Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

L'obiettivo generale di questa procedura è aiutare gli utenti a stabilire una pipeline di raccolta ed elaborazione ad alto rendimento della tomografia crioelettronica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della crio-tomorgrafia elettronica, come ad esempio: come posso gestire i dati raccolti con i rivelatori di nuova generazione ed elaborare un'enorme quantità di dati prodotti dal software di raccolta automatizzata tilt-series? Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'utente può configurare più pacchetti software in modo unificante, per trovare una pipeline efficiente per l'elaborazione automatizzata delle serie di inclinazione, consentendo di dedicare più tempo all'analisi del tomogramma.

In generale, le persone che non conoscono la crio-ET avranno difficoltà perché sono necessari molti passaggi noiosi per gestire enormi dati generati dal microscopio elettronico. Abbiamo avuto l'idea di questo sviluppo per la prima volta cinque anni fa, quando abbiamo dovuto passare manualmente attraverso centinaia di passaggi per ottenere una ricostruzione 3D di un batterio. Consultare preventivamente il protocollo testuale sulla preparazione delle minicelle di Shigella flexneri.

Quindi, preparare le griglie di microscopia elettronica come spiegato da una pubblicazione JoVE esistente e documentato anche nel protocollo di testo. Dopo aver caricato lo stadio EM con la raccolta di minicelle incorporate nel ghiaccio vetrificato, iniziare a raccogliere mappe a basso ingrandimento per la serie tilt. Durante la visualizzazione dello schermo fluorescente a basso ingrandimento, di circa 2300x, trovare quadrati della griglia accettabili per l'immagine.

Questa posizione dovrebbe contenere ghiaccio sottile e l'oggetto di interesse senza contaminanti. Quindi, regola la vista al centro del quadrato della griglia e fai clic sul pulsante Aggiungi posizione sul palco per salvare la posizione. Quindi, ripeti il processo fino a quando tutti i quadrati della griglia accettabili non hanno salvato la loro posizione.

Il passo successivo inizia con l'apertura di un nuovo file di montaggio. Nella finestra di dialogo di configurazione, impostare X e Y in modo che venga catturato l'intero quadrato della griglia. Per una griglia standard da 200 mesh, crea uno spazio 10 per 10 con un valore di Binning elevato, ad esempio otto.

Attiva anche la fase di spostamento invece dell'opzione di spostamento dell'immagine e l'opzione di salto delle correlazioni utilizzate per allineare i pezzi. Ora, nella finestra Navigatore, selezionare la prima posizione dello stadio da acquisire utilizzando l'interruttore Acquisisci. Continuare a farlo per ogni posizione del palco.

Successivamente, nel menu Navigatore, fai clic su Acquisisci in punti. Nella finestra di dialogo che si apre, attiva l'acquisizione dell'immagine della mappa e l'eucentricità approssimativa. Disattiva tutte le altre opzioni.

Quindi, fare clic su Procedi e verrà effettuato un montaggio per ogni posizione del palco. Continuate a lavorare con il software SerialEM. Nel Navigatore, selezionare le mappe acquisite e fare clic su Carica mappa.

Quindi, fai clic su Aggiungi punti e seleziona i punti sulla mappa in cui deve essere acquisita la serie di inclinazioni. Dopo aver effettuato le selezioni, fare clic su Interrompi aggiunta punti e ripetere il processo con ogni mappa raccolta. Quindi, apri i parametri nel menu Fotocamera e imposta le modalità Messa a fuoco, Prova e Registrazione.

L'opzione per registrare i dati frazionati in base alla dose può essere di particolare interesse e può essere specificata nella sezione Opzioni di registrazione. Per procedere, selezionare uno dei punti nella mappa attualmente visualizzata e attivare l'opzione di inclinazione della serie nella finestra del Navigatore. Nella finestra di dialogo che si apre, scegli i parametri per la serie tilt.

Quindi, ripeti il processo di attivazione dell'opzione tilt-series per ciascuno dei punti selezionati nella mappa. Successivamente, dal Navigatore avviare l'opzione Acquisisci ai punti. Nella finestra di dialogo, attiva o disattiva le attività preliminari, Riallinea all'elemento, Messa a fuoco automatica ed Eucentricità approssimativa.

Quindi, imposta l'attività principale per acquisire la serie di inclinazione e scegli chiudi i valori della colonna alla fine per chiudere la colonna quando tutti i punti sono stati raccolti. Quando il processo viene eseguito, verrà raccolta una serie di tilt in ogni punto attivato per la raccolta delle serie di tilt in ogni mappa. Con la serie tilt originale, il registro di output da SerialEM e le singole immagini frazionate a dose tutte nella directory di lavoro corrente, in un terminale, eseguire il seguente comando per rimuovere l'artefatto di movimento indotto dal raggio.

Procedere con l'allineamento e la ricostruzione della serie inclinabile. Digita il comando tomoauto nel terminale come segue. Al comando, aggiungere il nome del file della serie tilt da elaborare, seguito dal diametro fiduciale in nanometri.

Se l'elaborazione CTF non è desiderata, è sufficiente omettere l'opzione dal comando. Questo comando è l'uso principale di tomoauto, che consente agli utenti di eseguire tutti i processi coinvolti nell'allineamento di una serie di inclinazione, che originariamente richiedeva l'intervento manuale dell'utente, in un unico comando, consentendo agli utenti di eseguire rapidamente script per l'elaborazione batch. Ora, utilizzando il comando 3dmod, esaminare la serie di inclinazione allineata per eventuali errori evidenti.

Qui filename è il nome della serie tilt senza suffisso. Quindi, ispezionare il CTF stimato con il comando mostrato qui. Ancora una volta, filename è il nome della serie tilt senza suffisso.

Inoltre, nel log di output prodotto dal comando tomoauto, verificare l'errore residuo dell'allineamento. Si tratta di una misura quantitativa della qualità complessiva dell'allineamento. Se l'allineamento è accettabile, procedere con il calcolo della ricostruzione.

Questo comando è impostato per correggere il CTF e cancellare i marcatori fiduciali utilizzati nell'allineamento dalla serie tilt. Per saltare l'ispezione visiva e passare direttamente alla ricostruzione, utilizzare questo comando. Tomoauto ha molte opzioni accessibili.

Uno in particolare è la possibilità di includere le configurazioni locali descritte da un file ausiliario, secondo la documentazione di tomoauto. Includi il nome di questo file nella finestra di dialogo della riga di comando utilizzando l'opzione di configurazione locale prima di aggiungere il nome del file tilt-series. La possibilità di creare file di configurazione locali è la caratteristica più potente di tomoauto, che consente agli utenti di configurare completamente ogni comando utilizzato, ottimizzando l'esecuzione su set di dati specifici o difficili mantenendo l'elaborazione automatizzata.

All'interno del protocollo di test ci sono ulteriori istruzioni su come eseguire la media del sottotomogramma. Seguendo i protocolli descritti, sono state realizzate due serie di inclinazione allineate con tomoauto. L'allineamento fine viene calcolato da un modello che definisce idealmente le coordinate del fiducial marker.

A 50 gradi, una serie di inclinazioni ha tracciato correttamente le particelle d'oro, indicando un allineamento accettabile. Mentre, nel caso della seconda serie inclinabile, diversi punti del modello, mostrati in rosso, si sono allontanati dal corrispondente indicatore d'oro, illustrando il modello non ha prodotto un allineamento adeguato. Quando vengono raccolte le serie di inclinazione, tomoauto allinea con successo dall'80 al 90% delle serie di inclinazione raccolte.

Dopo la ricostruzione, il tomogramma finale è un volume 3D del campione di immagine. Questo può quindi essere utilizzato per l'annotazione cellulare mediante segmentazione o media del sottotomogramma per ottenere informazioni a risoluzione più elevata del macchinario molecolare all'interno del campione. La media di 2,7 nanometri al sub-tomogramma della Shigella flexneri attaccata depositata nell'EMDB mostra il grande miglioramento di questa tecnica rispetto alla visualizzazione dell'iniettioma in un singolo tomogramma.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere ed elaborare i dati della tomografia crioelettronica utilizzando SerialEM e tomoauto in modo automatizzato e ad alto rendimento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per raccogliere quasi 100 serie di tilt in un giorno, se eseguita correttamente, e allineare una serie di tilt in 20 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di controllare sempre la qualità dell'allineamento della serie di inclinazione.

Se un insieme di serie tilt non si allinea bene, provare ad allineare manualmente e trasferire i parametri in una configurazione locale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la media del sottotomogramma per rispondere a ulteriori domande, come determinare la struttura a risoluzione più elevata dei complessi macromolecolari. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della crio-EM per esplorare strutture in situ ad alta risoluzione in batteri, virus e altri organismi.