Modellazione chemioterapia leucemia resistente In Vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare meglio la leucemia linfoblastica acuta resistente, o ALL, in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel trattamento della LLA refrattaria su come il microambiente del midollo osseo influenzi la resistenza chemioterapica delle cellule LLA. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è considerevolmente più economica e richiede meno tempo rispetto all'utilizzo di modelli animali tradizionali per esaminare l'advocacy dei farmaci sulle cellule refrattarie di LLA.

Iniziare seminando da cinque a 20 volte da 10 a seste cellule leucemiche in 10 millilitri di terreno di coltura specifico per il tumore su una piastra da 100 millimetri di cellule stromali confluenti del midollo osseo all'80-90% o osteoblasti. Ogni quattro giorni, inclinare la piastra di lato e aspirare tutto tranne un millilitro del terreno, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare aderente. Quindi, aggiungere con cautela nove millilitri di terreno di coltura cellulare leucemica fresca goccia a goccia nell'angolo della piastra lungo il lato per garantire una rottura minima delle cellule aderenti.

Dopo il 12° giorno di co-coltura, pipettare delicatamente il terreno di coltura su e giù sulla piastra circa 5-10 volte per raccogliere le cellule leucemiche galleggianti. E trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, riseminare le cellule su una nuova piastra di cellule stromali del midollo osseo confluenti all'80-90%, o osteoblasti, come appena dimostrato.

Entro il quarto giorno, si saranno formate tre sottopopolazioni di cellule leucemiche, con le cellule leucemiche sospese che fluttuano liberamente nel mezzo. Le cellule leucemiche Phase Bright aderiscono alla superficie del monostrato cellulare aderente e le cellule leucemiche Phase Dim migrano sotto il monostrato. Per preparare le colonne di perline G10, riscaldare prima 30 millilitri di terreno di coltura cellulare per colonna a 37 gradi Celsius a bagnomaria.

Quindi, usa le pinzette per tirare la lana di vetro in fili sottili e sciolti. E aggiungi più strati di filamenti leggermente impacchettati a una siringa da 10 millilitri per colonna necessaria. Quando la siringa è piena per 2/3, collegare un rubinetto unidirezionale in posizione chiusa alla punta e bloccare la siringa su un supporto ad anello sufficientemente alto da poter posizionare un tubo di raccolta conico da 50 millilitri sotto il rubinetto.

A questo punto, posizionare una provetta di raccolta sotto la colonna della siringa. E usa una pipetta da 10 millilitri per aggiungere gocce di particelle G10, sospese in PBS, sopra la lana di vetro. Continuare ad aggiungere le particelle G10 fino a formare un pellet da due millilitri.

Quindi, aggiungere due millilitri di aliquote del mezzo preriscaldato alla colonna. E aprire lentamente la valvola del rubinetto, in modo che il fluido fuoriesca dalla colonna a goccia. Quando 10 millilitri di fluido sono completamente scaricati attraverso la colonna, chiudere il rubinetto.

Scartare il flusso e posizionare una nuova provetta di raccolta sotto la colonna. Per raccogliere la sottopopolazione tumorale in sospensione, aspirare il terreno dalla piastra di co-coltura delle cellule leucemiche e utilizzare lo stesso terreno per sciacquare delicatamente la piastra una volta. Quindi, trasferire la sottopopolazione di cellule leucemiche in sospensione galleggiante in un tubo conico da 15 millilitri.

Per raccogliere la sottopopolazione tumorale Phase Bright, aggiungere 10 millilitri di terreno fresco sulla piastra di co-coltura. E sciacquare circa cinque volte con forza sufficiente a rimuovere le cellule leucemiche aderenti senza rimuovere il monostrato di cellule aderenti. Quindi, trasferire la sottopopolazione Phase Bright nel proprio tubo conico da 15 millilitri.

Per raccogliere la sottopopolazione tumorale Phase Dim, rimuovere il terreno rimanente con un risciacquo PBS da un millilitro. E staccare le cellule con tre millilitri di tripsina a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, picchiettare delicatamente i lati della piastra per rimuovere le cellule aderenti, seguito dall'aggiunta di un millilitro di FBS per fermare la reazione enzimatica.

Quindi, sciacquare il siero da tre a cinque volte per rompere eventuali aggregati cellulari di grandi dimensioni. E trasferire la sottopopolazione Phase Dim non purificata in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Quando tutte le sottopopolazioni sono state raccolte, ruotare le cellule.

E risospendere ciascuno dei pellet in un millilitro di terreno preriscaldato. Con il rubinetto completamente chiuso, per ogni sottopopolazione, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere l'intero volume di un millilitro di cellule, goccia a goccia, sulla parte superiore di una delle colonne G10 preparate, assicurandosi che le cellule rimangano sopra o all'interno del pellet G10. Lasciare incubare le cellule sul pellet G10 per 20 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere da uno a tre millilitri di terreno fresco preriscaldato alla colonna. E aprire il rubinetto in modo che il mezzo esca lentamente dalle colonne, a goccia. Continuare ad aggiungere il terreno preriscaldato alle colonne, con incrementi di uno o due millilitri.

Quando sono stati raccolti da 15 a 20 millilitri di cellule leucemiche, chiudere il rubinetto e tappare la provetta di raccolta. Quindi, far girare le celle e risospendere il pellet nell'apposito tampone di analisi a valle. Dopo la tripsinizzazione dello strato cellulare aderente, si osservano due distinte popolazioni di cellule mediante analisi di dispersione diretta rispetto a quella laterale.

Dopo la separazione di G10, viene recuperata una popolazione pura di cellule LLA. Di particolare interesse, tutte le cellule Phase Dim recuperate da cellule stromali del midollo osseo, o co-colture di osteoblasti, mostrano poca o nessuna morte dopo la loro esposizione alla chemioterapia citotossica. Durante il tentativo di queste procedure, è importante ricordare di eseguire questi passaggi nel modo più corretto possibile per ridurre eventuali cambiamenti fenotipici che possono verificarsi nelle cellule leucemiche.

Questa tecnica fornisce ai ricercatori nel campo della ricerca sulla leucemia un modo per modellare la leucemia resistente alla chemioterapia in un modello in vitro che assomiglia più da vicino al microambiente del midollo osseo.