Migliorare 2D e 3D della pelle In Vitro modelli con Macromolecole affollamento

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di migliorare la deposizione della matrice extracellulare e migliorare gli attuali modelli cutanei 2D e 3D utilizzando l'affollamento macromolecolare. L'affollamento migliora la generazione di matrici derivate da cellule e le colture organotipiche mature in un lasso di tempo condensato. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale perché offre modi migliori per generare matrici extracellulari derivate da cellule per la bioingegneria della pelle e di altri tessuti.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le matrici derivate da cellule e i costrutti organotipici della pelle possono essere generati in un lasso di tempo significativamente condensato quando si applica l'affollamento macromolecolare a queste colture. La tecnica della microscopia a riflessione per interferenza consente di visualizzare la deposizione totale della matrice extracellulare senza la necessità di colorazione con anticorpi. Le applicazioni di queste tecniche si estenderanno dagli studi sulla deposizione di matrice extracellulare da parte delle cellule cutanee al miglioramento delle terapie delle ferite, in particolare con la generazione di migliori equivalenti cutanei e colture tissutali per l'innesto.

Per iniziare, seminare 50.000 fibroblasti primari, cheratinociti primari o una co-coltura di entrambi, in un millilitro di terreno pro well, nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Lasciare che le cellule aderiscano in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica durante la notte. Quindi, scartare il vecchio terreno e sostituirlo con un millilitro di terreno fresco contenente crowder macromolecolari e acido ascorbico 100 micromolare.

Incubare le colture per sei giorni, cambiando il terreno ogni due giorni. Eseguire l'immunofluorescenza e il Western blotting secondo il protocollo di testo. Per creare e utilizzare una matrice derivata da cellule, dopo aver coltivato le cellule per sei giorni con crowder molecolari e acido ascorbico come appena dimostrato, decellularizzare gli strati cellulari per ottenere una matrice derivata da cellule utilizzando prima 1X PBS per lavare gli strati cellulari due volte.

Aspirare il PBS, quindi aggiungere 250 microlitri di desossicolato di sodio allo 0,5% e incubare su ghiaccio per 10 minuti. Aspirare il lisato cellulare, quindi aggiungere altri 250 microlitri di desossicolato di sodio allo 0,5% e ripetere l'incubazione e l'aspirazione di 10 minuti altre due volte. Utilizzare acqua distillata per lavare due volte la matrice derivata dalle cellule.

Aspirare l'acqua, quindi aggiungere 1X PBS. Conservare la matrice a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per preparare una sospensione cellulare secondaria, aspirare il PBS dalla matrice e seminare 50.000 cheratinociti sopra il tappetino F, ad esempio.

Lasciare che le cellule aderiscano per una notte. Per eseguire la microscopia a riflessione per interferenza, o RIM, su una matrice derivata da cellule, eseguire l'acquisizione di immagini utilizzando un microscopio confocale secondo il protocollo di testo. Per fondere un gel di collagene con fibroblasti incapsulati in un inserto di coltura cellulare, aliquotare 10 millilitri di collagene di coda di ratto di tipo uno in un becher freddo.

Aggiungere un millilitro di DMEM freddo e 0,5 millilitri di idrossido di sodio molare per neutralizzare il collagene acido. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di sospensione di fibroblasti. Utilizzando una pipetta fredda, dividere uniformemente i 12 millilitri di soluzione negli inserti di coltura cellulare in una piastra di coltura a sei pozzetti.

Incubare il gel a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un'ora. Una volta che il gel si è solidificato, immergerlo in mezzo di fibroblasti o FM. Quindi, dopo averlo incubato per 24 ore, aspirare l'FM. Utilizzare quattro millilitri di terreno fresco contenente crowder macromolecolari per sostituire il vecchio FM aggiungendo due millilitri all'interno dell'inserto di coltura cellulare e due millilitri all'esterno dell'inserto di coltura cellulare. Dopo un'incubazione di 24 ore, utilizzare l'agente imbroglione allo 0,125% di tripsina per trysonizzare i cheratinociti.

Picchiettare delicatamente i lati del pallone per rimuovere le cellule e aggiungere un terreno contenente siero per neutralizzare la tripsina. Dopo aver contato le cellule, preparare una sospensione di cheratinociti. Quindi, aspirare il terreno dagli inserti della coltura cellulare e aggiungere i cheratinociti alla parte superiore del gel.

Incubare il gel per un'ora. Dopo che i cheratinociti si sono attaccati alla superficie del gel, utilizzare due millilitri di KSFM o terreno privo di siero CTN-57 per immergere la cellula all'interno dell'inserto di coltura in gel e aggiungere due millilitri di FM all'esterno dell'inserto di coltura cellulare. Dopo un'incubazione di 24 ore, scartare il vecchio terreno e sostituirlo con un terreno fresco contenente crowder macromolecolari.

Dopo sette giorni nella coltura sommersa, per portare la coltura a un'interfaccia aria-liquido, trasferire l'inserto di coltura in una piastra a pozzetti profondi. Aggiungere 10 millilitri di terreno di stratificazione all'esterno dell'inserto di coltura cellulare, mantenendo asciutto l'interno dell'inserto. Infine, incubare le colture e cambiare il terreno ogni tre giorni per 14 giorni.

Raccoglili e lavorali secondo il protocollo di testo. Come mostrato qui, l'affollamento macromolecolare ha permesso ai fibroblasti di depositare più matrice extracellulare o ECM rispetto alle colture di controllo. Dopo la secolarizzazione, era evidente che i fibroblasti erano i principali depositanti di collagene uno, collagene quattro e fibronectina.

Questa cifra dimostra che sono stati i fibroblasti piuttosto che i cheratinociti i principali depositanti del collagene sette, e questo è il primo rapporto di successo della deposizione di collagene sette in vitro. Utilizzando RIM, è stata catturata l'intera estensione della matrice derivata dalla cellula. Una sovrapposizione dell'immagine RIM con la colorazione degli anticorpi mostra la quantità relativa di quel componente ECM in relazione alla quantità totale di ECM.

In un modello di pelle 3D in vitro, l'affollamento macromolecolare o MMC, ha ridotto il tempo di coltura da cinque settimane a tre, per ottenere una co-coltura cutanea organotipica matura. Come si vede qui, mediante colorazione H ed E, a tre settimane, la coltura con MMC consisteva in un'epidermide pleuristratificata e un derma stromolo a cresta. Inoltre, è stata rilevata un'intensa e continua immunocolorazione del collagene sette alla giunzione dermepidermica di colture cellulari affollate rispetto a un'immunocolorazione del collagene sette debole e macchiata nelle colture di controllo.

La microscopia elettronica a trasmissione mostra anche la presenza di fibrille di ancoraggio in colture organotipiche generate con MMC, mostrando collagene sette funzionale. Le matrici derivate da cellule potrebbero essere utilizzate per scopi di semina cellulare secondaria come scaffold alternativo poiché la complessità della matrice extracellulare viene mantenuta ed è prodotta dalle cellule stesse. Le colture cutanee organotipiche, che vengono generate sotto l'affollamento macromolecolare, potrebbero essere utilizzate come modello 3D della pelle migliorato in quanto contengono un derma della cresta stromale, una giunzione dermdermica principale e un'epidermide pleuristratificata.

Le colture organotipiche o equivalenti cutanee generate con crowder macromolecolari possono essere utilizzate anche per l'innesto cutaneo perché hanno una giunzione dermepidermica meglio sviluppata, che probabilmente migliorerà il successo dell'innesto. Oltre a migliorare la deposizione di matrice extracellulare, l'affollamento macromolecolare può essere applicato ad altri sistemi in vitro per migliorare le reazioni con velocità limitata, senza dover aumentare la quantità di reagenti. Ad esempio, le reazioni a catena della polimerasi.