Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la formazione e l'organizzazione del fuso mitotico in cellule dopo l'abbattimento mediato da irna di proteine chiave associate ai MTOC, come la perrina. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia riproduttiva, come i meccanismi che regolano la segregazione dei cromosomi e le possibili alterazioni che portano all'aneuploidia in tutti i siti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un efficace silenziamento trascrizionale e un'analisi immunofluorescente specifica delle singole cellule.

Questa procedura può essere adattata anche per lo studio di quasi ogni proteina bersaglio. 48 ore prima del giorno di raccolta, trattare le topoline utilizzate per la raccolta degli ovociti con cinque unità internazionali di PMSG iniettate per via intraperitoneale. Dopo aver raccolto le ovaie utilizzando pratiche standard, trasferirle in una piastra contenente mezzo MEM preriscaldato ed equilibrato, integrato con BSA e mil reone, e procedere all'isolamento degli ovociti sotto un microscopio stereoscopico. Rilasciare i complessi citofollicolari o COC fissando un'ovaia al fondo della piastra di coltura mediante un ago da 27 gauge e utilizzare un secondo ago per punzare i follicoli antrali, seguendo la pratica standard di aspirazione degli ovociti o quella mediante pipetta a bocca.

Raccogliere gli oociti circondati da due o più strati di cellule del cumulo compatte. Trasferire questi COC in una nuova piastra con mezzo M-E-M-B-S-A mild reone e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Procedere quindi con la rimozione delle cellule del cumulo utilizzando metodi standard.

Preparare la piastra per l'iniezione con tre millilitri di mezzo M due contenente un microgrammo per millilitro di milone. Preparare inoltre le piastre per il lavaggio e la coltura con M-E-M-B-S-A milone. Successivamente, caricare cinque microlitri della soluzione di INA uno millimolare nella pipetta di iniezione e predisporla per la microiniezione.

Ora posizionare una goccia da 100 microlitri di mezzo M2 sul coperchio di una piastra da 3 centimetri. Caricare un oocita nella goccia e utilizzarlo per regolare la posizione della pipetta di ritenzione. Fissare il sito OAS collegandolo alla pipetta di ritenzione mediante pressione negativa.

Quindi regolare la posizione dell'ago di iniezione sul diametro più ampio dell'oocita. Una volta posizionato, iniettare circa 10 picolitri di soluzione nel citoplasma dell'oocita, evitando il nucleo. Riposizionare il coperchio sul piatto del microscopio stereoscopico e aggiungere 100 microlitri di mezzo M due fresco.

Mettere circa 10 cellule nel mezzo. Quindi, sulla piastra di microiniezione, procedere con la microiniezione. Fissare ogni oocita con la pipetta di ritenzione e inserire lentamente l'ago di iniezione nel citoplasma.

Iniettare la soluzione di S irna e ritirare con attenzione la pipetta di iniezione. Spostare le cellule iniettate con successo a un'estremità della goccia e quelle iniettate senza successo all'estremità opposta. Dovrebbero essere necessari solo pochi minuti per iniettare 10 cellule, il che è fondamentale per mantenere la loro vitalità.

Spostare il coperchio sul portatavola del microscopio stereoscopico e trasferire tutte le cellule correttamente iniettate in una piastra contenente M-E-M-B-S-A Mel mantenuta a 37 gradi Celsius. Trasferire le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con atmosfera di gas medico e incubare per 24 ore. Iniziare il rilascio delle cellule dal blocco di mil reone lavando le cellule tre volte in M-E-M-B-S-A.

Quindi trasferire le cellule nel mezzo di maturazione contenente coltura con 10% di FBS. Incubare le cellule per 17 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, la meiosi riprenderà.

Fissare le cellule. Utilizzare l'aspirazione con pipetta o la pipettaggio orale per trasferire rapidamente i diversi gruppi sperimentali nei pozzetti di piastre a quattro pozzetti contenenti 750 microlitri di PFA al 4% pre-riscaldata. Lasciare le cellule incubare per un'ora successivamente.

Lavare ogni gruppo tre volte con 750 microlitri di PBS riscaldato con 5% di FBS. Ogni lavaggio deve durare 15 minuti nell'incubatore; dopo il lavaggio, bloccare ogni gruppo di siti O in 5% di FBS in BS. Lasciare il blocco proseguire per tutta la notte a quattro gradi Celsius per l'immunomarcatura. Utilizzare una fila di otto pozzetti sulla piastra multipozzetto per ogni gruppo sperimentale di cellule.

4 piastre a 96 pozzetti caricano 200 microlitri di soluzione per pozzetto. Iniziare il processo di colorazione con una soluzione di anticorpo primario appena preparata. Quindi coprire i pozzetti con parafilm e incubare le cellule secondo le specifiche dell'anticorpo dopo l'aggiunta dell'anticorpo primario.

Lavare le cellule tre volte con PBS contenente FBS al 5% per 10-15 minuti per ogni lavaggio. Dopo i tre lavaggi, trasferire le cellule in una pozzetta contenente soluzione di anticorpo secondario. Coprire queste pozzette con parafilm.

Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi lavare tre volte come in precedenza. Dopo il lavaggio, trasferire gli oociti su vetrini di vetro puliti. Tutti gli oociti di un gruppo sperimentale vengono trasferiti su un singolo vetrino.

Aspirare qualsiasi soluzione in eccesso per immobilizzare le cellule e aggiungere immediatamente otto microlitri di dappy contenente il mezzo di montaggio. Quindi coprire, facendo scivolare con attenzione per evitare bolle d'aria o danni alle cellule. Dopo 17 ore di coltura, le cellule microiniettate con un RNA di controllo non specifico o con perrin irna avevano raggiunto per la maggior parte lo stadio di metafase II e presentavano fusi mitotici organizzati con cromosomi allineati. La marcatura di perrin, mostrata in rosso, era intensa e ben focalizzata ai poli del fuso.

I trascritti sono stati correttamente silenziati poiché la colorazione di Perrin non è stata rilevata nelle cellule iniettate con irna. La maggior parte di questi oociti è rimasta in metafase I e ha mostrato strutture del fuso disorganizzate con cromosomi non allineati. Alcuni sono progrediti alla metafase II, ma hanno comunque mostrato fusi alterati.

Ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come raccogliere e microiniettare citi di topo con specifici as irna e quindi eseguire una colorazione immunoistochimica su questi citi per l'analisi in fluorescenza della formazione e dell'organizzazione dello spinolo. È importante ricordare di lavorare con rapidità e grande attenzione per preservare la vitalità e la qualità dei citi.