Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia
30 gennaio 2016
Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.
L'obiettivo generale di questa procedura è aiutare gli utenti a stabilire una pipeline ad alto rendimento per la raccolta e l'elaborazione della tomografia elettronica criogenica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della tomografia elettronica criogenica, come ad esempio: come gestire i dati raccolti con rivelatori di nuova generazione ed elaborare una grande quantità di dati prodotti da software automatizzati per la raccolta di serie di inclinazioni? Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità per l'utente di configurare più pacchetti software in modo integrato, al fine di individuare una pipeline efficiente per l'elaborazione automatizzata delle serie di inclinazioni, consentendo di dedicare più tempo all'analisi dei tomogrammi.
Generalmente, le persone nuove nel campo della tomografia elettronica criogenica incontrano difficoltà perché sono richiesti molti passaggi laboriosi per gestire i dati massicci generati dal microscopio elettronico. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo sviluppo cinque anni fa, quando dovevamo eseguire manualmente centinaia di passaggi per ottenere una ricostruzione tridimensionale di un singolo batterio. In anticipo, consultare il protocollo scritto sulla preparazione dei minicellule di Shigella flexneri.
Quindi, preparare le griglie per microscopia elettronica come spiegato in una pubblicazione esistente di JoVE e documentato anche nel protocollo testuale. Dopo aver caricato lo stadio EM con il campione di minicelle inglobate nel ghiaccio vitrificato, iniziare ad acquisire mappe a basso ingrandimento per la serie di inclinazioni. Mentre si osserva lo schermo fluorescente a basso ingrandimento, circa 2300x, individuare i quadrati della griglia adatti all'acquisizione delle immagini.
Questa posizione dovrebbe contenere ghiaccio sottile e l'oggetto di interesse, senza contaminanti. Successivamente, regolare la visualizzazione al centro del quadratino della griglia e fare clic sul pulsante Aggiungi Posizione della Piastra per salvare la posizione. Ripetere quindi il processo fino a quando non sono state salvate le posizioni di tutti i quadratini della griglia accettabili.
Il passo successivo inizia con l'apertura di un nuovo file di montaggio. Nella finestra di configurazione, impostare X e Y in modo da catturare l'intero quadrato della griglia. Per una griglia standard da 200 mesh, creare uno spazio 10 per 10 con un valore di Binning elevato, ad esempio otto.
Attiva anche lo spostamento della piattaforma anziché l'opzione di traslazione dell'immagine e l'opzione di salto delle correlazioni utilizzate per allineare i frammenti. Ora, nella finestra di Navigator, selezionare la prima posizione della piattaforma da acquisire utilizzando l'interruttore Acquisisci. Proseguire così per ogni posizione della piattaforma.
Successivamente, nel menu Navigatore, fare clic su Acquisisci nei punti. Nella finestra di dialogo che si apre, attivare l'acquisizione dell'immagine della mappa e della eucentricità approssimativa. Disattivare tutte le altre opzioni.
Quindi, fare clic su "procedi" e verrà creata una montatura per ogni posizione della fase. Continuare a lavorare con il software SerialEM. Navigare nel pannello di navigazione, selezionare le mappe acquisite e fare clic su "Carica mappa".
Quindi, fare clic su Aggiungi Punti e selezionare i punti sulla mappa in cui deve essere acquisita la serie di inclinazioni. Dopo aver effettuato le selezioni, fare clic su Interrompi Aggiunta Punti e ripetere il processo per ciascuna mappa raccolta. Successivamente, aprire i parametri nel menu della fotocamera e impostare le modalità Focusing, Trial e Registrazione.
L'opzione di registrare dati frazionati per dose può essere particolarmente interessante e può essere specificata nelle opzioni di registrazione. Per procedere, selezionare uno dei punti nella mappa attualmente visualizzata e attivare l'opzione serie di inclinazioni nella finestra di navigazione. Nella finestra di dialogo che si apre, scegliere i parametri per la serie di inclinazioni.
Quindi, ripetere il processo di attivazione dell'opzione serie di inclinazione per ciascuno dei punti selezionati nella mappa. Successivamente, dal Navigator avviare l'opzione Acquisizione ai Punti. Nella finestra di dialogo, attivare le operazioni preliminari, la riallineamento all'elemento, l'autofocus e l'eucentricità approssimativa.
Quindi, impostare l'Attività Principale sull'acquisizione di una serie di inclinazioni e selezionare "chiudi colonna alla fine" per chiudere la colonna una volta raccolti tutti i punti. Quando il processo viene eseguito, verrà acquisita una serie di inclinazioni in ciascun punto abilitato per la raccolta della serie di inclinazioni in ogni mappa. Con la serie originale di inclinazioni, il registro di output di SerialEM e le singole immagini frazionate per dose nella directory di lavoro corrente, eseguire da terminale il seguente comando per rimuovere l'artefatto dovuto al movimento indotto dal fascio.
Procedere con l'allineamento e la ricostruzione della serie di inclinazioni. Digitare il comando tomoauto nel terminale come segue. Al comando, aggiungere il nome del file della serie di inclinazioni da elaborare, seguito dal diametro del marcatore fiduciale in nanometri.
Se l'elaborazione CTF non è desiderata, è sufficiente omettere l'opzione dal comando. Questo comando rappresenta l'uso principale di tomoauto, consentendo agli utenti di eseguire tutti i processi coinvolti nell'allineamento di una serie di inclinazioni, che in origine richiedevano intervento manuale da parte dell'utente, con un singolo comando, permettendo così di creare rapidamente script per l'elaborazione in batch. Ora, utilizzando il comando 3dmod, esaminare la serie di inclinazioni allineata alla ricerca di eventuali errori evidenti.
Qui, filename è il nome della serie di inclinazione senza suffisso. Successivamente, esaminare la CTF stimata con il comando mostrato qui. Ancora una volta, filename è il nome della serie di inclinazione senza suffisso.
Inoltre, nel registro di output prodotto dal comando tomoauto, verificare l'errore residuo dell'allineamento. Questa è una misura quantitativa della qualità complessiva dell'allineamento. Se l'allineamento è accettabile, procedere con il calcolo della ricostruzione.
Questo comando è impostato per correggere il CTF ed eliminare i marcatori fiduciali utilizzati nell'allineamento dalla serie di tilt. Per saltare l'ispezione visiva e passare direttamente alla ricostruzione, utilizzare questo comando. Tomoauto offre numerose opzioni accessibili.
Una in particolare è la possibilità di includere configurazioni locali descritte da un file ausiliario, secondo la documentazione di tomoauto. Includere il nome di questo file nella finestra di dialogo della riga di comando utilizzando l'opzione di configurazione locale prima di aggiungere il nome del file della serie di tilt. La possibilità di creare file di configurazione locale è la funzionalità più potente di tomoauto, che consente agli utenti di configurare completamente ogni comando utilizzato, ottimizzando l'esecuzione per set di dati specifici o complessi pur mantenendo l'elaborazione automatizzata.
All'interno del protocollo di prova sono presenti ulteriori istruzioni su come eseguire la media dei sottotomogrammi. Seguendo i protocolli descritti, sono state ottenute due serie di inclinazione allineate utilizzando tomoauto. L'allineamento fine viene calcolato a partire da un modello che idealmente definisce le coordinate dei marcatori fiduciali.
A 50 gradi, una serie di inclinazioni ha tracciato correttamente le particelle d'oro, indicando un allineamento accettabile. Nel caso della seconda serie di inclinazioni, invece, diversi punti del modello, mostrati in rosso, si sono discostati dal rispettivo marcatore d'oro, dimostrando che il modello non ha prodotto un allineamento adeguato. Quando vengono acquisite le serie di inclinazioni, tomoauto riesce ad allineare con successo dall'80 al 90% delle serie acquisite.
Dopo la ricostruzione, il tomogramma finale è un volume tridimensionale del campione di immagine. Questo può quindi essere utilizzato per l'annotazione cellulare mediante segmentazione, oppure per l'analisi mediante media dei sotto-tomogrammi al fine di ottenere informazioni con risoluzione maggiore sui meccanismi molecolari presenti nel campione. La media dei sotto-tomogrammi a 2,7 nanometri di Shigella flexneri depositata nell'EMDB mostra il notevole miglioramento offerto da questa tecnica rispetto alla visualizzazione dell'injectisoma in un singolo tomogramma.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come raccogliere ed elaborare dati di tomografia crioelettronica utilizzando SerialEM e tomoauto in modo automatizzato e ad alta produttività. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per raccogliere quasi 100 serie di inclinazioni in un giorno, se eseguita correttamente, e allineare una serie di inclinazioni in 20 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di controllare sempre la qualità dell'allineamento delle serie di inclinazioni.
Se un insieme di serie di inclinazione non si allinea correttamente, provare ad allinearlo manualmente e trasferire i parametri a una configurazione locale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la media dei sotto-tomogrammi, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio determinare la struttura ad alta risoluzione di complessi macro-molecolari. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della criomicroscopia elettronica per esplorare strutture ad alta risoluzione in situ in batteri, virus e altri organismi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo ad alto rendimento di tomografia crioelettronica per determinare strutture in situ ad alta risoluzione di macromolecole complesse. Semplifica l'elaborazione dei dati, riduce al minimo i colli di bottiglia e diminuisce i tempi di inattività delle risorse, consentendo ai ricercatori di concentrarsi su questioni biologiche significative.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Tomografia crioelettronica
- Biologia molecolare
- Biologia strutturale
Sfondo
- Pipeline ad alta capacità per la raccolta e l'elaborazione di dati in tomografia crioelettronica.
- Sfide nella gestione dei dati provenienti da detector di nuova generazione.
- Necessità di un'elaborazione efficiente di grandi set di dati ottenuti mediante acquisizione automatizzata di serie di inclinazione.
- Contesto storico della gestione manuale dei dati in criotomografia elettronica.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo semplificato per la tomografia crioelettronica.
- Facilitare l'elaborazione automatica dei dati delle serie di inclinazione.
- Migliorare l'efficienza dell'analisi dei tomogrammi.
Metodi Utilizzati
- Protocollo ad alto rendimento di tomografia crioelettronica.
- Configurazione di pacchetti software multipli per l'elaborazione dei dati.
- Tecniche automatizzate di acquisizione di serie di inclinazione.
- Preparazione di minicelle di Shigella flexneri per l'analisi.
Risultati principali
- Riduzione dei passaggi noiosi richiesti per la gestione dei dati.
- Miglioramento dell'efficienza nell'elaborazione di grandi set di dati.
- Maggiore concentrazione sulle domande biologiche grazie a un flusso di lavoro semplificato.
- Applicazione con successo del protocollo nella generazione di ricostruzioni 3D.
Conclusioni
- Il protocollo semplifica in modo significativo il processo di tomografia crioelettronica.
- Permette ai ricercatori di dedicare più tempo all'analisi piuttosto che all'elaborazione dei dati.
- Applicazioni future potrebbero migliorare ulteriormente la nostra comprensione delle macchine molecolari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tomografia crioelettronica ad alto rendimento affronta il collo di bottiglia nell'elaborazione dei dati in biologia strutturale, consentendo una rapida generazione di complessi macromolecolari tridimensionali in contesti cellulari nativi. Automatizzando l'acquisizione e l'allineamento delle serie di inclinazione, il metodo riduce l'intervento manuale e accelera i flussi di lavoro di validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta. Ciò supporta una maggiore affidabilità predittiva nella riduzione del rischio meccanicistica per programmi mirati ad antimicrobici e fattori di virulenza.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la visualizzazione di macromolecole intatte, come i sistemi di secrezione di tipo III, in stati quasi nativi per l'analisi funzionale delle proteine bersaglio.
- Valore operativo: Riduce il tempo dedicato alla gestione manuale dei dati, permettendo agli scienziati di concentrarsi sui test delle ipotesi biologiche anziché sugli ostacoli legati all'elaborazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce medie di sottotomogrammi che migliorano il contrasto e la risoluzione per una fenotipizzazione strutturale affidabile dei bersagli farmacologici.
- Valore operativo: Standardizza la raccolta e l'elaborazione dei dati mediante tomoauto, consentendo output riproducibili su grandi set di dati per la prontezza del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce ricostruzioni tridimensionali a una risoluzione di circa 2,7 nm per supportare la comprensione meccanicistica dei complessi di virulenza in sistemi rilevanti per le malattie.
- Valore operativo: Facilita la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica generando dati strutturali quantificabili per la priorizzazione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino all'ottimizzazione del composto leader, fornendo informazioni strutturali ad alta risoluzione su complessi macromolecolari in situ.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione di assemblaggi macromolecolari in ambienti cellulari nativi.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso l'elaborazione automatizzata di serie di inclinazione e metriche quantitative della qualità dell'allineamento.
- Analisi: Fornisce misurazioni degli errori residui provenienti dai log di output di tomoauto come indicatori oggettivi della qualità dell'allineamento per decisioni basate sui dati.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati strutturali al progresso preclinico risolvendo complessi in stati mutanti o condizionati per la progettazione guidata dalla struttura.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una pipeline riutilizzabile e configurabile tramite file di configurazione locali in tomoauto per un'applicazione coerente su bersagli e set di dati diversi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante imaging in situ ad alta risoluzione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità, consentendo quasi 100 serie di inclinazione al giorno e l'allineamento in circa 20 minuti per serie.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo dati strutturali affidabili già nelle fasi iniziali del processo di scoperta, riducendo i rischi biologici tardivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base a stati strutturali risolvibili e dinamiche complesse, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia elettronica criogenica, nell'uso di SerialEM e nell'elaborazione da riga di comando di tomoauto.
- È dipendente da un microscopio elettronico criogenico a 300 kV dotato di telecamera a rilevamento diretto e di un'infrastruttura computazionale per l'allineamento e la ricostruzione delle serie di inclinazione.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione delle griglie, la denominazione dei dati e i file di configurazione locali, al fine di garantire un'elaborazione coerente.
- Comporta la necessità di adattamenti in relazione allo spessore del ghiaccio, alla contaminazione del campione e all'etichettatura dei marcatori fiduciali nei diversi sistemi modello.
- Comprende limitazioni pratiche, come tassi di successo nell'allineamento dell'80–90% per le serie di inclinazione raccolte, con la necessità di interventi manuali nei casi di fallimento.
