 덮개를 놓고 주위 파라 필름 포장잘 둘레. </li><li> 37 ° C에서 1 시간 동안 인큐베이터에 넣어. 의 PCR 자외선을 유지합니다. </li></ol></li><li> 콜라겐의 중합 후, UV는하기 절차를 가교 하이드로 겔. 주 : 콜라겐 가교 에너지의 양을 제어 할 수있는 UV 가교제 장치를 사용하여 수행한다. <ol><li> UV 가교제를 켜고 63 μJ / ㎠로 빈 챔버를 조사하는 에너지 설정을 사용합니다. </li><li> 인큐베이터에서 젤을 제거합니다. </li><li> 에탄올로 손을 스프레이하고, 챔버 내에서 가능한 한 빨리 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 챔버를 닫고 UV 에너지 설정을 선택하고 63 μJ / ㎠를 조사하여 하이드로 겔을 가교. </li><li> 가교주기 후, PCR 후드에 자외선을 해제 </li><li> 에탄올로 손 스프레이 빠르게 웰 플레이트에 다시 뚜껑을 배치, 챔버를 엽니 다. 잘 플레이트를 이동PCR의 후드. </li><li> 부드럽게 풀어 우물에서 젤을 제거, 멸균 주걱을 사용. 하이드로 겔의 바닥 가교 후드 겔 플립. 단계를 반복 6.2.3과 6.2.4. </li></ol></li></ol> BSA 고무 7. 효소 소화 <ol><li> 중공 콜라겐 지지체를 위해, 하이드로 겔에 포함 된 차원에 영향을주지 않는 방식으로 BSA 고무를 제거한다. 절차는 다음과 같다. <ol><li> 조직 문화 후드를 소독하기 위해 20 ~ 30 분 동안 자외선을 켭니다. </li><li> 0.25 % 트립신 용액의 pH 7.8을 확인합니다. 예를 들어, 물 15 mL를 들어, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 트립신 0.0376 g을 추가한다. 1 M NaCl을 소량 (2-5 μL)을 추가하여 7.8로 pH를 조정합니다. 20 mL의 주사기에 넣고 용액을 0.20 μm의 주사기 필터로 덮인. 필터를 통해 액체를 추방하고 새로운 튜브에 멸균 솔루션을 수집하는 플런저를 누르십시오. </li><li> 수조를 켜고 (30)의 온도를 설정기음. </li><li> 30 분 후, 자외선을 끕니다. 후드에 사용되는 모든 튜브와 재료에 에탄올을 스프레이. </li><li> 별도의 원뿔 관에서 후드와 장소에 따라 콜라겐 하이드로 겔을 전송합니다. </li><li> 각 튜브에 7.8의 pH와 0.25 % 트립신 용액 (젤을 충당하기에 충분한) 약 3 ~ 5 ML을 추가합니다. </li><li> 약 1 분 동안 가볍게 파라 필름과 소용돌이 튜브를 밀봉합니다. </li><li> 15-24 시간 동안 30 ° C의 물을 욕조에 넣어. BSA 고무 소화 또는 하이드로 겔에서 제거 될 때까지 물을 욕조에있는 동안, 가볍게 자주 젤을 소용돌이. 참고 : 위해 BSA 고무가 제거되었는지 확인하기 위해, 하나 고무 트립신 용액에 떠 또는 고장난 조각이있다. 하이드로 겔 내에서 시각적 어두운 부분이 없어야합니다. </li></ol></li><li> 아래에 설명 된대로 모든 BSA 고무 및 트립신은 하이드로 겔에서 제거되었는지 확인하기 위해, 린스. <ol><li> PCR의 ~이 켭니다20 ~ 30 분 동안 D 자외선. </li><li> Mosconas 솔루션을 준비합니다. 물에서 염화칼륨 (KCl을, 28.6 mM)을 (수 NaHCO3 11.9 mM)을 포도당 (9.4 mM)을하고 (NaH를 2 PO 4, 0.08 mm)를 결합한다. 1 M NaOH를 12 M HCl 용액으로 pH 7.4까지를 조정합니다. 20 ML의 주사기에서 솔루션을 배치하고 솔루션을 소독하기 위해 0.20 ㎛의 주사기 필터를 사용합니다. </li><li> 후드에 그들을 배치하기 전에 에탄올로 모든 스프레이 및 에탄올 건조 할 수 있습니다. </li><li> 튜브를 열고 새 50 ML 원뿔 관에 멸균 Mosconas 솔루션의 5 ~ 10 mL로 전송합니다. </li><li> 효소 용액을 포함하는 원뿔형 튜브에 콜라겐 겔을 전송. 하이드로 겔이 완전히 용액으로 덮여 있는지 확인합니다. 30 분 동안 4 ° C의 냉장고에있는 통에 튜브를 남겨주세요. </li><li> Mosconas 솔루션과 두 번 단계를 반복 7.2.5을 대기음. </li><li> 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

Biofabrication 생물학 및 공학 원리가 기​​본 조직을 모방 복잡한 물질을 생성하기 위해 병합하는 고도의 전문 분야 필드입니다. 이를 달성하기 위해서, 생체 조직으로부터 수집 한 정보를 사용하여 시험 관내 지지체로 번역 기술을 개발할 필요가있다. 이러한 방식으로, 플랫폼이 밀접 생체 조직, 구조적 기능적, 기계적 특성과 유사한 것으로 설계 될 수있다. 최적 발판 재료, 예컨대 생체 적합성 인 특정 성질을 가지고 관심 조직의 기계적 특성을 모방 제어 분해 능력 세포 생존을 지원할 수 및 2,3- 리모델링 조직을 허용 할 수 있어야한다. 제조 기술의 수많은 가능한 입체 구조를 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 기술은 두 가지 범주로 구분 : 기존의를d를 고급. 종래 기술은 다공성 구조를 만드는 합성 및 천연 전통적인 재료의 사용을 포함한다. 일부 예는, 용매 캐스팅 동결 건조, 성형 용융물. 이러한 기...

조직 공학 분야에서 조직 지지체를 제조하는 능력은 중요하다. 적합한 조직 골격이 3 차원 구조를 갖는 생체 적합성 재료로 구성되고, 생체 조직의 구조를 모방은 세포 및 조직의 성장 및 리모델링을 용이. 이 비계는 영양분의 수송 및 폐기물 1-4의 제거를 허용해야합니다. 이러한 지지체의 제조에서 주요 장애물 중 하나는 생체 적합성 물질로 특정 기하학적 특징 요점을 되풀이하는 능력이다. 몇몇 biofabrication 기술은 이러한 지지체의 기하학적 특징을 조절하는 것으로보고 된, 예로는 용매 캐스팅 9 조형 10 5-8 전기 방사되고, 그 중에서도 11 차원 인자. 이러한 기술은 제어 내부 및 외부 건축 기능을 상대적으로 쉽게 전송을 제공하는 짧은 가을, 비싼, 그들의 해상도와 인쇄 적성 (에 의해 제한되어 있습니다 <em&gt; 예를 들면, 노즐 게이지, 소재 제한), 또는 실행 가능한 지지체 (12)를 생성하기 위해 장시간을 요구 후 제조 기술을 필요로한다. 많은 상용 제조 시스템에서, 내부 보이드, 채널 및 기능 생성 모래 또는 다른 적합한 이동식 또는 희생 물질을 사용하여 달성된다. 금속 또는 플라스틱 부분 사형 주위에 형성되고, 그것이 경화되면, 모래가 제거된다. 거의 같은 방법으로, 생체 물질의 차세대 biosand 당량이 필요하다. 따라서, BSA 고무 biosand위한 대용품으로 개발되었다. BSA 고무는 글루 타르 알데히드와 가교 결합 소 혈청 알부민으로 구성된 신규 제형 재료이다. 궁극적 인 목표는 생분해 성 콜라겐 지지체에 특정 건축 기능을 다시하는 것입니다. 원 조직의 금형 치수 충실도를 유지하는 희생 biorubber의 특성을 설명한다. <p cl엉덩이 = &quot;jove_content&quot;&gt; BSA 및 글루 타르 알데히드의 농도의 몇몇 조합은 다양한 용매를 사용하여 테스트 하였다. 이 자료는 BSA와 글루 타르 알데히드의 반응에 의해 만들어졌습니다. BSA 고무 조직 형의 복잡한 형상의 반응에 주입 될 수있다. 가교 BSA는 불안정하고 쉽게 중성 pH 및 온도 조건에서 효소에 의해 분해 트립신된다. 반대로, I 콜라겐 손상 유형은 트립신 소화에 매​​우 강하다. 이러한 기능은 선택적으로 뒤에 콜라겐을 떠나 BSA 고무를 제거하기 위해 대문자로했다. 본 연구는 생체 지지체 특정 구조적 특징을 제공 할 수있는 불안정한 주형을 얻기 위해 필요한 최적 파라미터를 결정하는 단계로 구성되었다. 평가 특정 기능 혼합 성, 효소 절단, 하중 및 네가티브 몰드에 주입 반응 할 수있는 능력을 포함했다. 30 % BSA 및 3 % 글루 타르 알데히드의 조합은 이러한 요구 사항을 충족. 이 프로토콜은 necess을 제공합니다진 가이드 라인은이 세 가지 차원의 발판을 만들 수 있습니다. 프로토 타입은 하나의 유입과 각각 4- 3-mm의 직경이 유출 채널 분지 구조를 나타내는 콜라겐 지지체로 구성되어 있습니다. 이 방법은 관심있는 조직을 다량 및 미세 환경을 모방 할 수있는 잠재력을 갖는다. 이 기술은 생체 조직 탄성 관심 조직의 다른 특성을 모방하기 위해 동조 될 수있는 높은 정확도를 가진 비교적 쉽고 적시 문제에 생분해 성 물질의 특정 기하학적 유익을 제공하기 위해 실행 가능한 기술을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 유형 I</td><td></td><td></td><td>송아지 가죽에서 추출한 콜라겐</td></tr><tr><td>하이드로클로릭산(HCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS 정제)</td><td>MP Biomedical</td><td>U5378</td><td>100ml당 1</td></tr>정으로 <tr><td>소 혈청(BSA)에서</td> 1x PBS 알부늄 만들기<td>시그마-알드리치</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마 -알드리치</td><td>G5882</td><td>독성</td></tr><tr><td>라드</td><td>필드</td><td>3090</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 금형</td><td></td><td></td><td>Microlution 기계를 사용하여 밀링</td></tr> 에어 <tr><td>브러시 키트</td><td>중앙 공압</td><td>47791</td><td></td></tr><tr><td>이중 주사기 용 믹싱 팁</td><td>Medmix</td><td>ML2.5-16-LLM</td><td>믹서, DN2,5X16, 4 : 1 갈색,</td></tr><tr><td>med 이중 주사기 용 소형 O 링</td><td>Medmix</td><td>PPB-X05-04-02SM</td><td>피스톤 B, 5 ml, 4:1, PE 천연</td></tr><tr><td>더블 주사기 캡&nbsp;</td><td>Medmix</td><td>VLX002-SM</td><td>캡, 4:1/10:1, PE 브라운,</td></tr><tr><td>이중 주사기용 메드 빅 O 링</td><td>Medmix</td><td>PPA-X05-04-02SM</td><td>피스톤 A, 5ml, 4:1</td></tr><tr><td>더블 주사기</td><td>Medmix</td><td>SDL X05-04-50M</td><td>이중 주사기, 5ml, 4:1</td></tr><tr><td>더블 주사기 디스펜서</td><td>Medmix</td><td>DL05-0400M</td><td>디스펜서, 5ml, 4:1, med, 일반</td></tr><tr><td>Laminim</td><td></td><td></td><td>3.6 mg/ml - 추출된 USC 실험실</td></tr><tr><td>20 ml 주사기 루어 잠금 팁</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>루어 잠금 캡</td><td>Fisher</td><td>JGTCBLLX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 -Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 최소 필수 매체 10x (MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>1143-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker&nbsp;</td><td>Spectroline UV</td><td>XLE1000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td>Mosconas</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td> <td>준비 시그마 -Aldrich</td><td>P5405-250</td><td>Mosconas</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨 (NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td>준비 Mosconas</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마 -Aldrich</td><td>G-8270</td><td>준비 Mosconas</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7907</td> 주사기용 <td>Mosconas</td></tr><tr><td>멸균 필터를</td> 준비하기 위해 <td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr></tbody></table>

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

조직 지지체는 조직 재생 과정에서 중요한 역할을한다. 이상적인 발판는 데 적절한 구성, 대상 계수, 잘 정의 된 아키텍처 기능 같은 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 생체 조직의 고유 아키텍처를 요점을 되풀이 생체 적합 물질은 질병을 공부뿐만 아니라 손실과 잘못된 연부 조직의 재생을 촉진하기 위해 매우 중요합니다. 신규 biofabrication 기술이 연구 및 임상 적 적용을위한 생체 재료의 새로운 세대를 만들 아트 화상, 3 차원 (3D) 인쇄, 선택적 효소의 활성 상태를 결합하는 개발되었다. 개발 한 물질, 소 혈청 알부민 고무 특정 기하학적 특징을 지탱 몰드에 주입 반응이다. 이 희생 물질은 자연 골격 물질에 건축 기능의 적절한 전송을 할 수 있습니다. 프로토 타입은 4 3mm 채널에 repr로 3D 콜라겐 지지체로 구성분 지형 구조를 ESENT. 이 논문은 자연 구조의 생성이 biofabrication 기술의 사용을 강조한다. 이 프로토콜은 컴퓨터 지원 소프트웨어 (CAD) 골격 물질 내에서 구조적 특징을두고 고무의 효소 소화 하였다 BSA 고무 주입 반응 것이다 고형 금형 제조를 이용한다.

결과는이 기술이 biofabrication 생체 조직에서 본 공간 배열을 모방 할 수 3D 골격을 생성하는데 효율적임을 보여준다. 구조적 특징들은 조직의 생체 내 상호 작용 및 세포 기능에 중요한 역할을하는 조직 공학 응용을위한 중요한 파라미터이다. BSA 고무의 일관성 및 균일 혼합 성이 그 의도 된 형상을 유지할 수 BSA 고무의 제조에서 중요한 파라미터이다. 단백질의 용해성은 단백질 - 단백질 상호 작용하고, 전체 단백질의 거동 변화를 유도 용매와 같은 분자간 상호 작용 효과에 의해 결정된다. BSA 용액의 전도도는 용액의 염 농도의 지표 인 측정 하였다. 표 1리스트를 combinatiBSA의 기능은, 용매, 및 글루 타르 알데히드 테스트. 예상 한 바와 같이, 가장 높은 전도도를 가지고 샘...

생체 내 조직의 구조적 특징, 구성 요소 및 기계적 특성과 유사한 3차원 구조를 엔지니어링하기 위해 혁신적인 생체 제조 기술이 개발되었습니다. 이 기술은 새로 개발된 희생 재료인 BSA 고무를 특징으로 하며, 이 고무는 세부적인 공간 특징을 전달하여 다양한 조직의 생체 내 구조를 재현합니다.

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 생체 내 조직의 구조적 특징, 성분 및 기계적 특성을 모방할 수 있는 3차원 콜라겐 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 이 방법은 ECM 세포 상호작용, 공학적 조직 생성 시 구조적 특징의 영향, 조직 대체제 개발 등 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생분해성 재료를 사용하여 내부 유동 채널과 경로의 미세 기하학적 구조를 높은 정밀도로 재현할 수 있는 실행 가능한 절차를 제공한다는 점입니다.시연을 맡은 분은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Veronica Rodriguez-Rivera입니다. BSA rubber가 조기에 경화되는 것을 방지하기 위해, BSA rubber 제조에 사용되는 재료들은 사용 직전까지 차갑게 보관해야 합니다. 또한, 이 절차에서는 멸균 상태를 유지하는 것이 매우 중요합니다.먼저, 디스펜서를 멸균합니다. 비세포 배양 후드 내에 O링, 시린지, 캡, 믹싱 팁, 그리고 4:1 디스펜서를 배치합니다. 이 재료들을 30분 동안 UV 멸균합니다.먼저, 두 개의 스테인리스강 몰드 조각을 서로 나사로 조여 결합하고 Luer lock을 부착합니다. 디스펜서를 조립하기 전, 피펫과 시약을 후드에 넣기 전에 70% ethanol로 분무 소독하십시오. 먼저 솔루션 홀더에 팁 캡을 부착합니다.다음으로, 다른 챔버를 오염시키지 않도록 주의하며 더 큰 챔버에 30% BSA 용액을 채웁니다. O-링을 부착할 수 있도록 충분한 공간을 남겨둡니다. 그 후, 더 작은 디스펜서 챔버에 3% 글루타르알데하이드를 채우고 다른 O-링을 부착합니다.이제 시린지를 디스펜서에 연결합니다. 그런 다음 캡이 위로 오도록 어셈블리를 기울인 후, 캡을 믹싱 팁으로 교체합니다. 이어서 측면을 가볍게 두드려 기포가 위로 올라오게 합니다.다음으로, 배출되는 용액을 받기 위해 디스펜서를 오토클레이브 멸균된 봉투 안에 넣습니다. 디스펜서를 세운 상태에서 소량의 용액을 분주하여 시린지 내부의 모든 공기를 제거합니다. 공기를 제거하는 것은 매우 중요합니다.그런 다음, 스테인리스 스틸 Y 몰드의 Luer lock을 주사기 팁에 빠르게 연결합니다. 이제 몰드를 비우세손에 쥐고, 유출 채널의 왼쪽과 오른쪽 배출구에 번갈아 가며 용액을 주입합니다. 배출구를 눌러 내부 빈 공간을 용액으로 채웁니다.그 다음, 몰드를 수평으로 배치하고 디스펜서 용량의 절반을 사용할 때까지 용액을 더 주입합니다. 이제 몰드를 접시에 넣고 파라필름으로 감싼 뒤 4°C에서 하룻밤 동안 보관해야 합니다. 이 절차는 4g의 산성화된 콜라겐 기준으로 설정되었습니다.사용 전까지 차갑게 유지하십시오. 콜라겐의 무게를 측정한 후, 감마선을 이용하여 용액을 멸균합니다. 준비 과정으로, 증류수에 0.2 normal HEPES 용액을 새로 제조하십시오.그런 다음 내용을 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 진한 수산화나트륨을 사용하여 pH를 9로 조정합니다. 후드를 UV 멸균하고 핀셋, 스파툴라 및 메스를 오토클레이브로 멸균하십시오.클린벤치 내에서 HEPES 용액 1.5 milliliters와 10x MEM 1.5 milliliters를 혼합하십시오. 이 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 또한, 12웰 플레이트와 20 milliliter 주사기를 냉동고에서 10분 동안 냉각시키십시오.멸균 상태를 강화하기 위해, 튜브와 플레이트를 후드에 넣기 전 70% ethanol로 분무하십시오. 곰팡이 플레이트에 분무한 후 후드 안에 넣으십시오. 그다음, 핀셋을 사용하여 BSA 고무 몰드를 제거하십시오.그런 다음, 메스로 몰드에서 배기 채널을 잘라냅니다. 이어서 HEPES-MEM 혼합액을 짧게 볼텍싱한 후, 1 mL를 콜라겐에 첨가합니다. 그 후 멸균 스패튤라를 사용하여 용액을 철저히 혼합합니다.짧게 볼텍싱한 후, 용액을 차가운 20 milliliter 주사기로 빠르게 옮깁니다. 이제 웰 내부에 BSA 고무를 고정한 상태에서, 콜라겐 하이드로겔 용액의 절반을 웰 바닥에 분주합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 고무 유입구와 유출구 끝이 웰 벽면에 닿도록 몰드를 배치합니다.그런 다음, 몰드를 콜라겐 하이드로젤로 덮습니다. 이제 파라필름으로 웰을 밀봉하고, 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. 콜라겐이 중합될 때까지 1시간 동안 둡니다.이 시간 동안 후드의 UV 라이트를 켜 두십시오. 또한, UV 가교 장치가 cm²당 630,000 µJ을 조사하도록 설정하십시오. 이제 장갑을 낀 손에 70% ethanol을 뿌려 소독한 후, 콜라겐이 도포된 몰드가 담긴 플레이트를 가교 장치에 넣고 조사 과정을 시작하십시오.조사 후, 장갑에 다시 스프레이를 뿌리고 크로스링커에서 플레이트를 꺼냅니다. 그런 다음, 멸균된 스패튤라를 사용하여 웰에서 겔을 제거하고 뒤집어 하이드로겔의 바닥면을 가교합니다. 마지막 가교 사이클이 끝나면 효소 소화를 진행합니다.콜라겐 스캐폴드를 손상시키지 않고 BSA 고무를 제거하려면, pH 7.8의 멸균된 0.25% trypsin 용액을 사용하고 이를 0.20 micron 필터로 여과하십시오. 여과된 trypsin 용액을 새로운 50 milliliter 원심 분리관으로 적당량 옮깁니다. 그 다음, 효소 용액이 들어 있는 원심 분리관으로 콜라겐 하이드로젤을 옮깁니다.하이드로젤이 용액으로 완전히 덮였는지 확인하십시오. 튜브를 파라필름으로 밀봉한 후, 약 1분 동안 부드럽게 볼텍싱합니다. 그 다음, 튜브를 30 °C에서 배양하여 15~24시간 동안 소화를 진행시킵니다.처음 4시간 동안은 15~30분마다 튜브를 꺼내어 부드럽게 볼텍싱하여 BSA 고무 소화를 돕습니다. 다음 날, 용액에 떠다니는 고무가 없거나 하이드로겔 내에 분해된 고무 조각이 없으면 소화가 완료된 것으로 간주합니다. 이제 트립신 용액을 멸균된 Mosconas 용액으로 교체하고, 4°C에서 30분 동안 튜브를 흔들어 줍니다.나중에 Mosconas 용액을 흡입하고 이 단계를 두 번 더 반복하여 콜라겐 스캐폴드를 완전히 세척합니다. 바이오러버의 사용법을 최적화하기 위해 수많은 테스트가 수행되었으며, 이는 텍스트 프로토콜에 상세히 설명되어 있습니다. 최적화된 프로토콜과 3개의 고체 몰드 조각을 사용하여 콜라겐 하이드로젤을 제작하고 상세히 분석하였습니다.필요한 Y 몰드는 Microlution 기계로 제작되었습니다. Y 몰드에 30% BSA와 3% glutaraldehyde를 주입하고 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰습니다. 그다음, BSA 고무를 콜라겐과 함께 캐스팅하고 37°C에서 1시간 동안 가열하였습니다.고무를 15시간 동안 효소로 처리하여, 콜라겐 하이드로젤의 기하학적 구조에 영향을 주지 않으면서도 자연스럽게 떨어져 나갈 정도로 약화시켰습니다. 몰드로 제작된 4 mm 유입 채널을 캘리퍼스로 측정한 결과, 콜라겐 하이드로젤 내에서 정확히 4 mm인 것으로 확인되었습니다. 몰드의 안정성을 테스트한 결과, 300 µm만큼 작은 치수까지 안정적으로 설계할 수 있음을 확인했습니다.또한, Mosconas 세척 후 지지체에 잔류 글루타르알데히드가 있는지 테스트하였으며, 잔류물은 발견되지 않았습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 생체 내 기하학적 구조를 모방할 가능성이 있는 3D 콜라겐 지지체를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 이어, 생체 내 조직의 3D 모델을 생성하거나 특정 건축적 특징을 가진 몰드를 제작하는 것과 같이 이 기술을 보완하는 다른 방법들을 수행함으로써 추가적인 질문들에 대한 해답을 찾을 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 조직 공학 분야의 연구자들은 인비트로(in-vitro) 모델에서 내부 구조적 특징 및 매트릭스 성분과 세포 간의 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

three-dimensional-biomimetic-technology-novel-biorubber-creates

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

미세유체 소자 내에서 기능적 미세조직을 생성하려면 미세장치의 제한된 공간 차원에 전통적인 세포 배양 기술을 적용하여 세포 표현형을 안정화해야 합니다. 콜라겐의 변형은 간세포와 같은 일차 세포를 미세유체 조직 모델로 안정화할 수 있는 초박형 콜라겐 어셈블리의 층별 증착을 가능하게 합니다.

Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 &lt;250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.

κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅

다음 프로토콜은 광범위한 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있는 나노 스케일 패턴의 섬유소를 가진 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 전단 기반 압출 방법을 제시합니다.

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

임베디드 세포와 어떤 표면을 포함하는 모듈 불리는 원통형 콜라겐 젤을 사용하여 마이크로 조직의 생성은 내피 세포로 코팅됩니다.

콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

배우세요 생체 모방 기술을 활용한 3차원 콜라겐 스캐폴드 제작 방법입니다. BSA 고무를 희생 재료로 사용하여 조직의 미세 구조와 내부 유로 채널을 고충실도로 재현할 수 있습니다. 이 기술은 조직 공학 및 세포 외 기질 상호작용 연구에 활용됩니다.

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

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