Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare la formazione e l'organizzazione del fuso miotico nei citi in seguito alla deplezione mediata dall'irna di proteine chiave associate a MTOC come la perrina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riproduttiva, come i meccanismi che regolano la segregazione cromosomica e le potenziali interruzioni che portano ad aneuploidie in tutti i siti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si traduce in un'efficiente analisi di trascritto, knockdown e immunofluorescenza specifica dei singoli citi.

Questa procedura può anche essere adattata per studiare quasi tutte le proteine bersaglio 48 ore prima del giorno di raccolta: trattare: i topi femmina utilizzati per la raccolta degli ovociti con cinque unità internazionali di PMSG iniettato intraperitoneale dopo aver raccolto le ovaie utilizzando le pratiche standard. Trasferire in un piatto di terreno MEM bilanciato preriscaldato integrato con BSA e mil reone e preparare a isolare i citi al microscopio da dissezione. Rilasciare i complessi di citi cumuliformi o COC fissando un'ovaia sul fondo del piatto di coltura utilizzando un ago calibro 27 e utilizzare un secondo ago per perforare i follicoli antrali utilizzando l'aspirazione di ovociti o la pratica standard di pipettaggio orale.

Raccogliere gli ovociti circondati da due o più strati di cellule cumuliformi compatte. Trasferisci questi COC in un nuovo piatto con M-E-M-B-S-A reone delicato e incubali per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi procedere con la denudazione dei citi utilizzando metodi standard.

Preparare la piastra di coltura per iniezione con tre millilitri di M due terreni con un microgrammo per millilitro di milone. Preparare anche il lavaggio e la coltura dei piatti con M-E-M-B-S-A milone. Successivamente, caricare cinque microlitri della soluzione di INA millimolare nell'ago per iniezione e prepararlo per la micro iniezione.

Ora metti una goccia da 100 microlitri di terreno M two sul coperchio di un piatto da tre centimetri. Caricare un ovocita nella goccia e utilizzarlo per regolare la posizione della pipetta di mantenimento. Fissare il sito OAS collegandolo alla pipetta di contenimento utilizzando una pressione negativa.

Quindi regolare la posizione dell'ago per iniezione sul diametro più largo dell'ovocita. Una volta posizionato, iniettare circa 10 picolitri di soluzione nel citoplasma dell'ovocita, evitando il nucleo. Rimettere il coperchio sul tavolino dello stereomicroscopio e aggiungere 100 microlitri di terreno M two fresco.

Inserire circa 10 citi nel terreno. Quindi, nella fase di micro iniezione, procedere con la micro iniezione. Fissare ogni ovocita con la pipetta di contenimento e inserire lentamente l'ago per iniezione nel citoplasma.

Iniettare la soluzione di S irna e ritrarre con cautela la pipetta per iniezione. Sposta i citi iniettati con successo su un'estremità della goccia e sposta i citi iniettati senza successo all'estremità opposta della goccia. Dovrebbero essere necessari solo pochi minuti per iniettare 10 citi, il che è fondamentale per mantenere la loro vitalità.

Spostare il coperchio sul tavolino dello stereomicroscopio e trasferire tutte le cellule iniettate con successo in una capsula di M-E-M-B-S-A Mel nota a 37 gradi Celsius. Trasferire i citi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con atmosfera di gas medicale e incubare per 24 ore. Inizia con il rilascio dei citi dal blocco mil reone lavando le cellule tre volte in M-E-M-B-S-A.

Quindi trasferire i citi in un terreno di maturazione contenente il 10% di coltura FBS. Le celle per 17 ore a 37 gradi Celsius. Quindi la meiosi riprenderà il giorno successivo.

Correggi i citi. Utilizzare l'aspirazione di citi o il pipettaggio orale per spostare rapidamente i diversi gruppi sperimentali in pozzetti di piastre a quattro pozzetti contenenti 750 microlitri di preriscaldamento al 4% di PFA. Lascia incubare i citi per un'ora dopo.

Lavare ogni gruppo tre volte con 750 microlitri di PBS riscaldato con il 5% di FBS. Ogni lavaggio deve durare 15 minuti nell'incubatrice, dopo il lavaggio bloccare ciascun gruppo di siti O in 5% FBS in BS. Lasciare che il blocco continui per una notte a quattro gradi Celsius per immunocolorare. Utilizzare una fila di otto pozzetti sulla piastra a più pozzetti per ogni gruppo sperimentale di citi.

4 piastre da 96 pozzetti caricano 200 microlitri di soluzione per pozzetto. Iniziare il processo di colorazione con la soluzione di anticorpi primari appena preparata. Quindi coprire i pozzetti con param e incubare i citi secondo le specifiche anticorpali seguendo l'anticorpo primario.

Lavare i citi tre volte con il 5% di FBS in PBS per 10-15 minuti per lavaggio. Dopo tre lavaggi, trasferire i citi in un pozzetto di soluzione di anticorpi secondari. Copri questi pozzetti con paraforma.

Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius e poi lavare tre volte come prima. Una volta lavati, trasferire gli ovociti su vetrini puliti. Tutti gli ovociti di un gruppo sperimentale vengono trasferiti su un unico vetrino.

Aspirare la soluzione in eccesso per immobilizzare le cellule e aggiungere immediatamente otto microlitri di dappy contenente terreno di montaggio. Quindi coprire, farli scivolare con cura per evitare bolle d'aria o danni ai citi I citi sono stati microiniettati con un controllo aspecifico o perrin irna dopo 17 ore di coltura, la maggior parte dei controlli ha raggiunto la metafase due e conteneva fusi miotici organizzati con cromosomi allineati. L'etichettatura Perrin mostrata in rosso era luminosa e focalizzata sui poli del fuso.

I trascritti sono stati eliminati con successo poiché la colorazione della perrina nelle cellule iniettate con irna non è stata rilevata. La maggior parte di questi ovociti è rimasta nella metafase uno e ha mostrato strutture di fusi disorganizzate con cromosomi disallineati. Alcuni sono passati alla metafase due, ma hanno anche mostrato fusi interrotti.

Ora dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere e microiniettare citi di topo con specifici come irna e quindi colorare immuno questi citi per l'analisi della fluorescenza della formazione e dell'organizzazione dello spin. È importante ricordarsi di lavorare rapidamente e con grande cura per preservare la vitalità e la qualità dell'oside.