DamID-seq: Genome-wide Mappatura delle interazioni proteina-DNA da High Throughput Sequencing di Adenina-metilato frammenti di DNA

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di rilevare sequenze di DNA genomico associate a proteine di interesse nelle cellule animali mediante sequenziamento ad alto rendimento. Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio dell'organizzazione nucleare e della trascrizione o regolazione nelle cellule di mammifero, come l'identificazione delle regioni genomiche associate all'amiloide nucleare o a specifici fattori di trascrizione. I principali vantaggi di questa tecnica sono che il sequenziamento ad alto rendimento fornisce una risoluzione più elevata rispetto all'asset DamID originale, utilizzando microarray di DNA, e che questa tecnica consente l'analisi incrociata con i nostri dati di sequenziamento ad alto rendimento.

A dimostrare la procedura sarà Brennan Olson, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, segui il protocollo di testo per clonare il gene di interesse nel vettore DamID. Successivamente, generare stock lentivirali che esprimono DamV5 POY e V5-Dam utilizzando un sistema di espressione lentivirale.

Cotrasfettare il vettore DamID con i plasmidi di confezionamento lentivirali seguendo la procedura di trasfezione diretta secondo il protocollo del produttore. Assicurati di includere una fase di filtrazione utilizzando un filtro PVDF da quattro cinque micron punto zero. Ora, preparati a infettare le cellule con il lentivirus.

Con un giorno di anticipo, passare le celle aderenti su piastre a sei pozzetti. Continuare a usare gli antibiotici. L'obiettivo è avere il 50% di confluenza il giorno successivo per l'infezione.

Il giorno seguente, rimuovere dal congelatore i surnatanti lentivirali DamV5 POY e V5-Dam congelati e metterli in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per scongelarli. Sulle piastre di coltura, rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con mezzo millilitro di terreno di coltura fresco senza antibiotici. Quindi, caricare i pozzetti con un millilitro di lentivirus scongelato.

Caricare due pozzi con V5-Dam, due pozzetti con DamV5 POY e due pozzetti senza lentivirus come controllo negativo. Agitare la soluzione sulle cellule e rimettere la piastra nell'incubatore. 24 ore dopo, sostituire le sospensioni virali sulle cellule con due millilitri di terreno di crescita senza antibiotici.

Quindi, continuare l'incubazione per altre 48 ore. Due giorni dopo, completa questo processo seguendo il protocollo di testo per isolare il DNA genomico, operazione che dovrebbe richiedere circa un'ora. Quindi, amplificare i frammenti di DNA metiladenico dall'adenina dal DNA genomico.

Questo processo richiede circa due o tre giorni e i dettagli sono trattati nel protocollo di testo. Per questa procedura, prima frammentare il DNA metilato adenina amplificato. Prima di utilizzare la DNA Fragmentasi, è importante misurarne la forza per determinare il tempo di digestione appropriato.

Utilizzare tutti i prodotti di metilPCR purificato disponibili per questo test diagnostico. Inizia preparando una miscela master composta da sei microgrammi di DNA, 12 microlitri di tampone 10X Fragmentase e riempila con acqua fino a 114 microlitri. Quindi, agitare il brodo di Fragmentase per tre secondi e aggiungere sei microlitri nella miscela master per un totale di 120 microlitri.

Quindi, agitare la miscela master per tre secondi. A questo punto, riempire cinque provette di reazione con aliquote da 20 microlitri di master mix e incubare tutte e sei le provette a 37 gradi Celsius. Rimuovere un tubo dopo cinque minuti e aggiungere cinque microlitri di EDTA per fermare la reazione.

Fallo ogni 10 minuti fino a quando tutte le provette di reazione sono raccolte. Ora, analizza 12 virgola cinque microlitri da ogni provetta, che corrisponde a circa mezzo microgrammo di DNA, e la stessa quantità di DNA non digerito su un gel di agorosa. Dal gel, determinare il tempo minimo necessario per digerire la maggior parte dello striscio a circa zero virgola due kilobasi.

Usalo come tempo massimo di digestione. Ora, imposta la frammentazione effettiva, come il pretest, e interrompi le digestioni in sei punti temporali equidistanti, inclusi cinque minuti, e calcola il tempo massimo. Dopo la digestione, estrarre le sei digestioni e purificarle utilizzando un kit di purificazione PCR o perle di immobilizzazione reversibili in fase solida.

Diluire il DNA purificato in circa 15 microlitri di tampone EB. I prossimi passi sono riparare le estremità del DNA frammentato, aggiungere sporgenze di adenina, legare sugli adattatori di sequenziamento e convertire gli adattatori a forma di Y in DNA a doppio filamento. Questi passaggi sono tutti descritti in dettaglio nel protocollo di testo e non dovrebbero richiedere più di due giorni per essere completati.

Dopo aver legato gli adattatori di sequenziamento al DNA frammentato e aver convertito gli adattatori a forma di Y in DNA a doppio filamento, selezionare i frammenti della dimensione desiderata. Iniziate preparando un gel di agorosa al due per cento in TAE e, prendendo precauzioni, aggiungete bromuro di etidio a una concentrazione finale di 500 nanogrammi per millilitro. Crea abbastanza corsie per tutti i campioni e due scale devono essere delimitate da corsie vuote.

Ora, aggiungi otto microlitri di colorante di caricamento a 10 microlitri di ciascun eluato di DNA e prepara la scala 1 Kb Plus con colorante di caricamento 6X e acqua in un rapporto di uno a uno a quattro. Quindi, carica le corsie in gel nel seguente ordine: scala del DNA, eluati del DNA e un'altra scala del DNA. Una volta caricato, far funzionare il gel a 120 volt per 60 minuti.

Successivamente, indossa gli occhiali di sicurezza e una visiera per visualizzare brevemente il gel con la luce UV. Controlla le scale del DNA per vedere se il gel si è esaurito abbastanza da poter asportare tre fette di gel tra le 300 e le 400 paia di basi. Quindi, ritaglia le bande tra le 300 e le 400 coppie di basi da ogni corsia, usando sempre una nuova lama per ogni corsia.

Rimuovere la minor quantità possibile di gel per rendere ogni fetta di gel idealmente inferiore a 100 microlitri e trasferire ciascuna nel proprio tubo di microfuga. Quindi, estrai il DNA dalle fette di gel secondo il protocollo di testo. Continua seguendo il protocollo di testo su come arricchire i frammenti modificati dell'adattatore di sequenziamento dal DNA estratto.

Quindi, ottenere un'analisi di alta qualità del DNA purificato da un bioanalizzatore e, se soddisfa le aspettative, inviarlo per il sequenziamento. I lentivirus sono stati ingegnerizzati per esprimere una proteina di fusione Dam-V5-lamina B1, che è stata verificata per essere colocalizzata con la proteina endogena della lamina B1 mediante colorazione a fluorescenza amminica. Questo lentivirus e un lentivirus di controllo che esprime la proteina di fusione Dam-V5 sono stati entrambi utilizzati per infettare i mioblasti C2C12 di topo.

Il DNA è stato raccolto e amplificato per frammenti metilati di adenina, come descritto, e quindi sequenziato. Sono state quindi costruite mappe di interazione genoma NL per il cromosoma uno. Una traccia mostra i rapporti RPKM log2.

L'altra traccia mostra i domini associati alla lamina in nero. Si tratta di aree che sono significativamente più associate alla lamina della diga B1 che alla diga di controllo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro due settimane, se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare le sequenze di DNA associate alle proteine di interesse mediante sequenziamento ad alto rendimento, accoppiato a DamID. Non dimenticare che lavorare con il bromuro di etidio e le luci UV potrebbe essere estremamente pericoloso e precauzioni come aspettare che il gel si raffreddi prima di aggiungere bromuro di etidio e indossare una protezione per gli occhi e una visiera dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.