Name: La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche In Vivo e Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Impara la rilevazione immunoistochimica della proteina c-FOS per valutare l'attività neuronale nei tessuti cerebrali. Questo metodo identifica le popolazioni neuronali coinvolte nelle risposte fisiologiche specifiche.

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L'Università Paris 13 ha sostenuto questo lavoro. L'ASPT è stata sostenuta da una borsa di studio dell'Università Paris 13 e dalla "Association Française pour le Syndrome d'Ondine". FJ è stata supportata da una borsa di studio GR-Ex del Laboratory of Excellence. Il GR-Ex (rif. ANR-11-LABX-0051) è finanziato dal programma "Investissement d'avenir" dell'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (rif. ANR-11-IDEX-0005-02).

Nota: rilevamento c-FOS è una procedura standardizzata coinvolge diversi passaggi (Figura 1). Tutti gli esperimenti sono stati condotti su ratti o topi. protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico in esperimenti su animali Charles Darwin (CE5 / 2011/05), fatta in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 22 Settembre 2010 (2010/63 / UE) per la cura degli animali, e condotte in conformità con le leggi francesi per la cura degli animali. 1. preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare tampone fosfato 0.2 M di sodio: aggiungere 6,24 g di NaH 2 PO 4 * 2H 2 O e 22.56 g di Na 2 HPO 4 * H 2 O a 1 L di acqua distillata e mescolare. </li><li> Preparare 4% paraformaldeide (PFA): aggiungere 20 g di PFA a 150 ml di acqua distillata. Riscaldare la soluzione a 80 ° C sotto agitazione. Per cancellare la soluzione, abbassare la fiamma e aggiungere 1 o 2 gocce di 1 N NaOH per aiutare la paraformaldeide sciogliere. Completa per 250 mlcon acqua distillata ed aggiungere 250 ml di 0,2 M tampone fosfato (pH 7,4). Conservare a 4 ° C. Fare attenzione appropriata quando si utilizzano questi reagenti. Maneggiare con guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza sotto una cappa chimica. Nota: Preparare 4% PFA, il giorno prima delle perfusioni. Determinare il volume del 4% PFA in funzione dell&#39;età, numero e specie di animali. </li><li> Preparare la soluzione crioprotettiva: In 250 ml di 0,2 M tampone fosfato salino, mescolare 5 g di polivinil-pirrolidone, 150 g di saccarosio e 2,5 g di cloruro di sodio. Dopo completa dissoluzione, aggiungere 150 ml di glicole etilenico e regolare a 500 ml con acqua distillata. Conservare la soluzione crioprotettiva a 4 ° C. </li><li> Preparare 0,1 M tampone fosfato salino (PBS): aggiungere 18 g di NaCl all&#39;acqua distillata 1 L agitando. Dopo completa dissoluzione, aggiungere 1 L 0,2 M di tampone fosfato di sodio. </li><li> Preparare tampone fosfato isotonico integrato con 0,3% Triton X100 (PBST): Aggiungere 3 ml di Triton X10Da 0 a 997 ml di PBS. </li><li> Preparare 0,05 M Tris-Buffer (pH 7,6): aggiungere 3,03 g di Tris-cloridrato e 0,70 g Tris-base per 500 ml di acqua distillata e mescolare. </li><li> Preparare 2% di siero di capra in PBST: per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 600 ml di siero di capra al 30 ml di PBST e mescolare bene. Aggiungere 2,5 ml per pozzetto. Nota: Il siero utilizzato deve provenire da specie utilizzate per la produzione di anticorpi secondaria </li><li> Preparare coniglio anticorpo policlonale contro la proteina c-FOS (1: 4000, sc-52) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 75 mg di albumina di siero bovino a 30 ml di PBST e mescolare bene. Quindi, aggiungere 7,5 ml di anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-FOS. </li><li> Preparare biotinilato anticorpi di capra anti-coniglio (1: 500) in PBST con albumina di siero bovino (0,25%). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 75 mg di albumina di siero bovino a 30 ml di PBST e mescolare bene. Poi aggiungi60 ml di capra biotinilato anticorpo anti-coniglio. </li><li> Preparare avidina-biotina-perossidasi (1: 250) in PBST (soluzione ABC). Per una piastra, preparare 30 ml di soluzione. Aggiungere 120 ml di reagente A e 120 ml di reagente B a 30 ml di PBST e mescolare bene. Nota: soluzione ABC deve essere preparata almeno 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare la soluzione di substrato. Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare la soluzione come segue (per una piastra): aggiungere 20 mg di nichel solfato di ammonio e 10 mg di 3,3-diamminobenzidina tetraidrocloruro a 50 ml di Tris-Buffer. Filtrare e proteggere dalla luce. Aggiungere 2,0 ml per pozzetto. Nella soluzione rimanente (25 ml) aggiungere 17 ml di H 2 O 2 (H 2 O 2 soluzione 30% in H 2 O). Aggiungere 2,0 ml per pozzetto. Nota: E &#39;necessario prestare attenzione quando si utilizza questi reagenti. Maneggiare con guanti e camici. </li></ol> 2. c-fos Induction e lavorazione dei tessuti In Vivo Nota: Gli esperimenti sono stati condotti su ratti Sprague Dawley () o topi (C57BL / 6). <ol><li> Posizionare gli animali in un vano ermetico ventilato con una ipossica (O 2 8% N equilibrata 2) o ipercapnica (CO 2 4%, O 2 21% N equilibrata 2) miscela per 2 ore (Figura 2A). </li><li> Anestetizzare l&#39;animale con iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg / kg). Profumato il transcardially animale con 4% PFA 20. Maneggiare con guanti per la cura e l&#39;uso sotto una cappa chimica. </li><li> Dopo perfusione, sezionare il cervello 20 ed immergerlo in 7 ml di 4% PFA in una provetta da 15 ml per 48 ore a 4 ° C. Quindi rimuovere il cervello da PFA e immergerlo completamente nella soluzione crioprotettiva. Conservare a -18 ° C (figura 3). Smaltire il resto del corpo dell&#39;animale da parte del pa di trattamento dei rifiuti adeguatothway. Nota: crioprotezione è un passo tra il PFA la fissazione e il congelamento. Si riduce la formazione di cristalli di ghiaccio in cellule con una soluzione di congelamento cui sarà in forma amorfa. I campioni fissi devono essere impregnate nella soluzione crioprotettiva (preparato al punto 1.3) per almeno 24 ore a 4 ° C. Maneggiare con cura e guanti sotto cappa chimica. </li></ol> 3. c-fos induzione e Tissue Processing Ex Vivo Nota: Gli esperimenti sono stati condotti nel ratto appena nati o topi solo. <ol><li> Isolare il CNS come descritto da Suzue 19. Mettere in una camera di registrazione e superfuse continuamente con fluido cerebro-spinale artificiale ad una velocità di 7,5 ml / min a 26 ° C 21 (aCSF: in mM: 130,0 NaCl, 5.4 KCl, 0,8 CaCl 2, 1.0 MgCl 2, 26,0 NaHCO 3, 30.0 D-glucosio; saturo di O 2 e regolato a pH 7,4 con il gas con 95% O 2 e 5% CO 2) (Figura 2B). </li><li> Sostituire il aCSF con deossigenato aCSF (stessa composizione gorgogliare con il 95% N 2 e 5% CO 2, pH 7,4) per ipossia o da un aCSF acidificato (standard aCSF con NaHCO 3 ridotto a 10,0 mM, bollito con 95% O 2 e 5% di CO 2) per ipercapnia. Applicare la stimolazione per 30 min (Figura 2B). </li><li> Ex vivo, dopo il periodo di induzione, trasferire il SNC di topi neonati o ratti in 2.5 ml di 4% PFA in una provetta da 2,5 ml per 48 ore e conservare a -18 ° C in una soluzione crioprotettiva per un uso successivo (Figura 3). Nota: ex vivo, non è necessario perfusione animali. Un precedente studio suggerisce che i piccoli campioni di misura inferiore a 10 mm di diametro può essere fissata per semplice diffusione 22. Un tasso di penetrazione indicata (distanza, in mm, per la diffusione fissativo nel tessuto) per l&#39;aldeide è 2 o 3 mm / hr. </li&gt; </ol> 4. Brainstem sezionamento Nota: Da questo punto alla fine, il protocollo è strettamente lo stesso in vivo ed ex vivo induzioni. <ol><li> Prima di affettare, collocare un individuo ben inserire in un 12-pozzetti e aggiungere 2,5 ml di PBS in ogni pozzetto. </li><li> Rendere seriali sezioni coronali (40 micron) del tronco cerebrale con un criostato e raccoglierli in 12-pozzetti. Per l&#39;intero tronco cerebrale adulta, fare circa 70 fette (Figura 3). Nota: È possibile tessuti sezione da diversi animali in parallelo in una piastra. </li></ol> 5. Procedure immunoistologiche (Tabella 1) Nota: Durante la procedura, le sezioni rimangono negli inserti pure. <ol><li> Giorno 1 - endogena distruzione perossidasi, non specifico sito di legame blocco, e l&#39;incubazione con l&#39;anticorpo primario (figura 4) <ol><li> lavaggiole sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte. </li><li> Sopprimere l&#39;attività perossidasica endogena incubando le sezioni coronali di 30 minuti a temperatura ambiente con acqua ossigenata H 2 O 2, 3% in PBS 0,1 M (2,5 ml per pozzetto). </li><li> Lavare le sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte. </li><li> Bloccare il sito di legame non specifico incubando le sezioni coronali per 1 ora a RT con siero di capra (2%) in PBST. </li><li> Incubare le sezioni coronali di 48 ore a 4 ° C con un anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-FOS (1: 4000, sc-52,) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%) (2,5 ml per pozzetto). </li></ol></li><li> Day 3 - incubazione con l&#39;anticorpo e lo sviluppo di una reazione colore secondario (figura 4) <ol><li> Lavare le sezioni per 10 minuti con PBS 0,1 M a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte. </li><li> incubare ilSezioni coronali per 1 ora a RT con un anticorpo biotinilato di capra anti-coniglio (1: 500) in PBST con albumina sierica bovina (0,25%) (2,5 ml per pozzetto). Nota: L&#39;investigatore può anche utilizzare un anticorpo secondario accoppiato ad una sonda fluorescente in questa fase. In questo caso, interrompere il protocollo in questa fase ed esaminare direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li><li> Lavare le sezioni per 10 min con PBST a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 3 volte. </li><li> Incubare le sezioni coronali per 1 ora con avidina-biotina-perossidasi (1: 250) in PBST (2,5 ml per pozzetto). </li><li> Lavare le sezioni per 10 min con PBST a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 2 volte. </li><li> Lavare le sezioni per 10 min con 0,05 M Tris-Buffer a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripetere 2 volte. </li><li> Incubare le sezioni coronali con 0,02% tetraidrocloride 3,3-diaminobenzidina, 0,04% solfato di nichel ammonio e perossido di idrogeno 0,01% in 0,05 M Tris-tampone (pH 7,6) at RT (2,0 ml per bene). Nella soluzione rimanente (25 ml) aggiungere 17 ml di H 2 O 2 (H 2 O 2 soluzione 30% in H 2 O) (2,0 ml per pozzetto). Nota: L&#39;investigatore deve stabilire i tempi di sviluppo sotto microscopio ottico. Tuttavia, da 5 a 10 minuti fornisce buona intensità di colorazione. </li><li> Quando intensità di colorazione è ottimale (controllata al microscopio luce, vedi Figura 5 e Figura 6), arrestare la reazione lavando sezioni per 10 minuti con 0,1 M PBS a RT (2,5 ml per pozzetto). Ripeti 4 volte. Poi, lavare sezioni con acqua distillata. </li></ol></li><li> Campionamento di montaggio (maneggiare con cura e guanti sotto cappa chimica) <ol><li> sezioni di montaggio in serie di diapositive e asciugare all&#39;aria. Per questo, si sviluppa con attenzione le sezioni in modo rostro-caudale con spazzole su diapositive. Chiaramente etichettare i vetrini secondo i campioni. </li><li> Disidratare con al assolutacohol: immergere i vetrini per 30 secondi a temperatura ambiente in bagno d&#39;alcol assoluto. Ripetere due volte. </li><li> Trasparente con xilene: immergere le diapositive in bagno xilene per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere due volte. </li><li> Coprioggetti i vetrini con mezzo di montaggio. Per questo, applicare 5 gocce di mezzo di montaggio sul vetrino e quindi applicare il vetro di copertura guidando le bolle d&#39;aria. Asciugare per 48 ore. </li></ol></li></ol> 6. I dati e l&#39;analisi statistica <ol><li> Esaminare sezioni sotto un microscopio ottico. Visivamente contare i neuroni FLI ad alto ingrandimento (200x) utilizzando punti di riferimento standard di 23,24. Il puntiforme colorazione c-Fos è localizzata nei nuclei di neuroni. </li><li> Per ogni area analizzata, contare il numero di cellule c-FOS-positive per sezione e confrontare il numero medio tra le condizioni di controllo e stimolati. Secondo la normalità dei dati, utilizzare il test t di Student per dati non appaiati o test di Mann-Whitney. Le differenze sono state considerate significative se P0; 0,05. Tracciare la distribuzione dei neuroni FLI su un disegno (ingrandimento 100x) utilizzando un tubo disegno allegato al microscopio e fotografato con una fotocamera digitale (Figura 5). </li></ol>

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<li>Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+Fos-like+immunoreactivity+evoked+by+hypoxia+in+the+rat+brainstem+and+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus.</a> Brain Res. 877, 149-159 (2000).</li>
<li>Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos+study+of+ponto-medullary+areas+involved+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).</li>
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<li>Bodineau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+a+new+physiological+role+for+brain+apelin+in+the+regulation+of+hypothalamic+oxytocin+neurons+in+lactating+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats.</a> Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).</li>
<li>Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+arrangement+of+hypercapnia-activated+cells+in+the+superficial+ventral+medulla+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats.</a> J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).</li>
<li>Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+adenosinergic+A1+systems+in+the+occurrence+of+respiratory+perturbations+encountered+in+newborns+following+an+in+utero+caffeine+exposure.+a+study+on+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Neuroscience. 127, 505-518 (2004).</li>
<li>Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+patterns+of+c-fos+expression+in+the+central+nervous+system+after+seizure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure.</a> Science. 237, 192-197 (1987).</li>
<li>Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+c-fos+protein+in+brain%3A+metabolic+mapping+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level.</a> Science. 240, 1328-1331 (1988).</li>
<li>Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+temporal+and+spatial+distribution+of+JUN%2C+FOS%2C+and+KROX-24+proteins+in+spinal+neurons+following+noxious+transsynaptic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation.</a> J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).</li>
<li>Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suckling-induced+activation+of+neural+c-fos+expression+at+lower+thoracic+rat+spinal+cord+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments.</a> Brain Res. 954, 100-114 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

C-fos è un gene precoce immediato, e il rilevamento del suo prodotto, la proteina c-FOS, viene classicamente utilizzati per identificare popolazioni neuronali coinvolti nelle risposte respiratorie specifici in vivo ed ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33. I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Fare attenzione durante la fase di perfusione. La soluzione PFA 4% deve essere...

Il gene fos c- è stato identificato per la prima volta all&#39;inizio del 1980 1,2 e il suo prodotto è stato caratterizzato nel 1984 come una proteina nucleare avente proprietà gene-attivatore 3,4. Partecipa a meccanismi a lungo termine associati con la stimolazione dei neuroni. Infatti, cambiamenti nell&#39;attività neuronale portano a seconda cascata di segnalazione messaggero che inducono l&#39;espressione dei geni immediati precoce c-fos, che induce la produzione del fattore di trascrizione c-FOS. Quest&#39;ultima avvia l&#39;espressione dei geni tardivi e partecipa quindi in risposta adattativa del sistema nervoso a diversi tipi di stimoli 4. Così, dalla fine del 1980 5,6, rilevamento proteina c-fos è stato frequentemente utilizzato per studiare gli effetti di fattori esogeni sulla trascrizione genica in generale 4 e sull&#39;attività del sistema nervoso centrale (CNS) per mappatura percorsi neuronali coinvolti in diversi fisiologicacondizioni al. Basale c-fos espressione è stata studiata in varie specie, tra cui topi, ratti, gatti, scimmie, e umano 4. In tal modo, la cinetica della sua espressione è relativamente ben nota. L&#39;attivazione della trascrizione è rapido (da 5 a 20 min) 7,8, e l&#39;accumulo di mRNA raggiunge un massimo tra 30 e 45 minuti dopo l&#39;inizio della stimolazione 9 e diminuisce con una breve emivita di 12 min. La sintesi proteica c-FOS segue accumulo di mRNA e potrebbe essere rilevato mediante immunoistochimica a 20 a 90 min dopo la stimolazione 6. Analisi dell&#39;espressione di c-fos è classicamente utilizzato in studi in vivo per identificare la rete dell&#39;apparato respiratorio coinvolti nelle risposte ventilatoria all&#39;ipossia o ipercapnia 10-14. Più di recente, questo strumento è stato utilizzato anche in preparazioni ex vivo tronco di esplorare adattamenti rete respiratorie centrali all&#39;ipossia o hypercapnia 15-18. In effetti, questi preparati generano un&#39;attività ritmica classicamente assimilata al drive respiratorio centrale 19. Pertanto, questo tipo di preparazione ha il vantaggio di essere completamente deafferented, e quindi, i risultati riguardanti l&#39;espressione di c-fos solo riflettono le conseguenze di una stimolazione centrale senza alcun intervento di strutture periferiche. Il rilevamento c-FOS può essere effettuato mediante approcci immunoistochimiche o immunohistofluorescence. immunolocalizzazione indiretta richiede l&#39;uso di un anticorpo primario contro c-FOS e un anticorpo secondario diretto contro le specie in cui è ottenuto l&#39;anticorpo primario. Per il metodo immunoistochimica, l&#39;anticorpo secondario è coniugato con un enzima (perossidasi, per esempio) che agisce su un substrato (H 2 O 2 per la perossidasi). Il prodotto della reazione enzimatica è sviluppato da un cromogeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), che colora e si osserva al microscopio ottico. La reazione potrebbe essere rafforzata con solfato di nichel ammonio. Questi metodi consentono il rilevamento di attivi neuroni durante diverse sfide fisiologici e quindi l&#39;identificazione e / o la mappatura dei percorsi periferiche e centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche consecutivi.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 12 pozzetti</td><td>Costa</td><td>35/3</td><td></td></tr><tr><td>Inserti Netwell da 15 mm con membrana in poliestere a rete</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>Gli inserti a pozzetto da 15 mm di diametro hanno 74&micro; m fondi in rete di poliestere attaccati a inserti in polistirene</td></tr><tr><td>Anticorpo primario (anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-Fos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-52</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC KIT&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>PK-6101</td><td></td></tr> <tr><td>(anticorpo secondario IgG di coniglio)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4*2H2O</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 0.1N</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Polivinil-pirrolidone</td><td>Sigma</td><td>PVP-360</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico</td><td>Sigma</td><td>33068</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trisma HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trisma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>3.3-diaminobenzidina tetracloridrato&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>DAB50</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di nichel ammonio</td><td>Alfa Aesar</td><td>12519</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sigma</td><td>33817</td><td></td></tr><tr><td>Entellan Neo</td><td>Merck Millipore</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Slide&nbsp;</td><td>Termoscientifico</td><td>1014356190</td><td>Superfrost ultraplus</td></tr><tr><td>Vetro</td><td>di copertura Termoscientifico</td><td>Q10143263NR1</td><td>24 x 60mm</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

la proteina c-fos immunoistologiche detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; ex vivo</em

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Molti studi cercano di identificare e mappare le regioni del cervello coinvolte nella specifica normativa fisiologici. I c-fos proto-oncogene, un gene precoce immediato, è espressa nei neuroni in risposta a vari stimoli. Il prodotto proteina può essere facilmente rilevata con tecniche immunoistochimiche volti all&#39;utilizzo di rilevamento c-FOS mappare gruppi di neuroni che mostrano cambiamenti nella loro attività. In questo articolo, ci siamo concentrati sull&#39;individuazione di tronco cerebrale neuronale popolazioni coinvolte nell&#39;adattamento ventilatoria all&#39;ipossia o ipercapnia. Due approcci sono stati descritti per identificare popolazioni neuronali coinvolte in vivo negli animali e ex vivo nelle preparazioni del tronco deafferented. In vivo, gli animali sono stati esposti a miscele di gas ipercapnici o ipossia. Ex vivo, i preparativi sono stati deafferented superfused con ipossia o liquido cerebrospinale artificiale ipercapnica. In entrambi i casi, sia il controllo in animali in vivo o ex vivo i preparativi sono stati mantenuti in condizioni normossiche e normocapnica. Il confronto di questi due approcci permette di determinare l&#39;origine del cioè attivazione neuronale, periferica e / o centrale. In vivo ed ex vivo, sono stati raccolti brainstems, fissi, e tagliati in sezioni. Una volta che le sezioni sono state preparate, rilevazione immunoistochimica della proteina c-FOS è stato fatto per identificare i gruppi tronco di cellule attivate da stimoli ipossici o ipercapnici. cellule marcate sono state contate in strutture respiratori del tronco cerebrale. Rispetto alla condizione di controllo, ipossia o ipercapnia aumentato il numero di cellule marcate c-FOS in diversi siti del tronco specifici che sono in tal modo costitutiva dei percorsi neuronali coinvolti nella adattamento del drive respiratorio centrale.

Il rilevamento c-FOS è un utile strumento che consente a gruppi identificativi di cellule attivate in condizioni specifiche come ipossia e ipercapnia in vivo (Figura 2A) o in situazioni che imitano queste condizioni ex vivo (Figura 2B). In vivo, neonato, giovane o roditori adulti sono stati posti in un contenitore ermetico in cui l&#39;ambiente gassoso viene continuamente rinnovata da una miscela di gas con una composizione def...

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla rilevazione immunoistologica della proteina c-FOS, una tecnica classica utilizzata per l'identificazione di popolazioni neuronali coinvolte in specifiche risposte fisiologiche in vivo ed ex vivo.

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

L'obiettivo generale di questa rilevazione immunohistochimica contro la proteina c-FOS è valutare l'attività neuronale nei tessuti cerebrali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurofisiologia, come la mappatura cerebrale e l'identificazione delle regioni cerebrali coinvolte in specifiche regolazioni fisiologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il gene c-FOS presenta un'espressione bassa in assenza di stimolazione, il che permette una quantificazione più agevole dell'attività neuronale nella nostra simulazione sperimentale.Per iniziare questa procedura, lavare le sezioni del tronco encefalico coronali per 10 minuti con PBS 0,1 molare a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio tre volte. Successivamente, inibire l'attività della perossidasi endogena incubando le sezioni con perossido di idrogeno al 3% in PBS 0,1 molare per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi, lavare le sezioni per 10 minuti con PBS 0,1 M a temperatura ambiente e ripetere l'operazione tre volte. Bloccare i siti di legame non specifici incubando le sezioni coronali con siero di capra al 2% in PBST per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le sezioni con un anticorpo policlonale rapido diretto contro la proteina c-FOS in PBST con albumina sierica bovina allo 0,25% per 48 ore a quattro gradi Celsius.In questo passaggio, lavare i preparati con PBS 0,1 M per 10 minuti a temperatura ambiente e ripetere la procedura tre volte. Successivamente, incubare i preparati coronali per un'ora a temperatura ambiente con un anticorpo caprino anti-coniglio biotinilato in PBST contenente albumina sierica bovina allo 0,25%. Dopo un'ora, lavare i preparati per 10 minuti con PBST a temperatura ambiente e ripetere l'operazione tre volte.Quindi, incubare i tagli coronali per un'ora con un complesso perossidasi di avidina-biotina in PBST. Successivamente, lavare i tagli con PBST a temperatura ambiente per 10 minuti e ripetere altre due volte. Poi, lavare i tagli per 10 minuti con tampone Tris 0,05 molar a temperatura ambiente e ripetere il lavaggio altre due volte.Successivamente, incubare i tagli coronali con DAB, solfato ammonico di nichel e perossido di idrogeno in tampone Tris 0,05 molar a temperatura ambiente. Aggiungere 17 microlitri di perossido di idrogeno al tampone Tris rimanente. Quando l'intensità della colorazione è ottimale, arrestare la reazione lavando i tagli con PBS 0,1 molar per 10 minuti a temperatura ambiente, e ripetere il lavaggio quattro volte.Quindi, lavare le sezioni con acqua distillata. Successivamente, montare le sezioni in serie sui vetrini, disponendole con attenzione in ordine rostrocaudale sui vetrini mediante un pennello. Dopodiché, lasciare asciugare le sezioni all'aria e etichettare chiaramente i vetrini in base ai campioni.Quindi, disidratare le sezioni immergendo i vetrini in un bagno di alcol assoluto per 30 secondi a temperatura ambiente e ripetere la procedura due volte. Successivamente, immergere i vetrini in un bagno di xilene per tre minuti a temperatura ambiente e ripetere due volte. In seguito, applicare cinque gocce di mezzo di montaggio su ciascun vetrino.Posizionare un vetrino coprioggetto su di essi ed evitare la formazione di bolle d'aria. Lasciare asciugare all'aria i vetrini per 48 ore. Qui è mostrato un disegno di una sezione della medulla oblongata.La zona tratteggiata mostra le parti commissurale e media del nucleo del tratto solitario. Il rettangolo indica la regione da cui sono state ottenute le fotomicrografie. Queste sono le fotomicrografie del nts c/m in condizione di normossia o sotto ipossia.Le frecce nere indicano le cellule positive a c-FOS. Di seguito è riportato un istogramma che mostra il numero medio di cellule positive a c-FOS per sezione nel c/mNTS in condizione di normossia o in ipossia. Il numero di cellule positive a c-FOS era significativamente maggiore in condizione di ipossia rispetto a quella di normossia.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il rilevamento immunohistochimico della c-FOS come marcatore delle vie centrali coinvolte in specifiche stimolazioni fisiologiche.

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La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche In Vivo e Ex Vivo (Video) | JoVE Journal

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche

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