Primaria endodermico cellule epiteliali Cultura dal tuorlo Sac membrana di giapponesi Quail embrioni

L'obiettivo generale di questa procedura di espianto ex vivo è migliorare il recupero e ampliare l'applicazione delle cellule epiteliali endodermiche aviarie al fine di studiare la funzione di enzimi e proteine nel modulare l'utilizzo dei nutrienti da parte degli embrioni aviani. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo all'utilizzo dei lipidi durante l'embriogenesi aviana, ad esempio in che modo i lipidi del tuorlo vengono impacchettati e trasportati dal tuorlo all'embrione nelle fasi successive dello sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che possiamo ottenere con successo cellule epiteliali endodermiche funzionali dalla membrana del sacco vitellino della quaglia giapponese, che possono essere utilizzate come modello per lo studio dello sviluppo embrionale aviano.

Iniziare preparando una soluzione di PBS 10x come descritto nel protocollo testuale. Diluire questa soluzione madre da uno a dieci per ottenere PBS 1x, che verrà utilizzato per lavare la membrana del sacco vitellino durante la dissezione dell'endoderma. Per preparare il mezzo di crescita per le cellule epiteliali endodermiche, o EEC, aggiungere innanzitutto al DMEM/F-12 il 10% di siero di vitello e la soluzione di penicillina-streptomicina-anfotericina all'1%.

Successivamente, inserire la sonda di un pHmetro nel DMEM precedentemente preparato. Aggiungere tre normali di HCl goccia a goccia al mezzo fino a quando il pH non sarà stato regolato a 7,2. Dopo aver raccolto circa due dozzine di uova di quaglia fecondate, posizionarle verticalmente nei contenitori per uova in modo che le estremità larghe e non affusolate, dove si trovano le camere d'aria, siano rivolte verso l'alto.

Successivamente, trasferire le uova in un incubatore ben ventilato impostato a 37 gradi Celsius. Dopo cinque giorni di incubazione, esaminare le uova con un candeloscopio per uova. Se gli embrioni si sono sviluppati normalmente, ci si aspetta di vedere una struttura circolare di vasi capillari al di sotto della camera d'aria.

Selezionare un uovo che mostri uno sviluppo normale dei capillari e pulire il guscio con acqua fresca ed etanolo al 75%. Successivamente, aprire il guscio dell'uovo a partire dalla posizione della camera d'aria utilizzando delle forbici. Usare la pinzetta per aiutare delicatamente a versare il contenuto dell'uovo in una piastra di coltura vuota da 10 cm.

Quindi, utilizzare le forbici per staccare l'embrione, il tuorlo e qualsiasi albume dalla membrana del sacco vitellino, abbreviata come MVS. Una volta isolata, lavare la MVS tre volte in PBS 1x e successivamente trasferirla in una nuova piastra da 10 cm contenente PBS. Successivamente, posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico.

Quindi, procedere a rimuovere con le forbici qualsiasi residuo di albume, che aderisce allo strato esterno di ectoderma della membrana del sacco vitellino (YSM). Continuare utilizzando la pinzetta per sollevare l'ectoderma traslucido e il mesoderma strutturale dei capillari di colore rosso dal margine del mesoderma presente sulla membrana del sacco vitellino. Successivamente, staccare delicatamente insieme ectoderma e mesoderma per isolare lo strato cellulare sottostante di endoderma.

Quindi, con una pinzetta, tenere saldamente lo strato di cellule endodermiche gialle della membrana. Con un'altra pinzetta, afferrare il mesoderma capillare e procedere tirando il mesoderma lontano dal margine di giunzione tra mesoderma ed endoderma. Utilizzando un paio di forbici, tagliare lo strato residuo di endoderma giallo e trasferirlo nella piastra di coltura da sei centimetri riempita con mezzo di crescita.

Utilizzando un contagocce, trasferire l'endoderma di colore giallo chiaro dalla piastra da sei centimetri in un tubo da centrifuga da 15 mL dopo il prelievo del mezzo di coltura, e aggiungere 15 mL di mezzo di crescita precedentemente preparato. Collocare il tubo conico in un bagnomaria a 37 gradi Celsius fino al completamento di tutti i prelievi di tessuto. Iniziare sciogliendo 6,5 unità di collaghenasi di tipo IV in 10 mL di DMEM.

Successivamente, centrifugare i tubi contenenti l'endoderma a 130 ×g per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo e utilizzare una pipetta per trasferire tutti i campioni di endoderma in una piastra di coltura da sei centimetri. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di collagene alla piastra.

Con forbici curve, procedere a tagliare l'endoderma raccolto da quattro embrioni di quaglia in fette di dimensioni comprese tra due e tre millimetri. Successivamente, raccogliere le fette in un tubo da centrifuga da 50 mL e aggiungere nove millilitri di soluzione fresca di collagenasi, che si trova già all'interno del tubo da centrifuga da 50 mL. Per migliorare la proliferazione cellulare durante la fase di espianto, posizionare il tubo in un bagnomaria agitato regolato a 37 gradi Celsius.

Quindi, incubare il conico per 30 minuti per digerire parzialmente il tessuto con collagenasi. La digestione proteolitica parziale è il passaggio più importante per migliorare la raccolta delle cellule del tuorlo dall'endoderma della membrana del sacco vitellino. I nostri dati mostrano un miglioramento significativo del tasso di successo della coltura cellulare e della proliferazione cellulare grazie alla procedura di digestione con collagenasi.

Dopo la digestione con collagenasi, centrifugare il tessuto a 130 ×g per tre minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la frazione soprannatante con una pipetta. Procedere a lavare il pellet risospendendolo in 20 mL di DMEM. Centrifugare il tubo come descritto in precedenza, quindi rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 12 mL di mezzo di crescita.

Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri della sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Procedere con l'incubazione degli espianti di endoderma per due giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5%CO2. Durante questo periodo, ci si aspetta che le cellule proliferino fuori dai tessuti.

Successivamente, incubare le cellule per altri due giorni. Poi, sottoporle a un saggio di vitalità cellulare e visualizzare i risultati utilizzando un lettore di piastre. In seguito, eseguire la RT-qPCR per valutare i livelli di espressione dei marcatori di interesse nelle EEC e verificare la dimensione del prodotto ottenuto dalla RT-qPCR mediante elettroforesi su gel, come descritto nel protocollo testuale.

Rispetto agli espianti non trattati, quelli parzialmente digeriti con collagenasi hanno mostrato un aumento significativo della proliferazione cellulare, come mostrato in questi grafici e determinato mediante un test t accoppiato, dimostrando il successo del sistema di coltura. Per valutare gli effetti di altri enzimi, sono stati eseguiti saggi di vitalità cellulare su tessuti trattati con collagenasi e dispasi o con collagenasi da sola. Nei primi cinque giorni di incubazione, la crescita cellulare è stata simile in entrambe le condizioni.

Tuttavia, dal sesto al nono giorno, solo gli EEC trattati con collagenasi proliferarono in modo costante, suggerendo che una digestione parziale con questo enzima migliora la crescita e dovrebbe essere preferibilmente utilizzata. Quando gli EEC coltivati furono osservati, mostrarono caratteristiche simili a quelle degli adipociti, con grandi goccioline lipidiche di forma circolare come mostrato qui. Tali cellule risultarono inoltre positive alla colorazione con Oil Red O, comunemente impiegata per identificare gli adipociti.

Supportando questi dati morfologici, la PCR quantitativa in tempo reale ha rivelato che le EEC coltivate mostrano livelli elevati di SOAT1, una proteina che sintetizza l'estere del colesterolo a partire dal colesterolo. Questo suggerisce ulteriormente che le EEC coltivate manifestano le corrette caratteristiche fisiologiche degli adipociti. In modo importante, quando le EEC sono state esposte a IBMX e forskolina, fattori che aumentano i livelli di adenosina monofosfato ciclico, o cAMP, e coltivate per 24 ore, entrambi i trattamenti hanno stimolato l'espressione di SOAT1, suggerendo possibili meccanismi di regolazione di SOAT1 e di utilizzo dei lipidi nel MSA.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore, durante le quali è possibile raccogliere almeno tre campioni. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile effettuare metodi come il saggio di attività enzimatica SOAT1 o altri saggi simili, nonché conferme visive analoghe. Tali saggi possono aiutare a rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come determinate proteine e macronutrienti siano coinvolti nelle fasi successive dello sviluppo embrionale.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'utilizzo dei nutrienti negli embrioni per esplorare il possibile meccanismo attraverso cui i nutrienti vengono utilizzati e trasportati in un modello embrionale aviario. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di imparare come raccogliere tessuti endodermici da embrioni aviarî, e sapere anche come coltivare le EEC per studiare il trasporto e l'utilizzo dei nutrienti embrionali utilizzando il modello aviario.