Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

L'obiettivo generale di questo protocollo di imaging è visualizzare la dinamica delle cellule T CD4 positive nella pelle infiammata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio, quali sono i meccanismi che sono alla base della motilità delle cellule immunitarie e della funzione nei tessuti infiammati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un modo minimamente invasivo per studiare il comportamento dinamico delle cellule T CD4 in situ.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per preparare l'orecchio per l'imaging sono difficili da apprendere ed è necessario il corretto posizionamento dell'orecchio per acquisire immagini di alta qualità. Sono Alison Gaylo, una studentessa laureata, e farò la dimostrazione di questo protocollo. Iniziare aspirando 300 microlitri di sospensione di cellule T effettrici marcate in fluorescenza per topo in una siringa dotata di un ago calibro 27 e mezzo.

Quindi girare l'ago della siringa con l'ago rivolto verso l'alto e muovere delicatamente lo stelo della siringa, muovendo lo stantuffo su e giù secondo necessità per rimuovere eventuali bolle. Quando le cellule sono pronte, trasferisci i topi in una gabbia pulita e mettili sotto una lampada termica, fino a quando le vene della coda non saranno vasodilatate. Quindi trasferisci il primo topo nel fermatore e pulisci la coda con un tampone imbevuto di alcol.

Dopo aver identificato una vena laterale della coda, iniettare lentamente 200 microlitri di cellule nella vena. Quando tutte le cellule sono state trasferite, aspirare 50 microlitri di emulsione completa di fluorescens in una siringa da insulina da 28 gauge e mezzo e premere con decisione sullo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria di grandi dimensioni. Quindi posiziona un ditale sull'indice sinistro e afferra con cura l'orecchio del topo tra il pollice sinistro e il ditale, con l'orecchio ventrale rivolto verso l'alto.

Quindi far scorrere l'ago, con il lato smussato rivolto verso l'alto, nel derma nel terzo esterno del padiglione auricolare, e leggermente decentrato, e iniettare lentamente dieci microlitri di emulsione nel tessuto. Dopo aver iniettato tutti gli animali, monitorare i topi fino a quando non si sono completamente ripresi. Tre giorni dopo l'immunizzazione, vasodilatare le vene della coda degli animali iniettati come appena dimostrato.

Dopo l'anestesia, immobilizzare la coda del primo topo con un paio di pinze. Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcol, quindi far scorrere con cautela un catetere ad ago calibro 30 e mezzo in una vena caudale laterale, controllando la pervietà esercitando una leggera pressione sullo stantuffo della siringa. Quando il catetere è in posizione, applicare una o due gocce di adesivo per tessuti cianoacrilato sul sito di iniezione e lasciare asciugare l'adesivo per circa 30 secondi.

Quindi usa le forbici per tagliare con cura i baffi e i peli dalla parte posteriore e dai lati dell'orecchio. Quindi, usa un batuffolo di cotone per inumidire la superficie interna dell'orecchio con PBS. Quindi ruotare il mouse e appiattire l'orecchio iniettato su un vetrino di vetro numero uno virgola cinque da 24 x 50 millimetri, fino a quando non è a filo con il vetro.

Elimina l'eccesso di PBS. Quindi usa due paia di pinze curve per afferrare un pezzo di nastro di tessuto lungo circa 20 millimetri nel senso della lunghezza negli angoli superiori e posiziona la parte inferiore del nastro sul vetrino coprioggetti nella parte superiore dell'orecchio del topo. Arrotolare il nastro sul resto dell'orecchio, spingendo via i peli in eccesso con la pinza se necessario, e utilizzare un batuffolo di cotone asciutto per premere delicatamente il nastro attorno all'orecchio per garantire una tenuta ermetica, facendo attenzione a non premere sull'orecchio stesso.

È essenziale che l'orecchio sia fissato correttamente al vetrino coprioggetto con una buona tenuta su entrambi i lati e con bolle d'aria minime, poiché ciò influirà sulla qualità delle immagini che si possono ottenere. Ora fissa una piattaforma di imaging per microscopio a fluorescenza su un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius e applica il grasso sottovuoto su entrambi i lati dell'area dell'orecchio della piattaforma. Ruotare il mouse per posizionare il vetrino coprioggetti sulla pedana, avendo cura di allineare l'orecchio al centro del feltro.

Quando l'orecchio è in posizione, inserire il cono del naso in isoflurano nel supporto sulla piattaforma, assicurandosi che il cono sia sicuro e coprendo completamente il naso del topo. Quindi utilizzare un batuffolo di cotone per premere con decisione, ma con attenzione, il vetrino coprioggetti sulla piattaforma di imaging, distribuendo il grasso per vuoto sotto il vetrino coprioggetti. Avvolgi due pezzi da 20 millimetri e due pezzi di nastro adesivo più lunghi attorno alla parte superiore della piattaforma per fissare il vetrino coprioggetto alla piattaforma.

Quindi, sposta il mouse sul tavolino del microscopio. Fissare la piattaforma con altro nastro adesivo e versare un doppio strato di grasso sottovuoto sul vetrino coprioggetti intorno all'orecchio. Quindi avvolgere una coperta riscaldante piena d'acqua attorno al mouse e riempire il serbatoio del grasso sottovuoto con acqua distillata a 37 gradi Celsius.

Per l'imaging time lapse in vivo, iniziare posizionando l'obiettivo al centro dell'orecchio e abbassare l'obiettivo fino a quando non tocca appena la superficie dell'acqua nel serbatoio. Quindi, utilizzando una fonte di luce esterna, abbassare lentamente l'obiettivo fino a quando la superficie dell'orecchio non viene messa a fuoco. Quindi, abbassare le tende interne ed esterne attorno al tavolino del microscopio e regolare la lunghezza d'onda del laser a 900 nanometri nella finestra del controller laser MP, la potenza del laser nella finestra del laser di impostazione dell'acquisizione e le tensioni PMT nella finestra di controllo dell'acquisizione dell'immagine.

Nelle finestre delle dimensioni e della modalità di acquisizione, impostare il microscopio su una risoluzione di cinque dodici x cinque pixel dodici, con un tempo di permanenza di due microsecondi per pixel, e selezionare la ripetizione XY per attivare una modalità di imaging dal vivo per la scansione del tessuto. Una volta individuato un campo di imaging appropriato, individuare la cella più alta nel derma e fare clic sul pulsante di impostazione zero per impostare la posizione Z su zero. Scorri verso il basso nella direzione Z per misurare l'estensione della profondità della cella.

Quindi impostare le posizioni iniziale e finale nella finestra del microscopio di impostazione dell'acquisizione e regolare le tensioni PMT dello strumento e la potenza del laser nella finestra Z luminosa per ottimizzare la visualizzazione delle cellule in tutta la profondità del campo di imaging. Controllare i pulsanti di profondità e tempo e impostare un filtro comune per scansionare l'immagine tre volte per riga nella finestra della modalità filtro di controllo dell'acquisizione dell'immagine. Regolare la profondità della fetta Z nella finestra del microscopio di acquisizione immagini in modo che ci voglia circa un minuto per acquisire una pila completa, come indicato nella finestra di visualizzazione temporale.

Quindi, per valutare la stabilità del tessuto, impostare il numero di ripetizioni su cinque nella finestra di scansione del tempo di impostazione dell'acquisizione e fare clic sul pulsante di scansione per acquisire un'immagine time-lapse di cinque minuti dell'area. Se il tessuto è stabile dopo cinque minuti, impostare il numero di ripetizioni tra 30 e 45 nella finestra di scansione del tempo di impostazione dell'acquisizione e raccogliere un'immagine in time lapse da 30 a 45 minuti, monitorando eventuali lievi derive tissutali durante la raccolta dell'immagine. Salvare l'immagine pre-anticorpo nel formato appropriato, quindi aspirare la miscela di anticorpi in una siringa di tubercolina da un millilitro, avendo cura di rimuovere tutte le bolle d'aria.

Premere delicatamente lo stantuffo in modo che la soluzione anticorpale formi una gocciolina all'estremità dell'ago e sollevare le tende attorno al tavolino per individuare il catetere. Sostituire la siringa PBS con la siringa di anticorpi, quindi iniettare lentamente gli anticorpi nel catetere. Quando gli anticorpi sono stati iniettati con successo, abbassare nuovamente le tende e annotare il tempo di iniezione.

Quindi iniziare immediatamente a raccogliere una nuova sequenza di imaging da 20 a 40 minuti, nella stessa posizione, utilizzando le stesse impostazioni dello strumento dell'immagine pre-anticorpale. Infine, salvare il file dell'immagine post-anticorpo nel formato appropriato e rimuovere con cura il topo dal tavolino del microscopio, monitorando l'animale fino a quando non si è completamente ripreso. L'imaging del derma dell'orecchio intatto mediante questo protocollo facilita l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e time lapse della dinamica delle cellule T effettrici nel derma infiammato.

In questo filmato, le cellule T effettrici verdi trasferite in modo adottivo possono essere osservate muoversi in tutto il tessuto dermico. Dopo la somministrazione di anticorpi anti-anti-antagonista anti-entogrin antibeta 1 e anti-beta 3 attraverso il catetere, tuttavia, le cellule precedentemente mobili si arrestano all'interno del derma. Le cellule mostrano una diminuzione della velocità media dopo la somministrazione degli anticorpi e una significativa diminuzione del loro indice di serpeggiamento.

Cioè, il rapporto tra lo spostamento totale e la lunghezza totale del binario. Le autofluorescenti dei follicoli piliferi, le ombre e le autofluorescenti dei capelli sovrastanti e le bolle d'aria intrappolate tra la superficie dell'orecchio e il vetrino coprioggetti possono portare ad artefatti di imaging, che oscurano la visualizzazione delle cellule T e interferiscono con il software di analisi automatizzata delle immagini. Inoltre, l'utilizzo di più fonti di calore può causare problemi di stabilità dei tessuti, portando a grandi oscillazioni durante l'imaging che rendono difficile l'interpretazione dei risultati.

Una volta padroneggiato, l'imaging delle cellule T CD4 nel derma può essere completato in due o tre ore, se la procedura è stata eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire le linee guida appropriate per la cura e l'uso degli animali per lavorare con i topi. Questa procedura può essere adattata per visualizzare altri sottogruppi di cellule T o tipi di cellule immunitarie nell'orecchio, utilizzando diversi modelli di infezione o diversi metodi per indurre l'infiammazione.

Dopo il suo sviluppo, l'imaging intravitale ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia, per esplorare le dinamiche delle risposte immunitarie in corso negli animali viventi. Non dimenticare che lavorare con un laser multi-fosforo può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come un'adeguata schermatura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre l'infiammazione in un derma dell'orecchio di topo, come utilizzare l'imaging intravitale per acquisire le immagini in time lapse dell'attività delle cellule T CD4 prima e dopo la somministrazione di anticorpi.