Sintesi di nanoparticelle d'oro liposomi Integrated Photo-reattiva e la misurazione del loro microbolle cavitazione su impulso laser di eccitazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la sintesi di liposomi sensibili alla luce e chiarire il meccanismo di rilascio del farmaco controllato dalla luce da questi liposomi. Questo metodo contribuisce a rispondere alle domande fondamentali riguardo il comportamento figurativo dei liposomi sensibili alla luce per il rilascio di farmaci, in cui le principali sfide consistono nella sintesi dei liposomi e nel potenziamento della capacità di rilascio controllato. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sintesi cellulare di liposomi sensibili alla luce mediante l'utilizzo di materiali disponibili in commercio.

L'implicazione di questa tecnologia si estende alla terapia dei tessuti superficiali. L'uso di procedure minimamente invasive, insieme a un componente del dispositivo laser, renderà la piattaforma tecnologica più accessibile per i pazienti. Oltre a fornire indicazioni per le cure migliori e un'accurata somministrazione dei farmaci, il nostro sistema può essere applicato anche ad altri sistemi, come quelli ani-ma-mo-rosi e i sistemi mucosi, mediante l'uso di laser guidati.

Prima pulire un pallone da 100 millilitri a fondo rotondo utilizzando acqua regia. Dopo il risciacquo con acqua deionizzata e l'autoclavaggio, asciugare il pallone in una stufa ad aria calda a 100 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi avvolgere e conservare il pallone sterile fino al momento dell'uso.

Sterilizzare un set di estrusore manuale utilizzando etanolo al 70%. Accendere quindi l'evaporatore rotante e impostare la temperatura del bagno di acqua calda e quella della torre di raffreddamento rispettivamente a 37 e 4 gradi Celsius. Preparare una soluzione madre di calcio 60 millimolare sciogliendo 374 milligrammi di Calceina e 10 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato 0,1 millimolare o PBS.

Regolare il pH a 7,4 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio 1 M. Rimuovere i lipidi dal congelatore e scongelarli a temperatura ambiente. Una volta scongelati, sciogliere 15,9 milligrammi di DPPC, 1,3 milligrammi di MPPC e 2,8 milligrammi di DSPE-PEG2000 in due millilitri di cloroformio.

Dopo aver trasferito la soluzione di cloroformio in un pallone a fondo rotondo sterile, evaporare il solvente utilizzando un evaporatore rotante sotto pressione ridotta per formare uno strato lipidico sottile e secco. Successivamente, idratare lo strato lipidico a 45 gradi Celsius con due millilitri di soluzione acquosa contenente 1,95 millilitri della soluzione di calcio 60 millimolare precedentemente preparata e 50 microlitri di nanoparticelle d'oro per 30 minuti. Preriscaldare un blocco termoregolato a 45 gradi Celsius.

Posizionare un filtro in membrana di policarbonato da 200 nanometri tra i supporti del filtro e assemblare il set del mini estrusore. Successivamente, verificare la presenza di eventuali perdite utilizzando acqua deionizzata. Riempire una delle siringhe con un millilitro della soluzione di liposomi precedentemente preparata ed estrudere il campione facendo passare la soluzione attraverso la siringa all'estremità opposta del mini estrusore assemblato.

Dopo aver ripetuto l'operazione precedente 11 volte, far passare i liposomi sintetizzati attraverso una colonna di desalinizzazione PD-10 per rimuovere le nanoparticelle d'oro libere, i lipidi e la calceina, utilizzando PBS come eluente secondo il protocollo del produttore. Al termine, conservare i campioni in provette sterili a quattro gradi Celsius. A questo punto, calcolare la molarità dei lipidi nella soluzione madre sommando le molarità di DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000.

Diluire la soluzione madre di liposomi fino a una concentrazione lipidica di 5 millimolari utilizzando PBS 0,1 millimolare, quindi trasferire i campioni in provette da centrifuga da 2 millilitri. Successivamente, posizionare le provette in un bagno di acqua calda e aumentare gradualmente la temperatura da 25 a 70 gradi Celsius. Raccogliere aliquote di 10 microlitri a diversi punti di temperatura.

Aggiungere 10 microlitri di Triton X-100 al due percento a un’aliquota di due millilitri di soluzione liposomale per digerire i liposomi per 10 minuti a temperatura ambiente e ottenere il rilascio completo della calceina. Successivamente, trasferire 200 microlitri della soluzione liposomale in ciascun pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti. Misurare l'intensità di fluorescenza dei campioni raccolti utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza.

Considerando l'intensità di fluorescenza dei campioni trattati con Triton X-100 come rilascio al 100 percento, calcolare la percentuale di Calceina rilasciata ad ogni punto temporale utilizzando la seguente formula: trasferire 100 microlitri della soluzione di liposomi in una cuvetta in quarzo e posizionare la cuvetta in un portacuvette. Indirizzare il fascio laser collimato attraverso la cuvetta in modo che la luce attraversi la soluzione di liposomi. Successivamente, prelevare aliquote dopo diversi impulsi.

Successivamente, aggiungere 10 microlitri di Triton X-100 al 2% a un’aliquota di 2 millilitri di soluzione liposomiale per digerire i liposomi per 10 minuti a temperatura ambiente e ottenere il completo rilascio della calceina. Per misurare preventivamente l'effetto di sbiancamento del laser sulla soluzione di calceina, esporre la soluzione a un laser con una frequenza di 1 hertz per un numero variabile di impulsi. Misurare l'intensità di fluorescenza della calceina con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente di 480 e 515 nanometri prima e dopo l'esposizione al laser.

Dopo aver calcolato le quantità di sbiancamento, utilizzare questo fattore per normalizzare i valori ottenuti dai campioni di liposomi moltiplicando l'intensità di fluorescenza dei liposomi per il fattore. Successivamente, misurare l'intensità di fluorescenza del campione raccolto utilizzando un lettore a microplacca per fluorescenza con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente di 480 e 515 nanometri. Assumendo l'intensità di fluorescenza dei campioni trattati con Triton X-100 come rilascio al 100 percento, calcolare la percentuale di calceina rilasciata per ogni numero di impulsi.

Posizionare 100 microlitri del campione su un vetrino da microscopio, quindi impostare il fuoco del laser sul campione. Il laser viene guidato manualmente attraverso il campione, pertanto è fondamentale assicurarsi che il punto focale del fascio sia ben all'interno del campione e non sul vetrino microscopico, per evitare interferenze negli esperimenti successivi. Successivamente, immergere un idrofono a ago nella soluzione.

La punta dell'idrofono viene immersa nel campione a una distanza sufficiente dal punto focale del laser. Questo passaggio è effettuato per evitare eventuali danni all'idrofono indotti dal laser. Irradiare il campione con il laser a impulsi variando il numero di impulsi e l'energia degli impulsi.

Infine, registrare i segnali di pressione utilizzando un oscilloscopio digitale. Non si osserva alcuna differenza significativa nella percentuale di rilascio tra i liposomi con e senza nanoparticelle d'oro. I liposomi erano quasi integri alla temperatura fisiologica, con una percentuale di fuoriuscita inferiore al 10 percento, sia in presenza che in assenza di nanoparticelle d'oro.

Quando la temperatura è stata aumentata a 42 gradi Celsius, dal 60 all'80 percento della Calceina incapsulata è stato rilasciato dai Liposomi entro due minuti. I Liposomi con nanoparticelle d'oro hanno rilasciato la Calceina incapsulata in seguito a eccitazione, in cui la quantità di Calceina rilasciata è aumentata all'aumentare del numero di impulsi. I segnali acustici registrati per le nanoparticelle d'oro, i Liposomi con nanoparticelle d'oro e i Liposomi senza nanoparticelle d'oro sono mostrati qui: L'impulso di pressione, che contiene sia fasi positive che negative, suggerisce che si formano microbolle che si rompono nella soluzione.

Come previsto, l'ampiezza del segnale acustico è gradualmente aumentata all'aumentare dell'energia del laser, il che dovrebbe essere dovuto all'intensità crescente delle oscillazioni delle particelle, attribuibile alla successiva espansione e contrazione termoelastica. Una volta acquisita padronanza della tecnica, la fabbricazione dei liposomi può essere completata entro 3 ore, a condizione che tutta la vetreria e l'apparecchiatura siano state preparate in anticipo. Durante il tentativo del rilascio controllato mediante laser, è importante ricordare che il fascio laser deve essere completamente focalizzato sul campione per evitare perdite di energia laserica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri esperimenti, come il rilascio controllato mediante laser in vitro e in vivo, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come le condizioni fisiologiche influenzeranno il rilascio controllato mediante laser. Dopo questo sviluppo, questa tecnica si rivelerà utile nel campo della reattività per esplorare, localizzare e controllare il rilascio su cute, occhi e membrane mucose.