Name: Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Impara l'isolamento di leucociti infiltranti dalla pelle di topo mediante digestione enzimatica e separazione a gradiente di densità. Questo metodo efficace ed economico facilita lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari nelle patologie cutanee.

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Il National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la National Association Vulvodinia (premio a DC), e Macalester College di sostenuto questo lavoro. CB ha ricevuto una borsa di studio dalla Macalester College di Beckman Scholars Program, finanziato dal Arnold e Mabel Beckman Foundation. BTF e TM sono supportati da JDRF 2-2011-662. Ringraziamo il Dr. Jason Schenkel e il Dr. Giuliana Lewis per un parere tecnico, e tutti i membri attuali e precedenti del laboratorio Chatterjea per il loro aiuto e sostegno.

Nota: i topi 8-12 settimane vecchia femmina ND4 svizzero Webster, convenzionalmente sono alloggiati con libero accesso a cibo e acqua, sono stati utilizzati per questi studi Il protocollo sperimentale utilizzato (B13S1) è stato approvato dal IACUC del Macalester College.. 1. Sensibilizzazione e sfida con Oxazolone <ol><li> Giorno 0 <ol><li> Preparare camera di anestesia con l&#39;aggiunta di 3 ml di isoflurano per asciugamani assorbenti posizionati sotto rete in fondo a un 4 L con coperchio vaso di vetro. Per i topi ND4 femminile usato qui, il tempo nella camera è 30-60 secondi fino a quando il soggetto è adeguatamente anestetizzato; ottimizzare la somministrazione di anestetici per utilizzarlo ceppo di topi. </li><li> Radere la schiena di ogni topo anestetizzato e affiancare con un trimmer peli di animali. </li></ol></li><li> Giorno 1 <ol><li> Effettuare una soluzione al 2% di 4-ethoxymethylene-2-fenil-2-ossazolin-5-one (Ox) in etanolo assoluto, e incubare a 50 ° C per 15 minuti su un piatto rotante in un incubatore. </li><li> Brevemente anestetizzaretopo, utilizzando anestesia isoflurano come descritto al punto 1.1.1 e applicare 100 ml di 2% bue alla schiena rasata in diverse applicazioni di serie di circa 20 ml ciascuno. Attendere 5-10 secondi tra le applicazioni di serie per la soluzione ad asciugare. </li><li> Fare attenzione per evitare di versare la soluzione Bue 2% sulle regioni diverse dalla schiena, e aspettare che la soluzione ad asciugare tra le applicazioni. </li></ol></li><li> Giorni 5-7 <ol><li> Fare una soluzione 1% di (Ox) in etanolo assoluto, e incubare a 50 ° C per 15 minuti su un piatto rotante in un incubatore. </li><li> Delicatamente ma con fermezza immobilizzare il mouse alla collottola della base del collo e la coda con l&#39;addome rivolto verso l&#39;alto e il collo leggermente inclinata verso il basso (simile a una presa per un&#39;iniezione intraperitoneale) e applicare 100 ml di 1% Bue al fianco rasato in diverse applicazioni di serie e il tempo per asciugare la pelle poi come descritto sopra. </li><li> Per i topi di controllo, applicare 100 ml di veicoli etanolo assoluto per il flan rasatoK. </li></ol></li></ol> 2. Fianco pelle Harvest <ol><li> Euthanize topi utilizzando anidride carbonica e l&#39;inalazione accise accuratamente la zona desiderata della pelle del fianco (~ 25 mm x 25 mm della cute) con 10 cm forbici chirurgiche. </li><li> Utilizzando una lama chirurgica tagliente pulito, raschiare via il grasso in eccesso e il tessuto connettivo della pelle del fianco. </li><li> Posizionare 3 pezzi di pelle fianco da 3 topi in una provetta conica da 50 ml contenente 10 ml di HBSS RT [con rosso fenolo, senza calcio o magnesio, 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 10 mM 4- (2-idrossietil) -1- L&#39;acido piperazineethanesulfonic (HEPES), e siero fetale bovino al 10% (FBS)]. </li></ol> 3. Pre-digestione del tessuto di lavaggio <ol><li> Luogo tubo contenente frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente per 10 secondi al termine del periodo di incubazione. </li><li> Filtrare il contenuto del tubo attraverso un 70 microncolino per eliminare il tampone di lavaggio e raccogliere il tessuto. Un unico filtro può essere riutilizzato durante tutta la procedura in un gruppo di trattamento biologico. </li><li> Utilizzando un paio di pinze, di trasferire la pelle del fianco dal filtro in un nuovo tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di fresco, RT HBSS media (contenenti EDTA, HEPES, e FBS come descritto sopra). </li><li> Con un paio di forbici chirurgiche sezionare immersi nel tubo 12,5 centimetri, tritare ogni pezzo di pelle del fianco in modo che il pezzo di tessuto media è di circa 2,2 mm x 2,2 millimetri nella zona. </li><li> Luogo tubo contenente frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente per 10 secondi alla fine dell&#39;incubazione </li></ol> 4. Collagenase Digestione di pelle <ol><li> Filtrare il contenuto del tubo attraverso un filtro 70 micron, raccogliere e trasferire i pezzi della pelle del fianco in una nuova provetta conica da 50 ml contenente 10 ml fresh, RT HBSS multimediale integrato con 0,7 mg / ml collagenasi D. </li><li> Tubo Luogo terreno contenente la digestione e frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C. </li><li> Contenuti vortice di tubo vigorosamente per 10 secondi al termine dell&#39;incubazione. </li><li> Filtro contenuto della provetta attraverso un filtro 70 micron in una nuova provetta da 50 ml; mantenere il flusso continuo contenente il tessuto digerito e gettare il filtro e affiancare i residui della pelle. </li><li> Lavare il flusso continuo in 50 ml di HBSS supporti, centrifugare per 5 minuti a 350 g, e decantare il surnatante. </li></ol> 5. Densità centrifugazione gradiente <ol><li> Usando una pipetta sierologica, aggiungere 3 ml di RT 67% gradiente di densità centrifugazione media in 1X tampone fosfato salino (PBS) in un nuovo tubo da 15 ml per ogni campione. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 5 ml RT 44% di densità supporti centrifugazione in gradiente in HBSS con rosso fenolo. </li><li> Gentiluomoly strato 5 ml di media centrifugazione in gradiente di densità 44% contenente le cellule sulla parte superiore del gradiente di densità centrifugazione campione supporti 67% utilizzando una pipetta sierologica. Assicurarsi di impostare la pipetta alla velocità più bassa, e posizionare la pipetta lungo la parete del tubo conico. Fare attenzione a non tremare, interrompere o invertire il gradiente. </li><li> Impostare l&#39;accelerazione sul valore più basso, disinserire il freno, e centrifugare il gradiente a 931 xg per 20 minuti a temperatura ambiente facendo in modo che la centrifuga è equilibrata. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il gradiente dalla centrifuga, e trasportare delicatamente per il banco di laboratorio tiene il tubo in posizione verticale. Utilizzando un 5 ml plastica trasferimento pipetta, rimuovere lo strato di cellule all&#39;interfaccia dei mezzi di centrifugazione in gradiente di densità 44% e il 67% e il trasferimento in una nuova provetta conica da 15 ml. Se l&#39;interfaccia non è visibile, è sufficiente rimuovere circa 2 ml di liquido al 67% -44% di confine. </li><li> Riempire il tubo conico contenente cellule dal interfaccia con il 2% FBS in 1X PBS freddo, le cellule centrifugare per 5 minuti a 350 xg, e decantare il surnatante. Nota: Questa è la prima volta che le cellule possono essere raffreddati / mantenuto freddo, in quanto mineralizzazione sono a 37 ° C e gradini multimediali gradiente di densità di centrifugazione sono a RT. Le celle possono essere risospese in 1: 1 Trypan blue diluizione e conteggi e informazioni redditività possono essere ottenute a questo punto. </li></ol> 6. Blocco e colorazione per analisi citofluorimetrica <ol><li> Blocco FcγRII / recettori III sulle cellule per prevenire non specifica colorazione anticorpi. Per gli esperimenti descritti, fare Master Mix anticorpo in PBS con il 2% FBS contenente diluizione 1: 100 di anticorpi non coniugato contro CD16 / 32 (2.4G2) per legare e recettori blocco FcγRII / III. </li><li> Incubare le cellule bloccate con le opportune Master Mix di anticorpi contro CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), nonché Brilliant Violet 510 vivo macchia / morti per identificare le cellule morte. Utilizzare tutti gli anticorpi sia alla diluizione raccomandata dai produttori o precedentemente ottimizzata dai ricercatori. Per gli esperimenti qui descritti, utilizzare tutti gli anticorpi a diluizione 1: 100. </li><li> Lavare le cellule e risospendere in 50 microlitri PBS 1X tampone colorazione con 2% FBS. Tenere in ghiaccio fino a quando i dati di fluorescenza possono essere acquisiti su un citofluorimetro. Nota: è importante avere i parametri di compensazione pre-ottimizzati con un tessuto linfoide e un antigene di superficie cellulare comune (come CD4 o CD8) prima acquisizione dei dati di fluorescenza. </li><li> Per aumentare il numero di cellule per il flusso downstream citometria acquisire dati da campioni interi di cellule colorate. </li></ol> 7. Analisi Citometria a flusso di dati utilizzando metodi standard per realizzare il procedura descritta di seguito <ol><li> In primo luogo, porta sulla regione dei linfociti del forward scatter(area) da scatter laterale (area) trama. </li><li> Quindi, selezionare singole cellule utilizzando la dispersione in avanti (larghezza) per scatter laterale (larghezza), al fine di evitare l&#39;analisi doppiette. Questo può anche essere realizzato con un altezza scatter in avanti per l&#39;altezza side scatter plot. </li><li> Poi, cancello sulla stirpe (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negativa e CD3 positivi eventi, di escludere i macrofagi, le cellule cellule dendritiche, e B, rispettivamente, e confine analizza al compartimento delle cellule T, se l&#39;obiettivo è, come qui, per valutare infiltrante cellule T. </li><li> Avanti, porta in cellule vive che escludono il live macchia / morti. </li><li> Infine, cancello sulla popolazione di cellule (vedi rappresentante la sezione risultati). </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari o di altro da dichiarare.

Caratterizzare cambiamenti nei leucociti pelle-residenti in modelli di roditori di malattie della pelle come la dermatite atopica o psoriasi è importante per capire i collegamenti meccanicistici tra afflusso di cellule infiammatorie e la patologia della malattia. Qui si descrive una tecnica economica per isolare leucociti dal tessuto della pelle con attrezzature di base trova nella maggior parte dei laboratori di ricerca biomedica. Questa tecnica relativamente rapida evita l&#39;uso di macchine dissociazione tissue cost...

Le condizioni della pelle che vanno da dermatite da contatto, eczema, psoriasi, cellulite, infezioni fungine e ascessi a tumori cutanei non-melanoma sono risultati essere tra le 50 malattie più diffuse a livello mondiale, e la quarta causa globale di malattie non mortali nel 2010 1. Di conseguenza, l&#39;indagine dei meccanismi molecolari e cellulari alla base diverse patologie della pelle è una zona necessaria e attiva di ricerca. Modelli di roditori sono stati notevolmente utili per la comprensione delle condizioni infiammatorie della pelle come la dermatite atopica 2, 3 psoriasi, o infezione da Staphylococcus aureus 4. Protocolli economici, efficienti e semplici per la digestione enzimatica del tessuto cutaneo mouse può fornire preparazioni di cellule che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle per comprendere meglio la fisiopatologia di malattie della pelle. Qui, un metodo semplice ed economico è descritto per digerito enzimatico di pelle topotessuto e l&#39;isolamento di leucociti infiltranti pelle che può essere utilizzato per la coltura cellulare, in vivo trasferimento adottivo, analisi citofluorimetrica e smistamento o studi di espressione genica. L&#39;obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare una sospensione singola cella di leucociti-pelle infiltrante con la vitalità delle cellule di alta minimizzando i costi tipicamente associati con kit di reagenti personalizzate e dissociatori meccanici. Esistenti tessuto cutaneo metodi di dissociazione 5-7 può provocare vitalità delle cellule e la superficie di integrità basso marcatore, o richiedere i kit di enzimi personalizzate e costose macchine di dissociazione dei tessuti 8-11. Mentre la digestione del tessuto cutaneo orecchio del mouse è ragionevolmente diffusa 12-13, digerire il tessuto della pelle altamente cheratinizzato (ad esempio, dal fianco) può risultare in preparazioni di cellule contaminate con grandi quantità di detriti non cellulare. In un recente studio, Zaid e colleghi hanno digerito la pelle del fianco del mouse per 90 minuti a 2,5 mg / ml dispasi, follocon a capo 45 min a 3 mg / ml di collagenasi 7. In un altro studio, questi ricercatori hanno utilizzato più incubazioni con una digestione combinato di 2,5 ore, compreso l&#39;uso di tripsina / EDTA, collagenasi III, e dispasi 5. L&#39;uso di tripsina non è raccomandato per la digestione enzimatica della pelle, come il trattamento con tripsina da diversi costruttori ha mostrato di influenzare misurabile l&#39;integrità delle proteine ​​di superficie cellulare su cellule di mammifero 14-15. Inoltre, dispasi può avere effetti significativi sulla capacità proliferativa delle cellule CD4 e CD8α T e influenzare l&#39;abbondanza superficie di almeno 20 molecole, tra cui comune T marcatori di attivazione delle cellule, quali CD62L 16. Altri protocolli utilizzano RPMI 1640 nel mezzo di digestione 6. Tuttavia, la presenza di Mg 2+ e Ca 2+ in RPMI può causare aggregazione vasta cella 17. Un protocollo ideale per la dissociazione di tessuto dovrebbe puntare per la vitalità delle cellule in alto, bassolivelli di aggregazione delle cellule, e il minimo danno al cellulare proteine ​​di superficie. Alta qualità preparazioni cellulari linfonodo stromali sono stati compiuti con protocolli che utilizzano enzimi incubazione più brevi, Ca 2+ e Mg 2+ media liberi, e di evitare tripsina e dispasi 18. Tuttavia, non sono state stabilite protocolli di questo tipo per la dissociazione di tutta la pelle del mouse. Qui, un protocollo è descritto a dissociarsi, isolare, e arricchire leucociti-pelle infiltrazione dalla pelle del mouse fianco allergene-sfidati. In breve, la pelle asportata è pre-incubato in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con siero fetale bovino 10% per 1 ora per ammorbidire i tessuti per la digestione e rimuovere il tessuto adiposo della pelle o morti in eccesso. Questa è seguita da una fase 30 min di digestione enzimatica con 0,7 mg / ml di collagenasi D. collagenasi D ha effetti minimi sulla densità di marcatori di superficie cellulare, e nessun effetto sulla proliferazione delle cellule T in vitro 16,18, rendendoparticolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la caratterizzazione delle proteine ​​di superficie. A seguito di digestione enzimatica, discontinua gradiente di densità centrifugazione è stato utilizzato per rimuovere le cellule epiteliali e detriti dalla cella singola sospensione e arricchire per le cellule ematopoietiche. È importante sottolineare che questo procedimento evita costosi cellulari magnetico reagenti separazione basati su colonne e macchine dissociazione tissutale 8-11, e può essere eseguita con attrezzature e materiali trovati in un laboratorio di base ricerca biomedica. Ecco questo protocollo è stato utilizzato per isolare leucociti dalla pelle fianco sfidato tre volte con il oxazolone aptene (bue) in precedenza sensibilizzati topi ND4 svizzeri (adattato da 19). Le cellule sono state analizzate utilizzando citometria a flusso multiparametrica. Questa tecnica ha prodotto una sospensione cellulare con detriti minima e&gt; 95% vitalità dei linfociti isolati che sono state analizzate mediante flusso multi-parametrica citometria a misurare l&#39;infiltrazione di linfociti T e neutrofili nella sk interessatoin.

<table><tbody><tr><td>HBSS con rosso fenolo, senza calcio, senza magnesio, liquido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Conservare sterile fino al giorno dell'uso.</td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5% (titolazione)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di sale disodico EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Conservare sterile fino al giorno dell'uso.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, USDA, inattivato al calore, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Conservare sterile fino al giorno dell'utilizzo.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8,5-9,5 (25&deg; C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Mantenere sterile. Prima dell'uso, il Percoll deve essere reso isotonico con 10X PBS sterile.</td></tr><tr><td>Kit combinato per rifinitore</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&nbsp;</td><td>Usa il rifinitore più grande per radere il fianco e la schiena.</td></tr><tr><td>4-etossimetilene-2-fenil-2-ossazolin-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>si scioglie in 100% EtOH a 50 gradi; C per 15 minuti su un piatto rotante.</td></tr><tr><td>Anti-topo purificato CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Anticorpo utilizzato per bloccare il legame anticorpale non specifico durante la colorazione degli anticorpi per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per il flusso citometria</td></tr><tr><td>anti-CD8&alfa;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Colorante di vitalità per citometria a flusso</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>Analizzatore cellulare N/A</td><td>(18 parametri)</td></tr><tr><td>Collagenasi D da Clostridium histolyticum</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Aliquot enzima liofilizzato a 5 mg/ml in HBSS con rosso fenolo, senza calcio e senza magnesio in aliquote da 1 ml. Conservare immediatamente a -20 gradi C per un massimo di sei mesi.</td></tr><tr><td>ND4 Topi femmina svizzeri</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 settimane; alloggiati convenzionalmente con libero accesso a cibo e acqua e utilizzati secondo le linee guida IACUC del Macalester College.</td></tr></tbody></table>

isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica digest e separazione gradient

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociare la pelle murina in una sospensione a singola cellula è essenziale per l'analisi cellulare a valle, come la caratterizzazione delle cellule immunitarie infiltranti in modelli di infiammazione cutanea di roditori. Qui, descriviamo un protocollo per la digestione della pelle di topo in una soluzione ricca di sostanze nutritive con collagenasi D, seguita dalla separazione delle cellule ematopoietiche utilizzando un gradiente di densità discontinuo. Le cellule così ottenute possono essere utilizzate per studi in vitro, trasferimento in vivo e altre analisi cellulari e molecolari a valle, compresa la citometria a flusso. Questo protocollo è un'alternativa efficace ed economica ai costosi dissociatori meccanici, alle colonne di separazione specializzate e ai metodi di digestione più severi basati su tripsina e dispasi, che possono compromettere la vitalità cellulare o la densità delle proteine di superficie rilevanti per la caratterizzazione fenotipica o la funzione cellulare. Come mostrato qui nei nostri dati rappresentativi, questo protocollo ha prodotto cellule altamente vitali, conteneva sottogruppi di cellule immunitarie specifiche e non ha avuto alcun effetto sull'integrità delle comuni proteine marcatrici di superficie utilizzate nell'analisi citofluorimetrica.

Collagenasi D trattata splenociti presentano livelli simili di CD4 e CD8 α sulle cellule T rispetto ai controlli multimediali trattati In primo luogo, gli effetti potenziali di collagenasi D sulla frequenza e la superficie abbondanza di lignaggio e di attivazione marcatori su sottogruppi di cellule T sono stati valutati utilizzando tessuto linfoide secondario come controllo. Una sospensione di splenociti ottenuti da topi è stato N...

Questo protocollo descrive la digestione enzimatica della pelle di topo in un terreno ricco di sostanze nutritive seguita dalla separazione in gradiente per isolare i leucociti. Le celle così derivate possono essere utilizzate per diverse applicazioni a valle. Si tratta di un'alternativa efficace, economica e migliorata alle macchine per la dissociazione dei tessuti e ai protocolli di digestione dei tessuti più aggressivi basati su tripsina e dispasi.

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i leucociti infiltranti la pelle utilizzando la digestione enzimatica e la separazione in gradiente di densità. Questo metodo può essere applicato allo studio dei meccanismi cellulari e molecolari in molti modelli murini di patologie cutanee, inclusa la dermatite atopica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia dei leucociti infiltranti la pelle, può anche essere applicato allo studio di altre popolazioni cellulari residenti.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con il prelievo della pelle, che include una rimozione completa dei tessuti adiposi e connettivi in eccesso. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la raccolta della pelle e la gestione del gradiente di densità sono difficili da imparare e richiedono precisione e pratica. Al momento opportuno dopo il trattamento, utilizzare forbici chirurgiche da 10 centimetri per asportare con cura un'area di 25 x 25 millimetri di pelle rasata del fianco da un topo ND4 Swiss-Webster femmina adulta di otto a dodici settimane.Utilizzare una lama chirurgica pulita e affilata per raschiare via il grasso in eccesso e il tessuto connettivo dalla pelle, quindi trasferire la pelle in una provetta conica da 50 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS a temperatura ambiente integrato con EDTA, HEPES e FBS e predigerire il tessuto su una piastra rotante per 30 minuti in un tubo asciutto, non gassato, Incubatore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, agitare energicamente la provetta per dieci secondi e filtrare l'impasto tissutale attraverso un colino da 70 micron. Quindi, utilizzare un paio di pinze per trasferire i pezzi di pelle del fianco dal colino in una nuova provetta da 50 millilitri contenente dieci millilitri di terreno HBSS fresco a temperatura ambiente, integrato con EDTA, HEPES e FBS, quindi utilizzare un paio di forbici da dissezione chirurgica da 12,5 centimetri per tritare ogni pezzo di pelle del fianco in modo che il pezzo medio di tessuto abbia una dimensione di circa 2,2 per 2,2 millimetri.Quando tutti i pezzi sono stati tritati, rimettere la provetta sulla piastra rotante per altri 30 minuti di incubazione. Agitare energicamente la provetta per 10 secondi al termine dell'incubazione e filtrare il contenuto attraverso il colino da 70 micron. Raccogliere i pezzi rimanenti di pelle del fianco in una nuova provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS integrata con 0,7 milligrammi per millilitro di collagenasi D e rimettere la provetta sulla piastra rotante per un'altra incubazione di 30 minuti.Dopo altri 10 secondi di vortici, filtrare nuovamente il contenuto della provetta, questa volta scartando i detriti sul filtro, quindi riempire la provetta con un massimo di 50 millilitri di HBSS, EDTA, HEPES, FBS, far girare le cellule e decantare il surnatante. Aggiungere tre millilitri di terreno di centrifugazione in gradiente a temperatura ambiente con densità del 67% in PBS a una nuova provetta conica da 15 millilitri e risospendere il pellet della cella in cinque millilitri di terreno di centrifugazione in gradiente di densità al 44% a temperatura ambiente in HBSS con rosso fenolo. Impostando il pipettatore alla velocità più bassa, posizionare la pipetta sul lato della provetta e sovrapporre delicatamente le cellule sopra il mezzo di centrifugazione a gradiente di densità del 67%.Quando si lavora con i gradienti di densità, fare attenzione a evitare la formazione di bolle e a ridurre al minimo le interruzioni dell'interfaccia del gradiente. Quindi separare le cellule, utilizzando una pipetta di trasferimento da cinque millilitri per raccogliere le cellule all'interfaccia alla fine della centrifugazione. Poiché la stratificazione delicata del gradiente e l'estrazione accurata dell'interfaccia dei gradienti sono passaggi critici, è consigliabile praticare la stratificazione del terreno di centrifugazione del gradiente di densità e la rimozione dell'interfaccia con la sospensione di splenociti murini prima di tentare la procedura con le cellule sperimentali di interesse.Infine, lavare le cellule raccolte in PBS ghiacciato integrato con FBS in una provetta conica da 15 millilitri e contare il numero di cellule vitali per esclusione del blu di tripano. L'espressione di superficie di CD4 e CD8-alfa non è influenzata dalla digestione della collagenasi D, poiché lo stesso numero di cellule CD4 positive e CD8-alfa positive viene rilevato con o senza digestione enzimatica. Inoltre, la digestione della collagenasi D non mostra alcun effetto sulla densità superficiale dei marcatori di attivazione delle cellule T CD44 e CD62L sulle cellule T CD4 positive.Dopo la separazione in gradiente, circa 250 cellule immunitarie vitali per millimetro quadrato di tessuto laterale vengono isolate da Oxazolone, o topi Ox-challenged, contro solo quattro cellule immunitarie vitali per millimetro quadrato di tessuto in topi vehicle-challenged, precedentemente sensibilizzati con Ox.95% delle singole cellule a bassa dispersione in avanti e laterale nei topi Ox-challenged, e il 71% di queste cellule nei controlli vehicle-challenged sono cellule CD45 positive vive, equivalente a un aumento di circa 67 volte della popolazione di cellule immunitarie CD45 positive infiltranti nella pelle del fianco dopo tre sfide Ox giornaliere. Infatti, la sfida Ox provoca una pronunciata infiltrazione di cellule T e neutrofili nella pelle del fianco, con il 42% delle singole cellule CD45 vive negli animali trattati con Ox, i neutrofili positivi al Gr-1 apparenti e circa l'84% delle cellule T CD3 positive che esprimono CD8-alfa, o CD4, rispetto agli animali di controllo trattati con etanolo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa tre ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di gestire attentamente il gradiente di densità. Non dimenticare di utilizzare sempre il mezzo di centrifugazione in gradiente di densità a temperatura ambiente quando si esegue questa procedura. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi citofluorimetrica, lo smistamento cellulare, il trasferimento cellulare o la coltura cellulare in vitro per valutare il fenotipo e la funzione dei leucociti infiltranti la pelle.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i leucociti infiltranti la pelle utilizzando la digestione enzimatica e la centrifugazione in gradiente di densità.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo rapido per ottenere leucociti infiltrati dal cervello murino è descritto. Questo metodo utilizza una pendenza costante Percoll e gradiente discontinuo di Ficoll selezionare e purificare i leucociti arricchito strato. Leucociti isolati può quindi essere caratterizzata da misure di citometria a flusso.

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

Un modo efficace per isolare i linfociti di topo tratto genitale è descritto. Questo metodo si avvale di digestione enzimatica e la separazione gradiente Percoll per consentire l'isolamento efficiente. Questa tecnica è anche adattabile a per l'uso in altre...

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule mononucleate della lamina propria dal tessuto murino del colon mediante digestione enzimatica utilizzando la collagenasi E e la separazione in gradiente dei mezzi di separazione della densità a base di silice. Le celle mononucleate isolate possono essere utilizzate per le successive analisi a valle.

Isolamento di cellule mononucleate Lamina Propria: una tecnica di centrifugazione in gradiente di densità a base di silice per ottenere cellule mononucleate dal colon murino

Descriviamo un protocollo per isolare in modo efficiente le cellule T residenti nella pelle da biopsie cutanee umane. Questo protocollo produce un numero sufficiente di linfociti residenti nella pelle umana vitali per l'analisi citofluorimetrica e la coltura ex vivo.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

La pelle ospita una complessa rete di cellule immunitarie. Descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo, proveniente da diverse parti del corpo dell'animale, al fine di ottenere una sospensione unicellulare e analizzare le diverse popolazioni leucocitarie residenti nella pelle mediante citometria a flusso.

Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

Descriviamo qui un protocollo per isolare le cellule mieloidi dalla pelle di topo e drenare i linfonodi dopo l'iniezione intradermica di sporozoiti di Plasmodium. La citometria a flusso delle cellule raccolte fornisce un test affidabile per caratterizzare la risposta infiammatoria della pelle e drenante dei linfonodi al parassita.

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule mononucleari che risiedono nella lamina propria del colon dalla digestione enzimatica del tessuto usando il collagenae. Questo protocollo consente l'isolamento efficiente delle cellule mononucleari con conseguente sospensione a singola cellula che a sua volta può essere utilizzata per l'immunofenofizzazione robusta.

Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento di popolazioni vive immunitarie e non immuni dal polmone di topo allo stato stazionario e in seguito all'infezione influenzale. Fornisce inoltre strategie di gating per l'identificazione di sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi.

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

Impara l'isolamento di leucociti infiltranti dalla pelle di topo mediante digestione enzimatica e separazione a gradiente di densità. Questo metodo efficace ed economico facilita lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari nelle patologie cutanee.

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

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