Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

L'obiettivo generale di questo protocollo di imaging è visualizzare la dinamica delle cellule T positive per CD4 nella cute infiammata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio quali siano i meccanismi alla base della motilità e della funzione delle cellule immunitarie nei tessuti infiammati. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire un approccio minimamente invasivo per lo studio del comportamento dinamico delle cellule T CD4 in situ.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di preparazione dell'orecchio per l'acquisizione delle immagini sono difficili da apprendere e un posizionamento corretto dell'orecchio è necessario per ottenere immagini di alta qualità. Sono Alison Gaylo, studentessa laureanda, e mostrerò la dimostrazione di questo protocollo. Iniziare aspirando 300 microlitri di sospensione di cellule T effettrici marcate con fluorocromo per topo in una siringa dotata di un ago da 27 e mezzo.

Quindi ruotare la siringa con l'ago verso l'alto e battere delicatamente sul corpo della siringa, muovendo il pistone su e giù secondo necessità per rimuovere eventuali bolle d'aria. Quando le cellule sono pronte, trasferire i topi in una gabbia pulita e posizionarli sotto una lampada a calore finché le vene della coda non sono vasodilatate. Successivamente, trasferire il primo topo nel dispositivo di contenimento e pulire la coda con un tampone alcolico.

Dopo aver identificato una vena laterale della coda, iniettare lentamente 200 microlitri di cellule nella vena. Una volta trasferite tutte le cellule, aspirare 50 microlitri di emulsione di fluoresceina completa in una siringa per insulina da 28 e mezzo di calibro e premere con fermezza lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria di grandi dimensioni. Successivamente, indossare un ditalino sull'indice sinistro e afferrare con attenzione l'orecchio del topo tra il pollice sinistro e il ditalino, con l'orecchio rivolto in posizione ventrale verso l'alto.

Quindi inserire l'ago, con la faccia smussata rivolta verso l'alto, nel derma nel terzo esterno del padiglione auricolare, leggermente fuori centro, e iniettare lentamente dieci microlitri di emulsione nel tessuto. Dopo aver iniettato tutti gli animali, monitorare i topi fino a quando non si saranno completamente ripresi. Tre giorni dopo l'immunizzazione, vasodilatare le vene della coda degli animali iniettati come appena dimostrato.

Dopo l'anestesia, immobilizzare la coda del primo topo con un paio di pinze. Pulire la coda con un bastoncino imbevuto di alcol, quindi inserire con attenzione un catetere con ago da 30 e mezzo gauge in una vena laterale della coda, verificando la pervietà esercitando una leggera pressione sullo stantuffo della siringa. Una volta posizionato il catetere, applicare uno o due gocce di adesivo tissutale a base di cianoacrilato sul sito di iniezione e lasciare asciugare l'adesivo per circa 30 secondi.

Quindi utilizzare le forbici per tagliare con attenzione i vibrisse e i peli dalla parte posteriore e dai lati dell'orecchio. Successivamente, utilizzare un bastoncino di ovatta per inumidire la superficie interna dell'orecchio con PBS. Ruotare quindi il topo e appiattire l'orecchio iniettato su un coprioggetto di vetro da 24 per 50 millimetri, spessore numero 1,5, finché non sarà perfettamente aderente al vetro.

Eliminare l'eccesso di PBS. Quindi utilizzare due paia di pinze curve per afferrare un pezzo di nastro adesivo lungo circa 20 millimetri lungo i lati superiori agli angoli, e posizionare il bordo inferiore del nastro sul cover slip nella parte superiore dell'orecchio del mouse. Arrotolare il nastro sul resto dell'orecchio, spostando con le pinze l'eccesso di peli se necessario, e utilizzare un bastoncino di cotone asciutto per premere delicatamente il nastro intorno all'orecchio assicurando una chiusura ermetica, avendo cura di non premere sull'orecchio stesso.

È fondamentale che l’orecchio venga fissato correttamente al vetrino con un’aderenza ottimale su entrambi i lati e con il minor numero possibile di bolle d’aria, poiché ciò influirà sulla qualità delle immagini ottenibili. Fissare ora una piattaforma per microscopia fluorescente a un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius ed applicare grasso da vuoto su entrambi i lati della zona dell’orecchio della piattaforma. Ruotare il mouse per posizionare il vetrino sulla piattaforma, avendo cura di allineare l’orecchio al centro del feltro.

Quando l'orecchio è in posizione, agganciare il cono nasale per isoflurano nel supporto sulla piattaforma, assicurandosi che sia ben fissato e copra completamente il naso del topo. Quindi utilizzare un bastoncino di cotone per premere con fermezza ma con attenzione il vetrino sulla piattaforma di imaging, spargendo la grassa da vuoto al di sotto del vetrino. Avvolgere due pezzi di nastro da 20 millimetri e due pezzi più lunghi intorno alla parte superiore della piattaforma per fissare il vetrino alla piattaforma.

Successivamente, spostare il mouse sul tavolo del microscopio. Fissare la piattaforma con altro nastro e applicare un doppio strato di grasso da vuoto sul vetrino intorno all'orecchio. Quindi avvolgere una coperta riscaldata riempita d'acqua intorno al mouse e riempire il serbatoio del grasso da vuoto con acqua distillata a 37 gradi Celsius.

Per l'acquisizione temporale in vivo, iniziare posizionando l'obiettivo al centro dell'orecchio e abbassare l'obiettivo fino a quando non tocca appena la superficie dell'acqua nel serbatoio. Successivamente, utilizzando una sorgente luminosa esterna, abbassare lentamente l'obiettivo finché la superficie dell'orecchio non entra a fuoco. Quindi, abbassare le tende interne ed esterne intorno al piatto del microscopio e regolare la lunghezza d'onda del laser a 900 nanometri nella finestra del controllore del laser MP, la potenza del laser nella finestra delle impostazioni di acquisizione del laser e le tensioni del PMT nella finestra di controllo dell'acquisizione delle immagini.

Nelle finestre delle impostazioni di acquisizione relative a dimensione e modalità, impostare il microscopio su una risoluzione di cinquecentododici per cinquecentododici pixel, con un tempo di permanenza di due microsecondi per pixel, e selezionare la ripetizione XY per attivare una modalità di imaging in tempo reale per la scansione del tessuto. Una volta individuato un campo di imaging appropriato, individuare la cellula più alta nel derma e fare clic sul pulsante imposta zero per portare la posizione Z a zero. Scorrere verso il basso nella direzione Z per misurare l'estensione della profondità della cellula.

Quindi impostare le posizioni iniziale e finale nella finestra delle impostazioni di acquisizione del microscopio e regolare le tensioni del PMT e la potenza del laser nella finestra Z luminosa per ottimizzare la visualizzazione delle cellule lungo tutta la profondità del campo di imaging. Verificare i pulsanti di profondità e tempo e impostare un filtro comune per scansionare l'immagine tre volte per linea nella finestra della modalità di controllo dell'acquisizione immagine. Regolare la profondità della fetta Z nella finestra del microscopio di acquisizione immagine in modo che richieda circa un minuto per acquisire un'intera serie, come indicato nella finestra di visualizzazione del tempo.

Successivamente, per valutare la stabilità del tessuto, impostare il numero di ripetizioni a cinque nella finestra di acquisizione delle impostazioni di scansione temporizzata e fare clic sul pulsante di scansione per acquisire un'immagine a scansionamento temporale della durata di cinque minuti relativa all'area. Se il tessuto risulta stabile dopo cinque minuti, impostare il numero di ripetizioni tra 30 e 45 nella finestra di acquisizione delle impostazioni di scansione temporizzata e acquisire un'immagine a scansionamento temporale della durata compresa tra 30 e 45 minuti, monitorando eventuali lievi spostamenti del tessuto durante l'acquisizione dell'immagine. Salvare l'immagine pre-anticorpo nel formato appropriato, quindi aspirare la miscela di anticorpi in una siringa tubercolina da un millilitro, avendo cura di rimuovere tutte le bolle d'aria.

Premere delicatamente lo stantuffo in modo che la soluzione di anticorpi formi una goccia all'estremità dell'ago, quindi sollevare le tende intorno alla piastra per individuare il catetere. Sostituire la siringa di PBS con quella contenente l'anticorpo, quindi iniettare lentamente gli anticorpi nel catetere. Una volta completata l'iniezione degli anticorpi, abbassare nuovamente le tende e annotare l'ora dell'iniezione.

Quindi iniziare immediatamente a raccogliere una nuova sequenza di acquisizione di 20-40 minuti, nella stessa posizione, utilizzando le stesse impostazioni dello strumento dell'immagine pre-anticorpo. Infine, salvare il file dell'immagine post-anticorpo nel formato appropriato e rimuovere con attenzione il mouse dal piatto del microscopio, monitorando l'animale fino al completo recupero. L'acquisizione di immagini del derma auricolare intatto mediante questo protocollo facilita l'ottenimento di immagini ad alta risoluzione e in time-lapse della dinamica dei linfociti T effettrici nel derma infiammato.

In questo filmato, le cellule T effettrici verdi trasferite in modo adottivo possono essere osservate mentre si muovono attraverso il tessuto dermico. Dopo la somministrazione, tramite catetere, di anticorpi bloccanti anti-beta uno e anti-beta tre integrina, tuttavia, le cellule precedentemente mobili si arrestano all'interno del derma. Le cellule mostrano una velocità media ridotta dopo la somministrazione degli anticorpi, nonché una significativa diminuzione dell'indice di meandrazione.

Cioè, il rapporto tra lo spostamento totale e la lunghezza totale della traccia. Autofluorescenze dei follicoli piliferi, ombreggiature e autofluorescenze dei peli sovrastanti, nonché bolle d'aria intrappolate tra la superficie dell'orecchio e il vetrino, possono tutti causare artefatti di imaging, che ostacolano la visualizzazione delle cellule T e interferiscono con il software automatizzato di analisi delle immagini. Inoltre, l'uso di più fonti di calore può provocare problemi di stabilità del tessuto, portando a grandi oscillazioni durante l'acquisizione delle immagini che rendono difficile l'interpretazione dei risultati.

Una volta padroneggiata, l'acquisizione di immagini delle cellule T CD4 nel derma può essere completata in due o tre ore, a condizione che la procedura sia stata eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di seguire le appropriate linee guida per la cura e l'utilizzo degli animali nel lavoro con i topi. Questa procedura può essere adattata per visualizzare altri sottogruppi di cellule T o altri tipi di cellule immunitarie nell'orecchio, utilizzando diversi modelli di infezione o diversi metodi per indurre l'infiammazione.

Dopo il suo sviluppo, l'imaging intravitale ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia, permettendo di esplorare la dinamica delle risposte immunitarie in corso in animali vivi. Non dimenticare che lavorare con un laser a multi-fosforo può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come un adeguato schermaggio, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre infiammazione nel derma dell'orecchio di un topo, e di come utilizzare l'imaging intravitale per acquisire immagini in time-lapse dell'attività delle cellule T CD4 prima e dopo la somministrazione di anticorpi.