Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i leucociti infiltranti la pelle utilizzando la digestione enzimatica e la separazione in gradiente di densità. Questo metodo può essere applicato allo studio dei meccanismi cellulari e molecolari in molti modelli murini di patologie cutanee, inclusa la dermatite atopica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia dei leucociti infiltranti la pelle, può anche essere applicato allo studio di altre popolazioni cellulari residenti.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con il prelievo della pelle, che include una rimozione completa dei tessuti adiposi e connettivi in eccesso. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la raccolta della pelle e la gestione del gradiente di densità sono difficili da imparare e richiedono precisione e pratica. Al momento opportuno dopo il trattamento, utilizzare forbici chirurgiche da 10 centimetri per asportare con cura un'area di 25 x 25 millimetri di pelle rasata del fianco da un topo ND4 Swiss-Webster femmina adulta di otto a dodici settimane.

Utilizzare una lama chirurgica pulita e affilata per raschiare via il grasso in eccesso e il tessuto connettivo dalla pelle, quindi trasferire la pelle in una provetta conica da 50 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS a temperatura ambiente integrato con EDTA, HEPES e FBS e predigerire il tessuto su una piastra rotante per 30 minuti in un tubo asciutto, non gassato, Incubatore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, agitare energicamente la provetta per dieci secondi e filtrare l'impasto tissutale attraverso un colino da 70 micron. Quindi, utilizzare un paio di pinze per trasferire i pezzi di pelle del fianco dal colino in una nuova provetta da 50 millilitri contenente dieci millilitri di terreno HBSS fresco a temperatura ambiente, integrato con EDTA, HEPES e FBS, quindi utilizzare un paio di forbici da dissezione chirurgica da 12,5 centimetri per tritare ogni pezzo di pelle del fianco in modo che il pezzo medio di tessuto abbia una dimensione di circa 2,2 per 2,2 millimetri.

Quando tutti i pezzi sono stati tritati, rimettere la provetta sulla piastra rotante per altri 30 minuti di incubazione. Agitare energicamente la provetta per 10 secondi al termine dell'incubazione e filtrare il contenuto attraverso il colino da 70 micron. Raccogliere i pezzi rimanenti di pelle del fianco in una nuova provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di HBSS integrata con 0,7 milligrammi per millilitro di collagenasi D e rimettere la provetta sulla piastra rotante per un'altra incubazione di 30 minuti.

Dopo altri 10 secondi di vortici, filtrare nuovamente il contenuto della provetta, questa volta scartando i detriti sul filtro, quindi riempire la provetta con un massimo di 50 millilitri di HBSS, EDTA, HEPES, FBS, far girare le cellule e decantare il surnatante. Aggiungere tre millilitri di terreno di centrifugazione in gradiente a temperatura ambiente con densità del 67% in PBS a una nuova provetta conica da 15 millilitri e risospendere il pellet della cella in cinque millilitri di terreno di centrifugazione in gradiente di densità al 44% a temperatura ambiente in HBSS con rosso fenolo. Impostando il pipettatore alla velocità più bassa, posizionare la pipetta sul lato della provetta e sovrapporre delicatamente le cellule sopra il mezzo di centrifugazione a gradiente di densità del 67%.

Quando si lavora con i gradienti di densità, fare attenzione a evitare la formazione di bolle e a ridurre al minimo le interruzioni dell'interfaccia del gradiente. Quindi separare le cellule, utilizzando una pipetta di trasferimento da cinque millilitri per raccogliere le cellule all'interfaccia alla fine della centrifugazione. Poiché la stratificazione delicata del gradiente e l'estrazione accurata dell'interfaccia dei gradienti sono passaggi critici, è consigliabile praticare la stratificazione del terreno di centrifugazione del gradiente di densità e la rimozione dell'interfaccia con la sospensione di splenociti murini prima di tentare la procedura con le cellule sperimentali di interesse.

Infine, lavare le cellule raccolte in PBS ghiacciato integrato con FBS in una provetta conica da 15 millilitri e contare il numero di cellule vitali per esclusione del blu di tripano. L'espressione di superficie di CD4 e CD8-alfa non è influenzata dalla digestione della collagenasi D, poiché lo stesso numero di cellule CD4 positive e CD8-alfa positive viene rilevato con o senza digestione enzimatica. Inoltre, la digestione della collagenasi D non mostra alcun effetto sulla densità superficiale dei marcatori di attivazione delle cellule T CD44 e CD62L sulle cellule T CD4 positive.

Dopo la separazione in gradiente, circa 250 cellule immunitarie vitali per millimetro quadrato di tessuto laterale vengono isolate da Oxazolone, o topi Ox-challenged, contro solo quattro cellule immunitarie vitali per millimetro quadrato di tessuto in topi vehicle-challenged, precedentemente sensibilizzati con Ox.95% delle singole cellule a bassa dispersione in avanti e laterale nei topi Ox-challenged, e il 71% di queste cellule nei controlli vehicle-challenged sono cellule CD45 positive vive, equivalente a un aumento di circa 67 volte della popolazione di cellule immunitarie CD45 positive infiltranti nella pelle del fianco dopo tre sfide Ox giornaliere. Infatti, la sfida Ox provoca una pronunciata infiltrazione di cellule T e neutrofili nella pelle del fianco, con il 42% delle singole cellule CD45 vive negli animali trattati con Ox, i neutrofili positivi al Gr-1 apparenti e circa l'84% delle cellule T CD3 positive che esprimono CD8-alfa, o CD4, rispetto agli animali di controllo trattati con etanolo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa tre ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di gestire attentamente il gradiente di densità. Non dimenticare di utilizzare sempre il mezzo di centrifugazione in gradiente di densità a temperatura ambiente quando si esegue questa procedura. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi citofluorimetrica, lo smistamento cellulare, il trasferimento cellulare o la coltura cellulare in vitro per valutare il fenotipo e la funzione dei leucociti infiltranti la pelle.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i leucociti infiltranti la pelle utilizzando la digestione enzimatica e la centrifugazione in gradiente di densità.