Bioluminescenza-Based Metodo Tumore quantificazione per il monitoraggio del tumore Progressione e gli effetti del trattamento in modelli murini linfoma

L'obiettivo generale di questa procedura di imaging è standardizzare le procedure di acquisizione della bioluminescenza e le analisi delle immagini per ottenere dati quantitativi utili per confronti all'interno o tra diversi esperimenti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'imaging bioluminescente, ad esempio: come possono i dati di imaging essere quantificati in modo riproducibile? I principali vantaggi di questa tecnica sono la facilità di implementazione in qualsiasi struttura per animali dotata di un sistema di imaging bioluminescente e l'assenza di necessità di calcoli complessi.

Accendere l'imager e aprire il software di acquisizione. Fare clic su Inizializza per inizializzare la fotocamera, i piatti e le lenti. Dopo aver confermato il livello appropriato di sedazione mediante l'assenza di risposta alla pinzatura della zampa, posizionare un topo su un tappetino riscaldante e applicare un unguento oculare.

Quindi, utilizzare un ago da 25 gauge per iniettare 100 microlitri di soluzione di sale potassico di D-Luciferina appena preparata per via intraperitoneale. In questo caso, le cellule tumorali esprimono la luciferasi della lucciola. Questa proteina ossida la D-Luciferina e produce luce che può essere rilevata mediante l'imager.

Dopo 10 minuti, posizionare il topo, in posizione prona, all'interno dell'imager con la schiena rivolta verso la telecamera, nella posizione più piatta possibile. Selezionare la funzione di esposizione automatica e fare clic su Acquisisci per ottenere un'immagine posteriore dell'animale. Successivamente, posizionare il topo in posizione supina, allargando gli arti anteriori in modo che non ostruiscano il torace.

Verificare che la casella di controllo dell'esposizione automatica sia ancora selezionata ed acquisire un'immagine anteriore dell'animale. Successivamente, riportare il topo sul tappetino riscaldante fino al completo recupero; a questo punto, l'animale può essere restituito nella sua gabbia. Per quantificare la bioluminescenza, fare clic su Visualizza nel menu e selezionare la Tavolozza degli strumenti se non è già visualizzata.

Successivamente, fare clic sulla scheda dello strumento per la regione di interesse, scegliere il pulsante contorno e selezionare Disegno Libero. Utilizzando lo strumento Disegno Libero, seguire i bordi dell'intero topo o di un'area specifica nell'immagine della vista frontale per delimitare la regione di interesse, facendo clic con il tasto destro per chiudere il contorno. Selezionare Radiance nel menu a scorrimento Unità in alto a sinistra dell'immagine, qualora non fosse già selezionato.

Successivamente, leggere il valore nella casella Flusso totale di fotoni al secondo per misurare il flusso di fotoni. Quindi, fare clic sul menu Visualizza e sulle misurazioni della regione di interesse. Dopo aver ripetuto l'analisi per l'immagine della vista posteriore, sommare i valori del flusso di fotoni ottenuti per entrambe le viste per ottenere il luminoscore.

In questo esperimento, il tumore era rilevabile già 10 minuti dopo l'iniezione. Le immagini da sole confermano che le cellule tumorali sono presenti nella posizione corretta. Tuttavia, la quantificazione della bioluminescenza ha dimostrato una chiara differenza tra gli animali che hanno ricevuto le iniezioni e quelli che non le hanno ricevute.

È interessante notare che il segnale ottenuto nel modello sottocutaneo era 100 volte più alto rispetto a quello del modello di linfoma intraoculare primitivo, in accordo con il numero di cellule iniettate. Qui, le immagini rappresentative della crescita tumorale nei topi con linfoma intraoculare primitivo nei gruppi di controllo e trattati con CpG dimostrano che, dopo un periodo sufficiente, nel gruppo di controllo iniziano a comparire metastasi. Sebbene il tumore primario non sia apparso sensibile al trattamento, nel gruppo trattato con CpG sono state osservate meno metastasi.

In effetti, l'analisi quantitativa del carico tumorale in ciascun gruppo dimostra che il CpG rallenta lo sviluppo del tumore, producendo una differenza statisticamente significativa nella luminiscenza tumorale tra i gruppi trattato e di controllo dopo 28 giorni. In questo modello sottocutaneo, due tumori sono stati innestati su ciascun lato del topo, con il trattamento somministrato in loco a un solo lato al giorno zero e il tumore controlaterale utilizzato come controllo. Successivamente, sono state definite due regioni di interesse per ogni topo e calcolato il rapporto tra il punteggio luminoso del lato trattato e quello del lato di controllo.

13 giorni dopo la somministrazione del trattamento, si è osservata una significativa riduzione del rapporto luminoscore, a dimostrazione che il tumore trattato è stato riassorbito, come ulteriormente evidenziato dalle corrispondenti immagini di bioluminescenza. Una volta somministrato, questo tipo di analisi può essere completato in due minuti per animale, se eseguito correttamente. A seguito di questa procedura, altri metodi, come la localizzazione qualitativa del sito tumorale, possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande riguardo i meccanismi di localizzazione cellulare o di metastatizzazione tumorale.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori e al campo dell'imaging bioluminescente per esplorare la progressione tumorale in modelli preclinici di piccoli animali. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging bioluminescente per quantificare il carico tumorale in modo riproducibile. Non dimenticate che lavorare con piccoli animali e strumenti chirurgici può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come la corretta sterilizzazione degli strumenti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.