Selective cellulare eliminazione dalla misto Cultura 3D utilizzando una tecnica Near Infrared Photoimmunotherapy
14 marzo 2016
Eliminare cellule specifiche senza danneggiare altre cellule è estremamente difficile, specialmente nei tessuti consolidati, ma c'è un urgente bisogno di un metodo di eliminazione cellulare nel campo dell'ingegneria tissutale. Qui, presentiamo un metodo per l'eliminazione di cellule specifiche da una coltura cellulare 3D mista utilizzando la fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT).
L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è dimostrare l'eliminazione di specifiche cellule di interesse da una coltura cellulare tridimensionale mista mediante fotoimmunoterapia a infrarossi vicini. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale riguardo alla medicina rigenerativa. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata contro una varietà di molecole bersaglio e che il trattamento può essere limitato a lesioni specifiche di interesse.
Questo può ridurre al minimo l'effetto collaterale. Per la coniugazione di IR700 agli anticorpi monoclonali, incubare gli anticorpi di interesse con IR700 in Fosfato Biodisodico in un tubo da microcentrifuga a temperatura ambiente per un'ora, coperto con carta d'alluminio. Al termine dell'incubazione, lavare una colonna PD10 due volte con 15 millilitri di PBS.
Successivamente, caricare la soluzione di anticorpo sulla colonna e purificare la miscela mediante eluizione con PBS seguendo le istruzioni del produttore. Per confermare il numero di molecole di fluoro-4 coniugate a ciascuna molecola di anticorpo monoclonale, utilizzare uno spettrofotometro per determinare la concentrazione proteica dell'anticorpo monoclonale. Successivamente, conservare il coniugato a 4 gradi Celsius.
Per preparare la coltura cellulare 3D mista, aggiungere 1 millilitro di acqua sterile nella sezione del serbatoio della piastra a goccia sospesa da 96 pozzetti. Successivamente, seminare diversi rapporti dei tipi cellulari di interesse nel mezzo di coltura cellulare appropriato, con almeno 5.000 cellule per 50 microlitri di mezzo per pozzetto, per un periodo di cinque a sette giorni in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di anidride carbonica. Cambiare il mezzo di coltura ogni due giorni e osservare quotidianamente la morfologia e le dimensioni degli sferoidi mediante microscopio a campo chiaro invertito con un ingrandimento da 10 a 40 volte.
Quando gli sferoidi hanno raggiunto un diametro compreso tra 400 e 600 micron, sostituire il mezzo della piastra a goccia sospesa con mezzo contenente il coniugato anticorpo-fotoassorbente e reinserire la piastra nell'incubatore per sei ore. Al termine dell'incubazione, lavare gli sferoidi due volte con mezzo di coltura fresco privo di rosso fenolo. Successivamente, utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri con l'estremità tagliata per trasferire uno sferoide alla volta in singole piastre da 50 millimetri con fondo in vetro contenenti 100 microlitri di mezzo di coltura fresco privo di rosso fenolo per ogni piastra.
Utilizzare il microscopio invertito per osservare i cambiamenti nella morfologia degli sferoidi. Per irradiare gli sferoidi, posizionare un diodo a emissione luminosa a non più di 5 pollici sopra le piastre con fondo in vetro. Utilizzare un misuratore di potenza ottica per verificare l'emissione di una lunghezza d'onda compresa tra 670 e 710 nanometri a 2 joule per centimetro quadrato.
Dopo la fotoimmunoterapia con infrarosso vicino (NIR), trasferire gli sferoidi in una nuova piastra per gocce sospese con 50 microlitri di mezzo di coltura fresco per pozzetto, per un giorno nell'incubatore per colture cellulari. Successivamente, utilizzando un'altra punta da pipetta da 200 microlitri con l'estremità tagliata, trasferire delicatamente gli sferoidi in nuove piastre con fondo in vetro contenenti 100 microlitri di mezzo di coltura privo di rosso fenolo e valutare l'espressione del reporter ottico al microscopio fluorescente. Infine, rilevare le cellule morte aggiungendo ioduro di propidio al mezzo.
O mediante la perdita della fluorescenza citoplasmatica di GFP. In questo esperimento rappresentativo, sferoidi misti composti da diverse proporzioni di cellule A431-luc-GFP e 3T3-RFP sono stati preparati come appena illustrato. È stata quindi eseguita una fotoimmunoterapia ripetuta nell'infrarosso vicino (NIR) con l'incubazione di panitumumab-IR700 come mostrato.
E l'eliminazione delle cellule bersaglio è stata monitorata mediante la valutazione dell'attività fluorescente e della luciferasi nelle colture a goccia sospesa. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'energia luminosa diminuisce secondo la legge dell'inverso del quadrato.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per l'eliminazione specifica di cellule bersaglio da una coltura cellulare tridimensionale mista mediante fotoimmunoterapia nell'infrarosso vicino (NIR-PIT). Questa tecnica affronta le sfide nell'ingegneria tissutale minimizzando i danni alle cellule circostanti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria tissutale
- Biologia cellulare
- Photoimmunoterapia
Sfondo
- L'eliminazione di cellule specifiche in tessuti già formati è una sfida complessa.
- Esiste la necessità di metodi mirati per l'eliminazione cellulare nella medicina rigenerativa.
- La NIR-PIT può indirizzarsi selettivamente a cellule senza influenzare i tessuti adiacenti.
- Questo metodo può essere applicato a diverse molecole bersaglio.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'eliminazione di cellule specifiche da colture cellulari tridimensionali.
- Esplorare le implicazioni per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.
- Minimizzare gli effetti collaterali associati ai metodi tradizionali di eliminazione cellulare.
Metodi Utilizzati
- Coniugazione di IR700 ad anticorpi monoclonali.
- Incubazione di anticorpi con IR700 in fosfato bivalente di sodio.
- Lavaggio delle colonne PD10 con PBS.
- Applicazione della NIR-PIT per colpire cellule specifiche.
Risultati principali
- Eliminazione efficace delle cellule bersaglio da colture miste.
- Dimostrata specificità della NIR-PIT nel colpire le lesioni.
- Danno minimo alle cellule non bersaglio.
- Potenziale per applicazioni più ampie nella medicina rigenerativa.
Conclusioni
- La NIR-PIT è un metodo efficace per l'eliminazione specifica delle cellule.
- Questa tecnica può far progredire le strategie di ingegneria tissutale.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorarne il potenziale completo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa, l'eliminazione di cellule contaminanti o tumorigeniche specifiche da colture tridimensionali complesse senza danneggiare le popolazioni cellulari desiderate rimane una sfida fondamentale. La fotoimmunoterapia a infrarossi vicini (NIR-PIT) offre un approccio mirato per ablare selettivamente le cellule indesiderate preservando l'integrità del tessuto, favorendo modelli preclinici più sicuri e affidabili. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica delle terapie cellulari prima della traduzione in vivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'eliminazione selettiva di popolazioni cellulari specifiche per valutarne i contributi funzionali in colture miste.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico attraverso l'eliminazione precisa di cellule tumorali o fuori bersaglio, riducendo i segnali falsi positivi nei saggi funzionali.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio consentendo ai ricercatori di isolare gli effetti della rimozione delle cellule bersaglio sulla morfologia degli sferoidi, sulla vitalità e sull'attività del reporter.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative mediante attività fluorescente e luciferasica per misurare l'efficienza e la specificità dell'eliminazione delle cellule bersaglio.
- Valore operativo: Produce output riproducibili e standardizzati quando gli anticorpi coniugati vengono purificati e convalidati mediante spettrofotometria, consentendo la scalabilità del saggio.
- Prontezza del saggio: Prepara modelli validati di sferoidi 3D per lo screening di composti successivi, garantendo una composizione cellulare definita prima del trattamento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Utilizza modelli di sferoidi 3D (diametro di 400–600 μm) che riproducono in modo più accurato l'architettura tissutale in vivo, migliorando la rilevanza per le applicazioni nella medicina rigenerativa.
- De-risking Meccanicistico: Dimostra un indirizzamento specifico alla lesione senza danneggiare le cellule adiacenti, affrontando le preoccupazioni relative alla sicurezza legate agli effetti fuori bersaglio nelle terapie cellulari.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Permette la valutazione dell'indice terapeutico confrontando la perdita delle cellule bersaglio (mediante ioduro di propidio o perdita di GFP) con il mantenimento dell'integrità del sferoide non bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La NIR-PIT si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio al perfezionamento dei modelli preclinici, in particolare nei casi in cui è necessario un controllo spaziale sulle popolazioni cellulari per valutare la specificità e la sicurezza terapeutica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la rimozione condizionale di specifici tipi cellulari (ad esempio, A431-luc-GFP) da colture in co-coltura per chiarire le dipendenze dei percorsi e i ruoli funzionali.
- Screening: Migliora l'affidabilità dei saggi generando modelli 3D standardizzati e privi di contaminanti dopo ablazione selettiva, aumentando la riproducibilità tra diversi cicli di test dei composti.
- Analisi: Fornisce letture multiplex (fluorescenza, luciferasi, ioduro di propidio) per quantificare la cinetica e la specificità dell'eliminazione, sostenendo decisioni basate sui dati di tipo go/no-go.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la rilevanza fenotipica utilizzando sistemi di coltura 3D che preservano le interazioni tra cellule, collegando i risultati in vitro alla validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare adattabile a diversi bersagli mediante coniugazione di anticorpi con IR700, consentendo il riutilizzo in progetti multipli rivolti a diversi marcatori della superficie cellulare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo consentendo studi meccanicistici mediante un controllo spaziale preciso sull'eliminazione cellulare in modelli complessi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a protocolli standardizzati di coniugazione, purificazione e irradiazione (2 J/cm² a 670–710 nm), riducendo la variabilità nei risultati dell'eliminazione.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico in fase avanzata consentendo una valutazione precoce della rimozione di contaminanti tumorigeni, informando una produzione più sicura delle terapie cellulari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio generando dati comparativi chiari sulla perdita cellulare selettiva rispetto a quella non selettiva in colture miste.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coniugazione di anticorpi, nella quantificazione spettrofotometrica e nella gestione di colture tridimensionali per garantire una preparazione costante degli anticorpi coniugati a IR700.
- Presuppone l'accesso a sorgenti luminose a LED e a misuratori di potenza ottica per un'erogazione precisa della luce infrarossa nel range 670–710 nm a una fluenza definita.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda le dimensioni degli sferoidi (400–600 μm) e i tempi di incubazione (6 ore di incubazione con l'anticorpo, recupero post-NIR) al fine di mantenere la riproducibilità.
- Comporta la necessità di adattamenti nel trasferire la tecnica a diversi tipi cellulari o matrici extracellulari, poiché la profondità di penetrazione e la disponibilità dell'anticorpo possono variare.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'attenuazione della luce secondo la legge dell'inverso del quadrato, che richiede un accurato controllo della distanza (<5 pollici) tra la sorgente LED e la coltura durante l'irradiazione.
