Name: Modellazione chemioterapia leucemia resistente In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Impara a modellare la leucemia linfoblastica acuta resistente alla chemioterapia in vitro utilizzando cellule stromali midollari umane. Questo metodo consente di isolare e analizzare sottopopolazioni di cellule leucemiche resistenti alla terapia.

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Supportato da National Institutes of Health (NHLBI) R01 HL056888 (LFG), National Cancer Institute (NCI) RO1 CA134573NIH (LFG), P30 GM103488 (LFG), WV CTR-IDEA NIH 1U54 GM104942, Alexander B. Osborn Hematopoietic Malignancy and Transplantation Program e WV Research Trust Fund. Siamo grati per il supporto della dott.ssa Kathy Brundage e della West Virginia University Flow Cytometry Core Facility, supportata da NIH S10-OD016165 e dall'Institutional Development Award (IDeA) del NIH Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (CoBRE P30GM103488 e INBRE P20GM103434).

1. Preparazione avanzata <ol><li> Preparazione particelle G10 destrano. <ol><li> Preparare G10 impasto con l&#39;aggiunta di 50 ml di PBS 1X a 10 particelle g G10. Mescolare per inversione e consentire G10 a stabilirsi fuori tampone fosfato (PBS) a 4 ° CO / N. </li><li> Il giorno del G10 di separazione colonna, aspirare PBS dalle particelle del G10 stanziali e aggiungere 50 ml di PBS fresco. Mescolare per inversione. Ripetere due volte, aggiungendo 50 ml PBS fresco di particelle G10 stabiliti e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Coltura BMSC e OB. <ol><li> Mantenere sia BMSC o OB a 37 ° C in 6% CO 2 e coltivati ​​su 10 cm piastre di coltura tissutale fino al raggiungimento del 90% di confluenza. </li><li> Trypsinize BMSC o cellule OB e dividere 1: 2 su nuove piastre di 10 cm. Le cellule sono coltivate a tali norme fino al momento leucemica co-coltura. </li></ol></li></ol> 2. Stabilire e mantenere Co-cultura <ol><li> Aggiungere 5-20 x 10 6 cellule leucemiche in 10 ml di specifici terreni di coltura del tumore Onto un 80% -90% confluenti BMSC o la piastra OB. NOTA: Il nostro laboratorio mantiene co-colture a 37 ° C in 5% O 2 ricapitolare meglio microambiente midollare che ha dimostrato variare da 1% al 7% 16-18. Tuttavia, il mantenimento co-colture in questa tensione di ossigeno non è critico per l&#39;istituzione dei tre sottopopolazioni leucemiche ed è a discrezione del laboratorio. </li><li> Ogni 4 ° giorno rimuovere tutti ma 1 ml di media (tra cui le cellule leucemiche in sospensione) e sostituirlo con 9 ml di terreni di coltura leucemica fresco. Durante la rimozione 9 ml di media dal piatto, fare attenzione a non disturbare il lardo aderente BMSC o OB. <ol><li> Rimuovere supporti inclinando piastra al supporto laterale e aspirato in un angolo della piastra. Inoltre, quando si aggiunge mezzi freschi, assicurarsi di aggiungere goccia a goccia in un angolo del piatto contro la parete laterale per garantire il minimo disturbo dello strato aderente BMSC o OB. </li></ol></li><li> Dopo il 12 ° giorno di co-coltura, lavare le cellule leucemiche da BMSC o strato OB pipettando terreni di coltura dal piatto su e giù delicatamente sopra il piatto di circa 5 a 10 volte e poi raccogliere in tubo da 15 ml. Reseed sul nuovo 80% -90% BMSC confluenti o piastra OB come descritto al punto 2.1. NOTA: Il dolce risciacquo della co-coltura come descritto al punto 2.3 verrà rimosso S e PB cellule leucemiche senza interrompere il monostrato BMSC o OB. Questo permette alle cellule tumorali solo per essere trasferite nel successivo piastra di co-coltura. Questo ciclo di 12 giorni può essere ripetuto tante volte quante sono necessarie in base alle esigenze degli utenti. </li></ol> 3. Preparazione Colonne G10 Bead NOTA: Se è richiesta l&#39;analisi a valle sterile o coltura dopo la separazione colonna G10 le seguenti operazioni devono essere eseguite con tecnica sterile e le colonne del G10 dovrebbe essere messa a punto in una cappa biologica sterile. <ol><li> Pre-warm coltura cellulare supporti a 37 ° C in bagno d&#39;acqua (~ 30 ml per colonna). Usando una siringa monouso ml 10, rimuovere ed eliminare stantuffo. Aggiungere lana di vetro a siringa. </li><li> Usando le pinzette, separare lana di vetro in trefoli sottili. Aggiungere più strati di lana di vetro leggermente imballato alla siringa fino a quando 2/3 della siringa è pieno di lana di vetro. NOTA: La lana di vetro è di fondamentale importanza per evitare che particelle G10 libere di contaminare la raccolta delle cellule leucemiche. Assicurarsi lana di vetro è imballato abbastanza per sostenere le particelle G10, ma non troppo densamente imballato per bloccare il flusso multimediale attraverso la colonna. </li><li> Attaccare 1-way rubinetto alla punta della siringa nella posizione chiusa. </li><li> Morsetto colonna siringa per anello di stare abbastanza alto in modo da un tubo conico da 50 ml (tubo di raccolta) può essere posizionato sotto il rubinetto. Mettere tubo di raccolta nella colonna siringa. </li><li> Usando una pipetta 10 ml aggiungere, goccia a goccia, le particelle G10 risospesi in PBS alla colonna in cimala lana di vetro. Continuare aggiungendo particelle G10 fino a ml pellet ~ 2 (come misurato dal graduazioni sulla siringa) di G10 particelle forme sopra della lana di vetro. </li><li> Equilibrare la colonna G10 con i media pre-riscaldato. <ol><li> Aggiungere 2 ml di media pre-riscaldato a colonna. Aprire la valvola rubinetto lentamente in modo che il supporto fuoriesce colonna goccia a goccia. </li><li> Ripetere il punto 3.6.1 fino ad un totale di 10 ml di media pre-riscaldato è stato eseguito attraverso la colonna. NOTA: Se le particelle G10 si vedono nel flusso attraverso il tubo di raccolta, o 1) aggiungere più particelle del G10 di mantenere ~ 2 ml pellet assicurandosi che nessuna particella aggiuntivi G10 fuga dalla colonna o 2) sostituzione della colonna con uno inutilizzato e ripetere passi 3.4-3.6.1. </li><li> Dopo gli scarichi dei media pre-riscaldato dalla colonna, chiudere il rubinetto e scartare tubo di raccolta con flusso attraverso. Aggiungere un nuovo tubo di raccolta sotto la colonna. Colonna è pronto per essere caricato con supporti + miscela di cellule. NOTA: Colonnedeve essere usato immediatamente e non ha permesso di asciugare. </li></ol></li></ol> 4. Separare 3 sottopopolazioni all&#39;interno di Co-cultura <ol><li> Raccolta di sottopopolazione di sospensione (S) del tumore. <ol><li> supporti Aspirare dalla piastra di co-coltura con pipetta e delicatamente riapplicare lo stesso supporto per sciacquare la piastra e raccogliere supporti contenenti cellule leucemiche in un tubo da 15 ml. Le cellule leucemiche raccolti sono la sottopopolazione S. </li></ol></li><li> Raccolta di Fase Bright (PB) sottopopolazione tumorale. <ol><li> Aggiungere 10 ml di mezzi freschi di nuovo sul piatto co-coltura. Risciacquare vigorosamente pipettando mezzi aggiunti su e giù per circa 5 volte per rimuovere le cellule leucemiche aderenti ma non abbastanza difficile da staccare aderente / OB componente BMSC. </li><li> Aspirare con pipetta e raccogliere i media in un tubo da 15 ml. Le cellule raccolte sono la sottopopolazione PB. </li></ol></li><li> Raccolta di Fase Dim (PD) sottopopolazione tumorale. <ol><li> Piastra Risciacquare con 1 ml di PBS a remsupporti rimanenti ove. Trypsinize piastra di co-coltura con 3 ml di tripsina e posto in 37 ° C incubatore per 5 min. </li><li> Rimuovere la piastra di incubatore e picchiettare delicatamente lati della piastra per rimuovere aderente BMSC / OB. </li><li> Aggiungere 1 ml di siero fetale bovino (FBS) e pipetta su e giù 3-5 volte di spezzare grandi aggregati di cellule. </li><li> Raccogliere media con cellule in una provetta da 15 ml. Queste cellule sono sottopopolazione PD non purificata con BMSC / OB pure. </li></ol></li><li> Centrifuga 3 isolato sottopopolazioni a 400 xg per 7 minuti. Aspirare e scartare il surnatante quindi risospendere individualmente pellet in 1 ml di media pre-riscaldato. Le cellule sono pronte per essere caricata su una colonna G10. </li></ol> 5. Caricamento co-coltura cellule su G10 Colonna NOTA: Assicurarsi che il rubinetto sia completamente chiuso prima di aggiungere le cellule supporti contenenti la colonna G10. Inoltre, ogni sottopopolazione deve essere eseguito su una colonna G10 separato in modo da non introducuna e ogni pregiudizio tra le popolazioni in analisi a valle. <ol><li> Usando una pipetta 1000 ml, aggiungere 1 ml di ciascuna sottopopolazione di cellule nei media pre-riscaldato a una colonna G10 separata goccia a goccia. Assicurarsi che il supporto contenente le cellule rimane sopra o all&#39;interno G10 pellet. Consentono alle cellule di incubare il G10 a pellet per 20 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Stopcock rimane chiuso per durata dell&#39;incubazione. </li></ol> 6. Raccolta cellule leucemiche da G10 Colonna <ol><li> Aggiungere 1-3 ml supporti pre-riscaldato a ogni colonna G10. Valvola rubinetto aperto e consentire mezzi per uscire lentamente la colonna goccia a goccia. NOTA: E &#39;fondamentale per mantenere una portata lenta dalla colonna o il pellet contenente G10 BMSC / OB può lavare fuori della colonna e contaminare le isolate cellule leucemiche. </li><li> Continuare ad aggiungere supporti pre-riscaldato con piccoli incrementi (1-2 ml) a colonna G10 fino a un totale di 15 a 20 ml ha attraversato colonna e sono state raccolte. Chiudere il rubinetto vatubo di raccolta lve e cappuccio. NOTA: se una pallina G10 particella è visto nella parte inferiore della provetta di raccolta, rimuovere delicatamente il supporto dal tubo lasciando G10 grano di particella indisturbati e trasferimento al nuovo tubo. </li><li> Centrifuga raccolte supporto a 400 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in tampone appropriato per l&#39;applicazione a valle. </li><li> Le cellule sono ora una popolazione pura di cellule leucemiche gratuitamente BMSC o contaminazione OB e sono pronti per essere applicato ad applicazioni a valle a discrezione dell&#39;utente. NOTA: vitalità cellulare leucemica dovrebbe rimanere invariato quando si passa celle attraverso le colonne del G10. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

malattia residua minima (MRD) che contribuisce alla ricaduta della malattia continua ad essere una sfida clinica nel trattamento aggressivo refrattario ALL, nonché una serie di altre neoplasie ematologiche. Il microambiente del midollo osseo è il sito più comune di recidiva in ALL 3,8. In quanto tale, i modelli che modellano il microambiente del midollo osseo sono strumenti essenziali per testare ipotesi legate alla sopravvivenza delle cellule tumorali leucemiche e manutenzione di MRD durante l&#39;esposizion...

L'obiettivo generale del metodo descritto è quello di fornire un approccio in vitro efficiente ed economico che supporti lo studio dei meccanismi che sono alla base della sopravvivenza delle cellule leucemiche supportate dal midollo osseo durante l'esposizione alla chemioterapia. È ben documentato che le cellule tumorali residue sopravvissute che persistono dopo il trattamento contribuiscono alla recidiva della malattia che è spesso più aggressiva di quella alla diagnosi ed è spesso trattata in modo meno efficace1-8. I modelli che includono cellule leucemiche in isolamento, come quelli limitati alla coltura di cellule in soli terreni, per la sperimentazione di approcci terapeutici non tengono conto di questi segnali critici o dell'eterogeneità della malattia che si verifica in risposta alla disponibilità di segnali derivati da nicchia in cui sottopopolazioni di cellule tumorali con interazioni molto specifiche con cellule di nicchia derivano una maggiore protezione. I modelli standard di co-coltura 2D che co-coltivano cellule stromali e cellule leucemiche derivate dal midollo osseo hanno in qualche modo affrontato il contributo della nicchia del midollo osseo e hanno dimostrato che l'interazione con le cellule del microambiente del midollo osseo aumenta la loro resistenza alla chemioterapia e altera le loro caratteristiche di crescita9-14. Questi modelli, tuttavia, spesso non riescono a ricapitolare la sopravvivenza a lungo termine delle cellule tumorali e non informano accuratamente i risultati associati alle popolazioni di cellule leucemiche più resistenti che contribuiscono alla MRD. I modelli in vivo rimangono fondamentali e definiscono il "gold standard" per lo studio di terapie innovative prima degli studi clinici, ma sono spesso messi alla prova dal tempo e dai costi necessari per testare ipotesi relative ai tumori resistenti e alla recidiva della malattia. Pertanto, lo sviluppo di modelli 2D più informativi sarebbe vantaggioso per le indagini pilota per informare meglio la progettazione del successivo disegno preclinico basato sui muri. 
Il modello 2D in vitro presentato in questo rapporto manca della complessità del vero microambiente in vivo, ma fornisce un mezzo economico e riproducibile per interrogare le interazioni tumorali con il microambiente che si presta specificamente all'arricchimento della sottopopolazione chemioresistente di cellule tumorali. Questa distinzione è preziosa in quanto la valutazione dell'intera popolazione di cellule tumorali può mascherare il fenotipo di un gruppo minore di cellule tumorali resistenti alla terapia che costituiscono il bersaglio più importante. Un ulteriore vantaggio è la scalabilità del modello per adattarsi all'analisi di interesse. Le colture di massa possono essere stabilite per quelle analisi che richiedono un recupero significativo di cellule tumorali, mentre le co-colture su piccola scala in piastre multi-pozzetto possono essere utilizzate per analisi basate su PCR o valutazioni basate sulla microscopia. 
Sulla base di questa esigenza, abbiamo sviluppato un modello in vitro per affrontare l'eterogeneità della malattia che è caratteristica della leucemia linfoblastica acuta (ALL) del lignaggio B. Dimostriamo che le cellule LLA, che condividono molte caratteristiche in comune con le loro controparti sane, si localizzano in compartimenti distinti di co-coltura di BMSC o OB. Vengono generate tre popolazioni di cellule tumorali che hanno fenotipi distinti che sono preziosi per lo studio della risposta terapeutica. In particolare, dimostriamo che le cellule (ALL) recuperate dalla popolazione "phase dim" (PD) di co-coltura sono costantemente refrattarie alla terapia con sopravvivenza che si avvicina alle cellule tumorali che non sono state esposte ad agenti citotossici. Queste cellule LLA, provenienti da linee cellulari consolidate o da campioni primari di pazienti, migrano sotto le cellule stromali aderenti o gli strati di osteoblasti, ma possono essere catturate in seguito alla tripsinizzazione delle colture e alla separazione dei tipi di cellule mediante l'utilizzo di colonne di particelle di destrano reticolato (G10) su gel di tipo 1015. 
Qui presentiamo una configurazione di una co-coltura 2D che può essere impiegata per modellare le interazioni tra le cellule stromali del microambiente del midollo osseo (BMSC/OB) e le cellule leucemiche. Di particolare importanza è l'osservazione che le cellule leucemiche formano tre sottopopolazioni spaziali relative al monostrato di cellule stromali e che la popolazione PD rappresenta una popolazione tumorale resistente alla chemioterapia a causa della sua interazione con il BMSC o l'OB. Inoltre, dimostriamo come isolare efficacemente le popolazioni di cellule leucemiche mediante colonne G10. Da notare, abbiamo scoperto che l'isolamento di queste sottopopolazioni consente l'analisi a valle della popolazione di PD più resistente per determinare le potenziali modalità di resistenza che vengono conferite a queste cellule a causa della loro interazione con le cellule stromali del microambiente del midollo osseo o gli osteoblasti. Le tecniche che abbiamo utilizzato a valle di questo modello di co-coltura e isolamento includono la valutazione citometrica a flusso, l'analisi proteomica e la valutazione dell'espressione proteica mirata, nonché l'ablazione laser a ionizzazione elettrospray (LAESI) e l'analisi del cavalluccio marino per valutare i profili metabolici. Attraverso l'uso di questo modello in combinazione con le tecniche di cui sopra abbiamo scoperto che la popolazione di cellule leucemiche PD ha un fenotipo resistente alla chemioterapia che è unico se confrontato con le cellule leucemiche coltivate in terreni da soli o quelle recuperate dalle altre sottopopolazioni nella stessa co-coltura. In quanto tale, questo modello si presta a una valutazione più rigorosa per testare strategie mirate alle cellule leucemiche più resistenti alla chemioterapia che derivano il loro fenotipo resistente attraverso l'interazione con il microambiente del midollo osseo.

<table><tbody><tr><td>Perline di sephadex G10</td><td>Sigma</td><td>G10120</td><td>Indicato nel manoscritto come gel tipo 10 particelle di destrano reticolato</td></tr><tr><td>Siringa sterile da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lana di vetro</td><td>Pyrex</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetti a 1 via</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14054-10</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 50 ml</td> Prodotti <td>medici mondiali</td><td>41021039</td><td>Utilizzato come provette</td></tr><tr><td>da centrifuga coniche da 15 ml</td> Prodotti <td>medici mondiali</td><td>41021037</td><td>Utilizzato per la raccolta di cellule</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Sigma</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina&nbsp;</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm Piastre per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Terreni di coltura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreni di coltura per osteoblasti&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-27001</td><td>Per terreni di osteoblasti umani&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-040</td><td>Per la preparazione dei terreni tumorali</td></tr><tr><td>Linee cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule aderenti:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osteoblasti umani</td><td>PromoCell</td><td>C-12720</td><td>L'osteoblasto umano è stato coltivato secondo il fornitore" s raccomandazioni.</td></tr><tr><td>Cellule stromali di Morrow osseo umano</td><td>umano WVU Biospecimen Core</td><td></td><td>Leucemia umana primaria de-identificata e cellule stromali del midollo osseo (BMSC) sono state fornite dal Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core e dal Dipartimento di Patologia della West Virginia University. Le colture BMSC sono state stabilite come descritto in precedenza (*)</td></tr><tr><td><forte>Cellule leucemiche: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>REH</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CRL-8286</td><td>Le cellule REH sono state coltivate secondo il fornitore" s raccomandazioni e supporti consigliati.</td></tr><tr><td>SD-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 366</td><td>SD-1 sono stati coltivati secondo il fornitore' s raccomandazioni e supporti consigliati.</td></tr><tr><td colspan="4">(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Interruzione della funzione delle cellule stromali del midollo osseo da parte dell'etoposide. Trapianto di midollo sanguigno Biol J am Soc trapianto di midollo sanguigno. Agosto 1997; 3(3):122&ndash;32.</td></tr></tbody></table>

modellazione chemioterapia leucemia resistente<em&gt; in vitro</em

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

È ben noto che il microambiente del midollo osseo fornisce un sito unico di santuario per le malattie ematopoietiche che iniziano e progrediscono in questo sito. Il modello presentato nel presente rapporto utilizza cellule stromali primarie del midollo osseo umano e osteoblasti come due tipi di cellule rappresentative della nicchia del midollo che influenzano il fenotipo delle cellule tumorali. Le condizioni di co-coltura in vitro descritte per le cellule leucemiche umane con questi componenti primari di nicchia supportano la generazione di una sottopopolazione chemioresistente di cellule tumorali che può essere recuperata in modo efficiente dalla coltura per l'analisi con diverse tecniche. Un rigoroso programma di alimentazione per prevenire i flussi di nutrienti seguito dal recupero delle particelle di destrano reticolato (G10) su gel di tipo 10 della popolazione di cellule tumorali che sono migrate sotto le cellule stromali aderenti del midollo osseo (BMSC) o degli osteoblasti (OB) generando una popolazione di cellule tumorali "phase dim" (PD), fornisce una fonte costante di cellule leucemiche purificate resistenti alla terapia. Questa popolazione di cellule tumorali clinicamente rilevante può essere valutata con metodi standard per studiare le vie di regolazione apoptotica, metabolica e del ciclo cellulare, oltre a fornire un obiettivo più rigoroso in cui testare nuove strategie terapeutiche prima di indagini precliniche mirate alla malattia residua minima.

L&#39;installazione di successo e la cultura di questo modello di co-coltura comporterà la creazione di 3 sottopopolazioni di cellule leucemiche relativi alla aderenti BMSC o OB monostrato. Figura 1 mostra come tutte le cellule seminate in un monostrato BMSC appaiono inizialmente come una sola popolazione di sospensione cellule leucemiche. Nel corso di 4 giorni cellule leucemiche interagiscono con il BMSC per formare 3 sottopopolazioni spaziali di cellule leucemiche (sos...

Il presente rapporto riassume un protocollo che può essere utilizzato per modellare l'influenza della nicchia del microambiente del midollo osseo sulle cellule leucemiche con particolare attenzione all'arricchimento della sottopopolazione più chemioresistente.

Modellazione chemioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è modellare in modo più accurato la leucemia linfoblastica acuta resistente, o ALL, in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel trattamento dell'ALL refrattaria, riguardo al modo in cui il microambiente del midollo osseo influenza la resistenza chemioterapica delle cellule ALL. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è notevolmente più economica e meno dispendiosa in termini di tempo rispetto all'utilizzo di modelli animali tradizionali per esaminare l'efficacia farmacologica sulle cellule ALL refrattarie.Iniziare seminando da cinque a venti volte 10 alla sesta cellule leucemiche in 10 millilitri di mezzo di coltura specifico per il tumore su una piastra da 100 millimetri contenente cellule stromali del midollo osseo o osteoblasti al 80-90% di confluenza. Ogni quattro giorni, inclinare la piastra lateralmente ed aspirare tutto il mezzo tranne un millilitro, avendo cura di non disturbare lo strato di cellule aderenti. Successivamente, aggiungere con attenzione nove millilitri di mezzo fresco per la coltura delle cellule leucemiche, goccia a goccia, in un angolo della piastra lungo il bordo, per garantire il minimo disturbo alle cellule aderenti.Dopo il 12° giorno di co-coltura, pipettare delicatamente il mezzo di coltura su e giù sulla piastra circa da cinque a dieci volte per raccogliere le cellule leucemiche in sospensione. Trasferire quindi le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, riseminare le cellule su una nuova piastra contenente cellule stromali del midollo osseo, o osteoblasti, con una confluenza dell'80-90%, come appena dimostrato.Al quarto giorno si saranno formate tre sottopopolazioni di cellule leucemiche, con le cellule leucemiche in sospensione che galleggiano liberamente nel mezzo. Le cellule leucemiche a fase chiara aderiscono alla superficie del monostrato di cellule aderenti, mentre le cellule leucemiche a fase scura migrano al di sotto del monostrato. Per preparare le colonne di perline G10, riscaldare innanzitutto 30 millilitri di mezzo di coltura cellulare per colonna a 37 gradi Celsius in un bagno a temperatura controllata.Successivamente, utilizzare una pinzetta per tirare la lana di vetro formando filamenti sottili e sciolti. Aggiungere più strati di filamenti leggermente compattati in una siringa da 10 millilitri per ogni colonna necessaria. Quando la siringa è piena per 2/3, fissare un rubinetto monodirezionale in posizione chiusa alla punta e bloccare la siringa su un supporto con anello ad un'altezza sufficiente da permettere di posizionare un tubo conico di raccolta da 50 millilitri al di sotto del rubinetto.Ora, posizionare una provetta di raccolta sotto la colonna della siringa. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per aggiungere gocce di particelle G10, sospese in PBS, sulla sommità della lana di vetro. Continuare ad aggiungere le particelle G10 fino a formare un pellet di due millilitri.Quindi, aggiungere aliquote di due millilitri di mezzo preriscaldato sulla colonna. Aprire lentamente la valvola a tenuta, in modo che il mezzo fuoriesca dalla colonna goccia a goccia. Quando 10 millilitri di mezzo sono completamente drenati attraverso la colonna, chiudere la valvola a tenuta.Scartare il flusso passante e posizionare un nuovo tubo di raccolta sotto la colonna. Per raccogliere la sottopopolazione tumorale in sospensione, aspirare il mezzo di coltura dalla piastra di co-coltura delle cellule leucemiche e utilizzare lo stesso mezzo per risciacquare delicatamente la piastra una volta. Successivamente, trasferire la sottopopolazione di cellule leucemiche in sospensione flottante in un tubo conico da 15 millilitri.Per raccogliere la sottopopolazione tumorale a luminosità di fase, aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco sulla piastra di co-coltura. Risciacquare quindi circa cinque volte con energia sufficiente a rimuovere le cellule leucemiche aderenti senza staccare il monostrato di cellule aderenti. Successivamente, trasferire la sottopopolazione a luminosità di fase in un proprio tubo conico da 15 millilitri.Per raccogliere la sottopopolazione tumorale Phase Dim, rimuovere il mezzo residuo con un risciacquo di un millilitro di PBS. Staccare quindi le cellule con tre millilitri di tripsina a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, battere delicatamente sui lati della piastra per staccare le cellule aderenti, quindi aggiungere un millilitro di FBS per arrestare la reazione enzimatica.Quindi, risciacquare il siero da tre a cinque volte per rompere eventuali aggregati cellulari di grandi dimensioni. Trasferire la sottopopolazione Phase Dim non purificata in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Una volta raccolte tutte le sottopopolazioni, centrifugare le cellule.E risospendere ciascun pellet in un millilitro di mezzo preriscaldato. Con il rubinetto completamente chiuso, per ciascuna sottopopolazione, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere l'intero volume di un millilitro di cellule, goccia a goccia, sulla sommità di una delle colonne G10 preparate, assicurandosi che le cellule rimangano sulla superficie o all'interno del pellet di G10. Lasciare incubare le cellule sul pellet di G10 per 20 minuti a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere uno a tre millilitri di mezzo fresco preriscaldato alla colonna. Aprire il rubinetto in modo che il mezzo esca lentamente dalle colonne, goccia a goccia. Continuare ad aggiungere mezzo preriscaldato alle colonne, in incrementi di uno a due millilitri.Quando è stato raccolto un volume totale di 15-20 millilitri di cellule leucemiche, chiudere il rubinetto e tappare il tubo di raccolta. Successivamente, centrifugare le cellule e risospendere il pellet nel tampone appropriato per l'analisi successiva. Dopo la tripsinizzazione dello strato di cellule aderenti, due popolazioni cellulari distinte vengono osservate mediante analisi della diffusione della luce in avanti rispetto a quella laterale.Dopo la separazione con G10, si ottiene una popolazione pura di cellule ALL. Particolarmente interessante è il fatto che tutte le cellule di fase dim ottenute da colture co-coltivate con cellule stromali del midollo osseo o con osteoblasti mostrano scarsa o nulla morte cellulare dopo l'esposizione a chemioterapia citotossica. Durante il tentativo di eseguire queste procedure, è importante ricordare di eseguire i passaggi nel modo più accurato possibile per ridurre al minimo eventuali cambiamenti fenotipici che potrebbero verificarsi nelle cellule leucemiche.Questa tecnica offre ai ricercatori nel campo della ricerca sulleucemia un metodo per modellare la leucemia resistente alla chemioterapia in un modello in vitro che riproduce più fedelmente il microambiente del midollo osseo.

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Questo video descrive la tecnica per la co-coltura 2D a lungo termine di cellule leucemiche con cellule stromali del midollo osseo per studiare la loro interazione con il microambiente del midollo osseo. Il modello di cocoltura 2D utilizza le cellule di leucemia linfoblastica acuta e gli stromi o gli osteoblasti del midollo osseo che influenzano il fenotipo delle cellule tumorali. Questo studio supporterà l'indagine sui meccanismi che sono alla base della sopravvivenza delle cellule leucemiche...

Co-coltura 2D di cellule leucemiche con BMSC: un metodo per ottenere sottopopolazioni di cellule leucemiche

Questo video descrive un metodo per la separazione spaziale di tre sottopopolazioni di cellule leucemiche: le cellule leucemiche sospese che fluttuano liberamente nel terreno, le cellule leucemiche luminose di fase che hanno aderito alla superficie del monostrato di cellule stromali mesenchimali e le cellule leucemiche attenuate di fase che sono migrate sotto il monostrato di cellule stromali mesenchimali dalla co-coltura 2D.

Raccolta di sottopopolazioni leucemiche: un metodo per la separazione spaziale di sottopopolazioni di cellule leucemiche dalla co-coltura 2D

Chinasi recettore tirosina sono ectopica espresso in molti tumori e sono stati identificati come bersagli terapeutici nella leucemia acuta. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica degli inibitori della tirosin-chinasi per il trattamento della leucemia acuta.

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Descriviamo un test di sensibilità ai farmaci ad alto rendimento per cellule primarie di mieloma multiplo. Consiste in una ricostruzione del microambiente del midollo osseo (compresa la matrice extracellulare e lo stroma) in piastre multipozzetto e in un metodo non invasivo per la quantificazione longitudinale della vitalità cellulare.

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione e la risoluzione dei problemi di xenotrapianti di leucemia linfoblastica acuta umana (ALL) da linee cellulari e materiale fresco del paziente in embrioni di zebrafish transitoriamente immunosoppressi, insieme a linee guida per la valutazione della risposta ai farmaci mediante citometria a flusso. La pipeline sperimentale può essere adattata anche per i tumori solidi.

Previsione rapida della risposta ai farmaci in vivo utilizzando innesti di cellule leucemiche in embrioni di zebrafish

Questo protocollo descrive in ovo xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) B e T derivate da pazienti, che si verifica 4 giorni dopo l'iniezione.

Nell'Ovo Xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) derivate da pazienti (PDX-ALL)

Il protocollo ha l'obiettivo di descrivere un modello murino per la generazione di recidive di leucemia linfoblastica acuta, basato sulla dinamica della risposta alla chemioterapia di induzione.

Modello murino di recidiva della leucemia alla chemioterapia di induzione per la leucemia linfoblastica acuta

Impara a modellare la leucemia linfoblastica acuta resistente alla chemioterapia in vitro utilizzando cellule stromali midollari umane. Questo metodo consente di isolare e analizzare sottopopolazioni di cellule leucemiche resistenti alla terapia.

Modellazione chemioterapia leucemia resistente

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