Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa metodologia è identificare i carichi di Kinesin-1 utilizzando la microscopia a fluorescenza. Questo metodo ci aiuta a rispondere a domande chiave nel campo dei motori molecolari, come ad esempio quali carichi vengono trasportati da chinesine e miosine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i mutanti KIF5B negativi dominanti possono aiutarci a identificare visivamente questo carico utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Per iniziare, per l'imaging di cellule vive o di fluorescenza indiretta a 40X o inferiore, alimentare da 0,2 a 0,3 milioni di cellule HeLa in un millilitro di terreno completo in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Fai crescere le cellule a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica. Per gli studi di immunofluorescenza indiretta con ingrandimenti superiori a 40X, in una cabina di biosicurezza per evitare contaminazioni, utilizzare alcol assoluto per lavare i vetri di copertura e metterli in piedi nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti per asciugarli all'aria.

Quando i vetrini coprioggetti si sono asciugati, deporli nei pozzetti e seminare da 0,2 a 0,3 milioni di cellule in un millilitro di DMEM completo in ciascun pozzetto della piastra. Coltivare le cellule durante la notte. Il giorno seguente, all'interno di una cabina di biosicurezza, utilizzare 0,1 millilitri di terreno di trasfezione per diluire 0,6 microgrammi di un plasmide di espressione KIF5B wild type marcato con tdTomato o senza motore con o senza un plasmide che esprime una proteina cargo candidata.

In un'altra provetta per microcentrifuga da 1,6 millilitri, aggiungere 1,8 microlitri di reagente di trasfezione a 0,1 millilitri di mezzo di trasfezione. Quindi incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere 0,1 millilitri del reagente di trasfezione diluito ai campioni di DNA diluiti.

Capovolgere i tubi per mescolare il contenuto e centrifugare per cinque secondi. Quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 45 minuti. Durante il periodo di incubazione per la formazione del complesso di trasfezione, utilizzare PBS per lavare le cellule tre volte.

Quindi aggiungere 0,8 millilitri di terreno di trasfezione preriscaldato a ciascun pozzetto e rimettere le piastre nell'incubatore. Dopo che il reagente di trasfezione diluito ha incubato per 45 minuti, aggiungere 0,2 millilitri di soluzione goccia a goccia in ciascun pozzetto della piastra. Scuotere delicatamente la piastra a sei pozzetti per cinque secondi e rimetterla nell'incubatore a 37 gradi Celsius per sei-otto ore.

Quindi utilizzare il DMEM completo per sostituire il supporto. Per eseguire l'imaging di cellule vive dopo ulteriori 16 ore di incubazione, aggiungere il colorante intercalante di DNA Hoechst 33342 al terreno fino a una concentrazione finale di 1 micromolare e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, utilizzando un obiettivo 40X, esaminare le cellule per l'espressione di proteine fluorescenti.

Per eseguire l'immunofluorescenza indiretta su cellule che sono state incubate con reagente di trasfezione: Dopo aver preparato la paraformaldeide secondo il protocollo di testo, utilizzare PBS a temperatura ambiente per lavare le cellule facendo roteare la piastra a sei pozzetti per cinque secondi. Aggiungere un millilitro di paraformaldeide al 4% appena preparata e PBS per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi utilizzare il PBS per lavare le celle una volta facendo roteare la piastra e scartare la soluzione.

Successivamente, aggiungere un millilitro di Triton-X 100% allo 0,1% in PBS a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per permeabilizzare le cellule. Quindi utilizzare il PBS per lavare le celle quattro volte, scartando la soluzione dopo ogni lavaggio. Aggiungere gli anticorpi primari e incubare le cellule a temperatura ambiente con dondolo per quattro ore.

Dopo l'incubazione, utilizzare il PBS per lavare le cellule quattro volte facendo roteare la piastra. Quindi aggiungere un millilitro di anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescente e incubare al buio a temperatura ambiente con oscillazione per due ore. Dopo aver lavato le cellule quattro volte con PBS, aggiungere un millilitro di DAPI e incubare al buio a temperatura ambiente per dieci minuti.

Se si utilizzano occhiali di copertura con i campioni, applicare 10 microlitri di soluzione di montaggio al centro del vetrino del microscopio e montare un vetro di copertura sopra la soluzione di montaggio. Quindi incubare al buio a temperatura ambiente per una notte. Il giorno successivo, usa lo smalto per sigillare i bordi e incuba al buio in una cappa aspirante durante la notte.

Per eseguire la microscopia a fluorescenza, utilizzare un obiettivo 40X con i set di filtri per DAPI, CFP, FITC e Cy3, ove applicabile. Come dimostrato qui, il KIFB wild-type espresso esogenamente è apparso in modo omogeneo nel citoplasma, mentre c-MYC è apparso principalmente nel nucleo. Il mutante KIF5B senza motore, tuttavia, ha formato aggregati nel citoplasma e questo ha portato all'aggregazione di c-MYC.

Inoltre, il KIF5B senza motore ha anche indotto l'aggregazione del c-MYC endogeno e del fattore di trascrizione p53, indicando che c-MYC e p53 sono entrambi i carichi della chinesina-1 e KIF5B regola la localizzazione subcellulare di entrambe le proteine endogene. Questa figura illustra che il movimento dei fattori di trascrizione da parte di KIF5B sembra essere specifico perché l'espressione del mutante KIF5B senza motore non ha influenzato la localizzazione subcellulare di c-Fos né ne ha causato l'aggregazione. Questi dati rivelano che il metodo dimostrato in questo video consente l'identificazione ad alta specificità dei carichi Kinesin-1.

Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che le chinesine sono più adatte per le cellule che hanno molto volume di citoplasma in modo che l'aggregazione nel citoplasma possa essere facilmente osservata. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei motori molecolari per costruire mutanti negativi dominanti simili di altre chinesine e miosine al fine di identificare i loro carichi particolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il mutante negativo dominante di un motore molecolare per identificare questo carico, utilizzando la microscopia fluorescente.

Non dimenticare che lavorare con feno, bromuro di etidio e paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e devono sempre essere prese precauzioni per evitare il contatto diretto della pelle con essi durante l'esecuzione di questa procedura. Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con il tuo esperimento.