Name: Esame di proteine legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Scopri la tecnica BrdU-ChIP-Slot-Western per esaminare proteine legate al DNA nascente in cellule di mammifero. Questo metodo rapido e quantitativo aiuta a studiare la replicazione e la riparazione del DNA.

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Il lavoro in questo manoscritto è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Radioterapia Oncologica e Huntsman Cancer Institute e il National Institute of Health sovvenzione (R01-CA188520) di SB. Ringrazio Danielle Johnson e Steven Bennett nel mio laboratorio per dimostrare il protocollo e spiegando i suoi benefici. Sono grato al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) per i commenti critici sul manoscritto.

1. immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in seguito BrdU etichettatura <ol><li> Culture cellule NIH3T3 in presenza sia di DMSO o inibitori selettivi HDAC1,2 come descritto in precedenza 6. </li><li> Dopo il trattamento con inibitori selettivi DMSO o HDAC1,2, aggiungere BrdU alle celle in una cappa coltura tissutale sterile. Incubare 2 x 10 6 cellule NIH3T3 placcati in 10 ml mezzi NIH3T3 con una concentrazione finale di 20 mM di bromodeossiuridina (BrdU) per 60 min in una sterile 37 ° C coltura tissutale incubatore. </li><li> Crosslink proteine ​​intracellulari DNA aggiungendo formaldeide direttamente al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 1%. Incubare 2 x 10 6 cellule NIH3T3 con formaldeide a temperatura ambiente per 10 min su un agitatore. </li><li> Quench la reticolazione mediante l&#39;aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 125 mM. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti su un agitatore. </li><li> Togliere la carta e raccogliere le cellule in PBS in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin cells a 956 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare il pellet di cellule due volte con PBS freddo. Rimuovere PBS dal tubo. Conservare il pellet reticolato cellulare senza PBS (surnatante) a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare il lisato dal pellet cellulare reticolato aggiungendo tampone FA140 500 microlitri (50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% sodio desossicolato) integrato con inibitore della proteasi cocktail. </li><li> Taglio la cromatina dalle sonicazione dei campioni cinque volte al potere il 35% e con un impulso di 15 secondi, 0,9 secondi acceso e 0,1 secondi spento impostazione. Tenere le provette in ghiaccio dopo ogni turno di ultrasuoni per evitare il riscaldamento dei campioni. <ol><li> Controllare il taglio su un gel DNA come l&#39;efficienza di taglio varierà tra i diversi sonicatori. Per controllare sonicazione, invertire reticolazione con l&#39;aggiunta di NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e eseguire i passaggi 1.17.1. - 1.22. Esegui eluita 10 microlitri DNA su un gel di agarosio 1,5% per verificare se il taglio ètra 300-700 bp con una intensità media a 500 bp. </li></ol></li><li> Dopo sonicazione, centrifugare i campioni per 10 min a 17.949 xga 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta. <ol><li> Eseguire la stima delle proteine ​​utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare la stessa quantità di lisato per il chip di controllo e campioni sperimentali. In generale, utilizzare 1 mg di lisato totale per reazione chip. </li></ol></li><li> Preparare 50% sospensione di proteina A-agarosio utilizzando tampone FA140 contenente inibitori delle proteasi cocktail. Aggiungere 1/10 volume del cocktail inibitore della proteasi. Calcolare il volume di perline necessari in base al numero di campioni in totale. <ol><li> Lavare perline Proteina A-agarosio con tampone FA140 due volte per rimuovere il tampone di conservazione e aggiungere un volume uguale di tampone FA140 ai talloni per fare 50% slurry. </li><li> Per rimuovere le proteine ​​che non si legano specificamente ai talloni, aggiungere 50 ml di 50% sospensione di Proteina A-agarosio e incubate i campioni a 4 ° C con rotazione costante end-over-end in un mixer rosticceria per 30 min. </li></ol></li><li> Spin i campioni a 956 xg a 4 ° C per un minuto. Raccogliere il surnatante ed eseguire immunoprecipitazione tramite l&#39;aggiunta di 8 microlitri H4K16ac anticorpo o 5 ml (5 mg) di 1 mg / ml di anticorpo SMARCA5 il surnatante. Incubare a 4 ° CO / N con rotazione end-over-end costante in un mixer rosticceria. </li><li> Salva 1/10 ° di un estratto per il controllo &#39;input&#39; e impostarlo come parte a -20 ° C. L&#39;ingresso deve essere inverso reticolato con i campioni IP. </li><li> Utilizzare la stessa quantità di IgG di coniglio (5 ml di 1 mg / ml) come campione di controllo negativo immunoprecipitazione. </li><li> Il giorno seguente, aggiungere 50 ml di 50% proteina A-agarosio slurry all&#39;estratto e incubare per 1 ora a 4 ° C con rotazione. </li><li> Pellet agarosio per centrifugazione a 956 xg per 2 minuti a 4 ° C, rimuovere con attenzione il surnatante e wash le perline con i seguenti buffer in sequenza. Nelle preparazioni tampone, aggiungere inibitori della proteasi a destra prima dell&#39;uso. <ol><li> Lavare con sale basso Immune Complex tampone di lavaggio (FA140; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end. </li><li> Lavare con Salt Immune Complex tampone di lavaggio ad alta (FA500; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 500 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end. </li><li> Lavare con LiCl Immune Complex tampone di lavaggio (concentrazione finale di 10 mM di Tris-Cl pH 8,0, 250 mM di LiCl, 0,5% e 0,5% NP40 desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end. </li></ol></li><li> Dopo lavaggi come descritto sopra, aggiungere 200 microlitri soluzione di eluizione (concentrazione finale di 1% SDS e 100 mM sodio bicarbonato) e incubate a temperatura ambiente per 15 min con rotazione end-over-end a RT. </li><li> Spin i campioni a 956 xg a RT e trasferire l&#39;eluato in una nuova provetta da 1,5 ml. Ripetere il passaggio 1.15 con l&#39;aggiunta di soluzione di eluizione 200 l. </li><li> Per 400 ml di eluato, aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e mescolare bene. <ol><li> Inoltre, aggiungere la soluzione di eluizione 400 microlitri di 10 microlitri di ingresso che è stato allocato (passo 1.11) e aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M di invertire campioni di ingresso reticolazione pure. Invertire reticolare i campioni incubando a 65 ° C bagnomaria per 5 ore. </li></ol></li><li> Aggiungere 1 ml di 100% EtOH al eluato reverse-reticolato. Mescolare bene e incubare a -80 ° C per 2-3 ore oppure a -20 ° CO / N. Spin i campioni a 17.949 xg per 15 minuti e scartare l&#39;etanolo. </li><li> Aggiungere 800 ml 70% di etanolo per lavare il pellet. Spin a 17.949 xg per 15 min a 4 ° C e scartare etanolo. Spin brevemente per rimuovere qualsiasi residuo di etanolo. Asciugare i campioni a 37 ° C per 10 min per rimuovere l&#39;etanolo residuo. </li><li> Sciogliere in 90 microlitri DNA RNasi e DNasi acqua libera e aggiungere 2 microlitri 10 mg / ml RNasi a 0,2 mg / ml concentrazione finale. Incubare a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0, 5% SDS). Mescolare bene e aggiungere 1 ml proteinasi K. Incubare a 42 ° C per 1 ora. </li><li> Purificare ingresso e ChIP DNA usando commerciale kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore ed eluire il DNA in 50 microlitri acqua. Conservare DNA a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 2. Slot blot analisi del DNA ChIP <ol><li> Misurare la resa di ingresso e di DNA ChIP eluito in 50 microlitri acqua come descritto al punto 1.22 utilizzando uno spettrofotometro a 280 nm secondo il protocollo del produttore. </li><li> Prendere volumi uguali (50 microlitri) di ingresso o di DNA immunoprecipitato che si trovano all&#39;interno della gamma lineare di rilevamento. <ol><li> Ad esempio, se l&#39;ingressoResa del DNA è di 1,5 ng / ml, poi prendere 30 ml (o 45 ng di DNA totale) e fare volume di 50 ml con acqua. Per fattore ChIP, prendere l&#39;intero 50 microlitri eluato dal punto 2.1 e passare al punto 2.3. </li></ol></li><li> Denaturare 50 microlitri di ingresso o DNA immunoprecipitato aggiungendo 2,5 volumi di 0,4 N NaOH, vortex brevemente e centrifugare per 956 xg per 10 sec, e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Neutralizzare il DNA denaturato con l&#39;aggiunta di 175 ml di 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugare per 956 g per 10 secondi e posizionare i campioni sul ghiaccio. </li><li> Preparare una diluizione seriale di ingresso e di DNA immunoprecipitato per la Slot Blot test come descritto di seguito. <ol><li> Seguire i passaggi 2,3-2,4 per ottenere un volume totale di 350 microlitri del campione (ad esempio, 50 ml di ingresso / DNA ChIP, 125 ml 0,4 N NaOH, 175 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8). Nota: Per l&#39;istanza indicato in precedenza, 45 ng di DNA ingresso finirà per essere 0,129 ng / ml. </li><li> Per il DNA di ingresso, etichettare tre tubos come 100, 50 e 25 e aggiungere 100 ml, 50 ml e 25 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Rendere il volume finale a 100 ml con acqua priva di nucleasi. Per DNA chip, label tre tubi da 200, 100 e 50 e aggiungere 200 microlitri, 100 microlitri e 50 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Fai volume finale a 200 ml con acqua priva di nucleasi. </li></ol></li><li> Tagliare la membrana alla dimensione dell&#39;apparato Slot Blot. Pre-bagnare la membrana e carta assorbente in 20x SSC prima e prima di aggiungere DNA. Assemblarle nell&#39;apparato macchia slot secondo il protocollo del produttore. </li><li> DNA pipetta dal punto 2.5.2 in apposite cave. Applicare il vuoto lentamente per tirare il DNA sulla membrana zeta-sonda. Arrestare vuoto dopo tutti i campioni sono passati attraverso l&#39;apparecchio. <ol><li> Smontare l&#39;apparato e immobilizzare immediatamente il DNA sulla membrana utilizzando un reticolante UV. Avere il lato del DNA nella reticolante UV e utilizzare il autocrosslink impostazione nel reticolante. Seguire il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Rileva BrdU sulla macchia slot eseguendo western blotting. <ol><li> Bloccare la membrana con 5% di latte secco non grasso in PBS contenente 0,1% Tween-20 (PBST) per 1 ora a RT per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alla membrana. </li><li> Aggiungere anticorpo primario anti-BrdU (diluizione 1: 500) diluito nel latte secco non grasso 1% in PBST e incubare il blot con l&#39;anticorpo primario per 3 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l&#39;incubazione anticorpo primario. </li><li> Aggiungere anticorpo secondario anti-topo HRP-coniugato alla macchia (1: 5.000 diluizione) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l&#39;incubazione anticorpo secondario. NOTA: utilizzare un volume sufficiente di anticorpi per coprire completamente la membrana durante l&#39;incubazione anticorpi primari e secondari. </li></ol></li><li> Preparare la miscela ECL e aggiungerlo alla ac macchiacondo protocollo del produttore. Incubare la membrana con mix ECL per 5 minuti a RT. <ol><li> Posizionare la membrana in una cassetta a raggi X, esporre la membrana alla pellicola a raggi X e sviluppare il blot usando il protocollo del produttore. </li><li> Quantificare il segnale ottenuto per l&#39;ingresso e il DNA chip dopo la scansione le macchie utilizzando il software Image J secondo il protocollo del produttore. Per la quantificazione, utilizzare il segnale che è all&#39;interno del range lineare di rilevamento al fine di garantire la precisione della misurazione. </li></ol></li></ol>

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<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

Non ho interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo descritto in questo manoscritto è un metodo relativamente veloce per dimostrare la presenza di proteine ​​o loro forme post-traduzionali modificati sul DNA appena replicato o nascente. Inoltre, questa tecnica permette uno per misurare la cinetica di associazione-dissociazione di una proteina o la sua forma modificata con il DNA nascente. Questa tecnica è complementare alla elegante tecnologia iPOND 13. Nella tecnologia iPOND, il DNA di nuova sintesi è etichettato con deossiuridina etile (EDU). U...

Riparazione del DNA difettosa e / o replicazione del DNA sono una delle principali cause di instabilità genomica, che può innescare la morte cellulare. Un singolo non riparato doppia interruzione filo è sufficiente a causare la morte delle cellule 1. Organizzazione della cromatina è transitoriamente alterata sia in fase di replica e riparare 2,3, e l&#39;incapacità di mantenere le informazioni epigenetiche nel corso di questi processi si tradurrà in una minaccia per l&#39;integrità del genoma. Perdita di HDAC3 o della funzione HDAC1,2 impedisce progressione fase S, la replicazione e riparazione del DNA che porta a stress genotossico (danni al DNA) e la morte delle cellule 4-9. Si tratta quindi di una strategia pratica per usare inibitori HDAC selettivi di interrompere la replica, la riparazione e la cromatina in cellule tumorali e causare danni al DNA, che a sua volta può fermare la crescita e induce la morte cellulare selettivamente nelle cellule tumorali in rapida crescita. Durante la replicazione del DNA, cromatina è rapidamente smontato e poi rimontato seguendo duplicazione del DNA. Recentemente synthesized istone H4 è acetilato a K5 e residui K12 (H4K5K12ac) e segue la deposizione sulla cromatina, sono rapidamente deacetilata da istone deacetilasi (HDAC) 10,11. Fallimento di cellule per mantenere l&#39;integrità della cromatina nascente da istoni deacetilazione può portare al collasso della forcella, che a sua volta può causare danni al DNA e la morte cellulare. Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;inibizione selettiva di HDAC1,2 aumenta l&#39;acetilazione degli istoni (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibisce l&#39;attività SMARCA5 cromatina remodeler sulla cromatina nascente, che correla con una ridotta progressione forca di replicazione, aumentato crollo forchetta e aumentato la replica da stress danno al DNA 6 . Così, HDAC inibitore trattamento possono alterare la struttura della cromatina nascente per innescare danni al DNA e la morte molto rapidamente nelle cellule tumorali, in quanto questi ciclo cellule in rapida e passare più volte attraverso la fase S. E &#39;quindi importante capire come funzionano HDAC regolare acetilazione degli istoni e proteine ​​binding per mantenere la replicazione del DNA nelle cellule di mammifero. Per misurare quantitativamente la quantità di acetilazione degli istoni e SMARCA5 remodeler cromatina associata con il DNA nascente durante la replicazione del DNA, abbiamo ideato un saggio ChIP modificato chiamato la tecnica di BrdU-Chip-Slot-occidentale. Dopo immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di una proteina o istone modifica desiderata, la quantità di DNA nascente (all&#39;etichetta analogico timidina, BrdU) nel campione chip può essere rilevato mediante analisi Western di DNA chip BrdU marcato trasferite su una membrana utilizzando un Slot Apparecchio Blot. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato che H4K16ac (un marchio coinvolta nella confezione cromatina) e il membro della famiglia ISWI SMARCA5 (regolatore actina-dipendente matrice associata SWI / SNF-correlata della cromatina) remodeler cromatina sono associati con il DNA nascente in cellule in fase S. 6. Abbiamo anche trovato che il marchio nascente H4K16ac è deacetilata da HDAC1,2 durante la replicazione del DNA 6. Inibisce H4K16acattività remodeler cromatina del familiare ISWI SMARCA5 12. Quindi, utilizzando la tecnica BrdU-CHIP-Slot-occidentale, potremmo collegare le funzioni per HDAC1,2 nel regolare il rimodellamento della cromatina durante la replicazione del DNA. Quindi, la tecnica BrdU-Chip-Slot-Western Blot è un approccio efficace per misurare quantitativamente l&#39;associazione e dissociazione dinamica delle proteine ​​o loro modificazioni post-traslazionali che sono tenuti al DNA nascente.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (occidentali)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Motivo attivo</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrana</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A agarosio</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>IgG di coniglio nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Mallinckrodt GenAR&nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere scremato</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola a raggi X</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Branson Sonifier&nbsp; Disgregatore cellulare ad ultrasuoni digitale</td><td>Modello: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>Modello: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Modello: 2322</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 1000</td><td>Modello termoscientifico</td><td>: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparato&nbsp;</td><td>Schleicher e Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali</td><td>Thermo Scientific</td><td>Serie II 3110 Incubatori a CO2 con camicia d'acqua</td><td></td></tr></tbody></table>

esame di proteine ​​legate al dna nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica brdu-chip-slot-occidentale

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Istone deacetilasi 1 e 2 (HDAC1,2) localizzano ai siti di replicazione del DNA. Nello studio precedente, utilizzando un inibitore selettivo e di un sistema atterramento genetica, abbiamo dimostrato le funzioni nuovi per HDAC1,2 nella progressione della forcella replica e nascente manutenzione cromatina in cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo utilizzato una tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale che combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di bromo-deossiuridina (BrdU) DNA -labeled con macchia slot e occidentale analisi per misurare quantitativamente proteine ​​o modificazione degli istoni associati con il DNA nascente. Attivamente cellule in divisione sono state trattate con HDAC1,2 inibitore selettivo o trasfettate con siRNA contro HDAC1 e HDAC2 e quindi il DNA di nuova sintesi è stato etichettato con il bromodeossiuridina timidina analogico (BrdU). L&#39;etichettatura BrdU è stata fatta in un punto di tempo in cui non c&#39;era significativo arresto del ciclo cellulare o apoptosi a causa della perdita delle funzioni HDAC1,2. Seguendo lAbeling di cellule con BrdU, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di marchi di acetilazione degli istoni o la cromatina-remodeler è stata effettuata con anticorpi specifici. BrdU marcato DNA ingresso e l&#39;immunoprecipitato (o chip) DNA è stato poi trasferite su una membrana con la tecnica di slot blot ed immobilizzati mediante UV. La quantità di DNA nascente in ciascuno slot è stata poi valutata quantitativamente mediante analisi Western con un anticorpo anti-BrdU. L&#39;effetto della perdita di funzioni HDAC1,2 sui livelli di nuova sintesi degli istoni marchi acetilazione DNA associate e cromatina remodeler è stato quindi determinato normalizzando il segnale di BrdU-Chip ottenute dai campioni trattati ai campioni di controllo.

Per determinare la specificità degli inibitori selettivi HDAC1,2, sono stati utilizzati Hdac1,2 FL / FL e HDAC3 FL / FL cellule fibrosarcoma. -Adenovirus contenenti Cre ricombinasi (Ad-Cre) è stato utilizzato per eliminare Hdac1,2 e HDAC3 in queste cellule. A seguito di infezione Ad-Cre di Hdac1,2 FL / FL cellule, è stato osservato un robusto incremento della H4K5ac. Il trattamento delle c...

In questo protocollo, descriviamo una nuova tecnica BrdU-ChIP-Slot-Western per esaminare le proteine e le modificazioni istoniche associate al DNA appena sintetizzato o nascente.

Esame di proteine ​​legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare rapidamente le proteine legate al DNA nascente con precisione utilizzando la marcatura BrdU e la precipitazione della cromatina. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella replicazione, riparazione nel campo della cromatina, come ad esempio, quali proteine sono legate al DNA nascente durante la replicazione del DNA e quali proteine di riparazione sono legate al DNA nascente durante lo stress di replicazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo relativamente rapido per rilevare le proteine legate al DNA nascente in modo altamente quantitativo.Per iniziare, allestire colture di due milioni di cellule NIH 3T3 in 10 millilitri di terreno con DMSO o inibitori. Inoltre, aggiungere BrdU a una concentrazione finale di 20 micromolari. Una volta piastre, incubare le cellule per 60 minuti.Dopo un'ora, reticolare le proteine intracellulari al DNA aggiungendo formaldeide direttamente al terreno di coltura a una concentrazione dell'1% in volume. Quindi, lasciare incubare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti con agitazione. Dopo 10 minuti, estinguere la reazione aggiungendo glicina al terreno a 125 millimolari e continuare l'incubazione per altri cinque minuti.Successivamente, raccogliere le cellule in PBS e lavarle due volte con PBS utilizzando la centrifugazione. Se lo si desidera, il pellet può essere congelato a 80 gradi Celsius per stoccaggio. Ora, preparare il lisato dalle cellule reticolate, aggiungere 500 microlitri di tampone FA140 integrato con il cocktail di inibitori della proteasi al pellet e tagliare la cromatina utilizzando cinque impulsi di sonicazione di 15 secondi.Mantieni le cellule fresche tra gli impulsi. Quindi, eseguire 10 microlitri di campione su un gel all'1,5% per diagnosticare l'efficienza del taglio. Una volta tranciati, centrifugare i campioni per 10 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta.Quindi, stimare la concentrazione proteica nel surnatante utilizzando un kit. Successivamente, preparare un impasto al 50% di perle di proteina A agarosio con tampone FA140 contenente inibitore della proteasi. Aggiungere 50 microlitri di liquame a ciascun campione e incubare i campioni a 4 gradi Celsius con rotazione costante da un capo all'altro per 30 minuti.Dopo mezz'ora, centrifugare i campioni per un minuto intorno a 1000 g in una centrifuga refrigerata. Quindi, raccogliere il surnatante contenente la cromatina marcata. Prima di procedere, conservare 1/10 dell'estratto a 20 gradi Celsius per poi fungere da controllo di ingresso.Per immunoprecipitare la cromatina, aggiungere otto microlitri di anticorpo H4K16ac o cinque microgrammi di anticorpi SMARCA5 ai surnatanti. Inoltre, aggiungi cinque microgrammi di IgG rapide all'estratto che funge da campione di controllo negativo. Incubare la cromatina a 4 gradi Celsius per una notte su un miscelatore girarrosto.Il giorno successivo, aggiungere 50 microlitri del liquame di agarosio al 50% di proteina A preparato alle immunoprecipitazioni e incubare le miscele per un'ora a 4 gradi Celsius con rotazione. Dopo un'ora, pellettare le perle di agarosio e scartare con cura il surnatante. Ora, lava le perline usando rotazioni end-over-end a 4 gradi Celsius in tre tamponi sequenziali.Per prima cosa, usa un tampone di lavaggio per immunocomplessi a basso contenuto di sale appena preparato per cinque minuti. In secondo luogo, utilizzare un tampone di lavaggio del complesso immunitario ad alto contenuto di sale appena preparato per cinque minuti. In terzo luogo, utilizzare il tampone di lavaggio del complesso immunitario al cloruro di litio appena preparato per cinque minuti.Dopo i lavaggi, aggiungere la soluzione di eluizione ai campioni come descritto nel testo. Centrifugare i campioni e trasferire l'eluato in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Ora, incubare i campioni a 65 gradi Celsius per 5 ore per invertire la reticolazione.Successivamente, precipitare il DNA. Aggiungere un millilitro di etanolo al 100% ai campioni e mescolare bene. Quindi, incubali a 80 gradi Celsius per due o tre ore o durante la notte a 20 gradi Celsius.Dopo la precipitazione, rimuovere l'etanolo con una ceintrifugazione di 15 minuti a 18000 G. Quindi, seguendo il protocollo di testo, lavare il pellet, trattare i campioni con RNasi, quindi proteinasi K, purificare il DNA come descritto nel testo e, infine, conservare a 20 gradi Celsius. Per iniziare, misurare la resa dell'input e del DNA ChIP su uno spettrofotometro.Quindi, denaturare i campioni. Aggiungere 2,5 volumi di idrossido di sodio normale 0,4, agitare brevemente e centrifugare e incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, neutralizzare il DNA denaturato aggiungendo 175 microlitri di un molare Tris idocloruro pH 6,8.Vortice, centrifugare e posizionare i campioni sul ghiaccio. Ora, preparare le diluizioni seriali del DNA in ingresso e immunoprecipitato e procedere con il test slot-blot come descritto nel protocollo di testo. Dopo che il DNA sul blot è stato immobilizzato ai raggi UV, rilevare il BrdU sullo slot blot utilizzando il western blotting.Innanzitutto, bloccare la membrana con il 5% di latte scremato in PBST per un'ora a temperatura ambiente per evitare legami aspecifici. Successivamente, preparare un bagno di latte in polvere scremato all'1% in PBST con l'aggiunta di anticorpi anti-BrdU diluiti 1:500. Incubare la macchia in questo bagno per tre ore a temperatura ambiente su uno shaker.Successivamente, lavare la membrana con PBST tre volte. Quindi, immergere il blot in una diluizione 1:5000 dell'anticorpo secondario anti-topo coniugato HRP in PBST. Incubare a temperatura ambiente per un'ora agitando.Utilizzare tre lavaggi con PBST per rimuovere il secondario e analizzare il risultato. La tecnica occidentale dello slot ChIP BrdU H4K16ac è stata utilizzata per determinare la quantità di H4K16ac associata al DNA nascente. È stato osservato un robusto arricchimento di H4K16ac associato al DNA nascente rispetto al controllo rapido delle IgG.In seguito all'inibizione di HDAC1/2 con il composto 233, è stato osservato un aumento di H4K16ac associato al DNA nascente. Lo stesso risultato è stato ottenuto utilizzando il composto 898. Infine, il livello di rimodellatore della cromatina SMARCA5 sul DNA nascente è stato determinato utilizzando la tecnica occidentale BrdU SMARCA5 ChIP slot.Infatti, SMARCA5 associati al DNA nascente e al composto 898 non hanno modificato i livelli di SMARCA5. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei cambiamenti che si verificano nella cromatina e negli enzimi che modificano la cromatina durante la replicazione del DNA nelle cellule di mammifero. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della replicazione per esplorare i cambiamenti della cromatina sul DNA nascente e la dinamica delle proteine di riparazione del DNA sul DNA nascente.In futuro, questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche per studiare la dinamica della risposta al danno del DNA e le proteine di riparazione del DNA alla forcella in stallo, oltre a studiare le modificazioni istoniche e gli enzimi che modificano la cromatina alla forcella.

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Scopri la tecnica BrdU-ChIP-Slot-Western per esaminare proteine legate al DNA nascente in cellule di mammifero. Questo metodo rapido e quantitativo aiuta a studiare la replicazione e la riparazione del DNA.

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