Time-Lapse Video Microscopia per la valutazione di EYFP-Parkin aggregazione come marcatore per cellulare Mitophagy
4 maggio 2016
Qui, descriviamo in dettaglio un approccio di microscopia video time-lapse per misurare il reclutamento temporale di EYFP-Parkin durante la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati. Questo processo dinamico di rimozione dei mitocondri danneggiati da EYFP-Parkin-dipendente può essere utilizzato come indicatore della salute cellulare in diverse condizioni sperimentali.
L'obiettivo generale di questa microscopia a video in time-lapse è seguire la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati mediata da Parkin durante il processo di mitofagia. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del metabolismo molecolare, ad esempio in che modo la mitofagia influisca sulle condizioni patologiche persistenti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce uno strumento estremamente potente per monitorare la dinamica delle proteine marcate durante i loro processi molecolari.
Questo metodo può fornire informazioni sul ciclo vitale dei mitocondri. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come colture cellulari primarie, studi di embriologia e alla previsione di una priorità. I fibroblasti embrionali di topo immortalizzati utilizzati in questo studio vengono coltivati in mezzo DMEM completo su piastre da coltura tessutale da dieci centimetri, a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il cinque percento di anidride carbonica.
Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80 percento, eliminare il mezzo mediante aspirazione sterile e aggiungere dieci millilitri di PBS sterile. Rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro di tripsina EDTA allo 0,25 percento. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due o tre minuti, fino al distacco delle cellule.
Aggiungere quattro millilitri di mezzo DMEM completo e risospendere le cellule. Prelevare dieci microlitri della sospensione cellulare per il conteggio con un emocitometro. Seminare un milione di cellule in una piastra per colture cellulari da dieci centimetri e incubare per 24 ore.
Il giorno seguente, lavare le cellule una volta con PBS e staccarle mediante tripsinizzazione, come dimostrato in precedenza. Aggiungere quattro millilitri di mezzo DMEM completo, risospendere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 250 gs e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di PBS sterile. Centrifugare nuovamente le cellule. Rimuovere il soprannatante dopo la seconda centrifugazione.
Aggiungere 100 microlitri della miscela di soluzione per elettroporazione al pellet cellulare e risospendere delicatamente il pellet mediante pipettaggio. Successivamente, aggiungere alla sospensione cellulare due microgrammi di plasmide di espressione EYFP Parkin e un microgrammo di plasmide di espressione DsRed2 Mito. Utilizzare la pipetta Pasteur monouso per trasferire la soluzione in una cuvetta sterile.
Electroporare le cellule utilizzando un programma preimpostato. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo DMEM completo fresco, preriscaldato, alle cellule e seminare le cellule in una piastra per colture cellulari di sei centimetri adatta per l'acquisizione di immagini in tempo reale.
Incubare le cellule in un'atmosfera umidificata contenente il cinque percento di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 24 ore. Prima di iniziare questa procedura, impostare la temperatura della camera del microscopio a 37 gradi Celsius. Successivamente, preparare un mezzo specifico per l'immagine in tempo reale mescolando i seguenti componenti: DMEM privo di fenolo integrato con il dieci percento di FBS, due millimolari per litro di L-glutammina, 100 unità per millilitro di penicillina e 100 milligrammi per millilitro di streptomicina.
Riscaldare preventivamente il mezzo a 37 gradi Celsius in un bagno termico. Rimuovere per aspirazione sterile il mezzo delle cellule elettroporate e aggiungere un millilitro di mezzo pre-riscaldato per l'analisi vitale. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo aver verificato che la camera del microscopio sia a una temperatura stabile di 37 gradi Celsius, immettere anidride carbonica al cinque percento nella camera. Posizionare con cura, senza movimenti bruschi o oscillazioni, la piastra con le cellule elettroporate all'interno della camera del microscopio.
Utilizzando l'interfaccia software, impostare il microscopio per rilevare i segnali fluorescenti dalle proteine di fusione codificate dai vettori di espressione EYFP Parkin e DsRed2 Mito. Aprire il software di microscopia video in lapse temporale. Nel menu superiore, selezionare FITC per EYFP Parkin e Rodamina per DsRed2 Mito.
Selezionare un'ingrandimento di 20X. Utilizzando l'interfaccia software, cercare una singola cellula che esprime entrambi i vettori codotti e registrarne la posizione. Ripetere l'operazione per un minimo di 10 cellule per ogni condizione sperimentale.
Selezionare il menu Applicazioni e fare clic su Acquisizione Multidimensionale. Nella finestra Acquisizione Multidimensionale, selezionare i parametri necessari, come il numero di acquisizioni, l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione e la posizione della cellula registrata. Fare clic su Acquisisci per iniziare l'acquisizione basale di entrambi i segnali fluorescenti.
Acquisire immagini ogni cinque minuti per un intervallo totale di quindici minuti. Durante l'acquisizione delle immagini, preparare del mezzo pre-riscaldato per l'immagine in vivo contenente carbonyl cianuro 4 trifluorometossi fenilidrazzona, o FCCP, a una concentrazione doppia rispetto alla concentrazione finale di lavoro. Interrompere il processo di acquisizione e aggiungere delicatamente un millilitro del mezzo pre-riscaldato per l'immagine in vivo con FCCP nella piastra all'interno della camera del microscopio.
Dopo l'aggiunta di FCCP, è importante riacquisire il fuoco al microscopio prima di riavviare l'acquisizione delle immagini. Riavviare il processo di acquisizione come descritto in precedenza e raccogliere immagini per un periodo totale di tre ore utilizzando la posizione registrata. Al termine dell'acquisizione delle immagini, salvare tutte le immagini acquisite per un'analisi successiva.
Qui sono mostrate immagini a intervalli di tempo dei segnali fluorescenti di EYFP-Parkin e DsRED2-Mito in fibroblasti prima dell'amministrazione di FCCP. Le aree bianche indicano le regioni ingrandite dei rispettivi pannelli a destra. Durante i punti temporali basali, EYFP-Parkin, visualizzato in verde, è diffuso in modo omogeneo in tutta la cellula.
La rete mitocondriale, visualizzata in rosso, appare ben interconnessa, come indicato dalle frecce bianche. Dopo l'amministrazione di FCCP, si osserva a cinque minuti la frammentazione mitocondriale dovuta alla depolarizzazione della membrana. Tuttavia, EYFP-Parkin è ancora diffuso in modo omogeneo nel citoplasma.
A 55 minuti dall'amministrazione di FCCP, EYFP-Parkin viene reclutato sulle membrane mitocondriali danneggiate per innescare il processo di mitofagia. Il movimento di EYFP-Parkin verso la membrana mitocondriale dopo l'amministrazione di FCCP è mostrato in questo filmato rappresentativo con intervallo di tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autofagia per sperimentare il riciclo mitocondriale. Permette alle cellule di studiare il processo di mitofagia come controllo della qualità mitocondriale all'interno delle cellule.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un approccio di microscopia video in time-lapse per seguire la rimozione selettiva, mediata da Parkin, dei mitocondri danneggiati durante la mitofagia. Questo metodo fornisce informazioni sullo stato di salute cellulare e sulla dinamica di proteine marcate in diverse condizioni sperimentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Metabolismo molecolare
Sfondo
- La mitofagia è un processo fondamentale per mantenere la salute mitocondriale.
- Parkin è una proteina coinvolta nella rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati.
- La microscopia a intervalli temporali consente l'osservazione in tempo reale dei processi cellulari.
- Questo studio utilizza fibroblasti embrionali murini immortalizzati come sistema modello.
Scopo dello studio
- Studiare la dinamica di EYFP-Parkin durante la rimozione dei mitocondri.
- Comprendere le implicazioni della mitofagia in condizioni patologiche.
- Fornire uno strumento potente per lo studio della dinamica proteica in cellule vive.
Metodi Utilizzati
- Microscopia video in time-lapse per osservare il reclutamento di EYFP-Parkin.
- Utilizzo di fibroblasti embrionali murini immortalizzati in coltura.
- Condizioni sperimentali mantenute a 37 gradi Celsius con 5% di CO2.
- Mezzo DMEM completo utilizzato per la crescita cellulare.
Risultati principali
- Monitoraggio riuscito di EYFP-Parkin durante la mitofagia.
- Informazioni sulle dinamiche del ciclo vitale dei mitocondri.
- Applicazioni potenziali in diversi sistemi biologici.
- Dimostrata l'efficacia della tecnica di microscopia.
Conclusioni
- Lo studio evidenzia l'importanza della mitofagia nella salute cellulare.
- La microscopia a intervallo temporale è un metodo prezioso per lo studio della dinamica delle proteine.
- I risultati potrebbero orientare future ricerche sulle malattie correlate ai mitocondri.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia video in time-lapse consente il tracciamento in tempo reale della dinamica delle proteine in cellule vive, fornendo informazioni fondamentali sulla mitofagia come meccanismo di controllo della qualità mitocondriale. Questa capacità supporta la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle malattie neurodegenerative e metaboliche, visualizzando l'eliminazione mitocondriale mediata da Parkin. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando eventi molecolari a risultati funzionali in sistemi pertinenti alle malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi del ruolo di Parkin nella mitofagia, supportando la verifica di ipotesi terapeutiche relative alla disfunzione mitocondriale.
- Valore operativo: Fornisce dati quantitativi con risoluzione a livello di singola cellula sulla dinamica del reclutamento delle proteine sui mitocondri danneggiati.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture fluorescenti riproducibili della co-localizzazione di EYFP-Parkin e DsRed2-Mito per la standardizzazione del saggio.
- Valore operativo: Consente flussi di lavoro di imaging scalabili per lo screening di composti che influenzano la salute mitocondriale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie dell'autofagia mitocondriale in cellule primarie e sistemi embriologici.
- Valore operativo: Facilita l'allineamento traslazionale dei biomarcatori correlando il reclutamento della Parkina con la rimozione dei mitocondri.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nella biologia della scoperta consentendo la visualizzazione in tempo reale della dinamica delle proteine, fornendo informazioni per l'identificazione di composti promettenti attraverso la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli mitocondriali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi di regolazione della mitofagia.
- Screening: Fornisce output quantitativi e risolti nel tempo per valutare gli effetti dei composti sul ricambio mitocondriale.
- Analisi: Offre misurazioni cinetiche della traslocazione proteica e della frammentazione degli organelli per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso modelli rilevanti per la malattia del controllo della qualità mitocondriale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per studi longitudinali sulla dinamica proteica in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni proteina-organello.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso parametri ambientali controllati e protocolli di imaging standardizzati.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo una visualizzazione diretta dell'interazione con l'obiettivo in sistemi cellulari vivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli mitocondriali aggiustata per il rischio, basata su letture funzionali della mitofagia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine di cellule vive, nella manipolazione di proteine fluorescenti e nell'uso del software del microscopio.
- È vincolato a sistemi di controllo ambientale per la stabilità di temperatura, CO2 e vibrazioni durante acquisizioni a lungo termine.
- Necessita della standardizzazione dell'efficienza di trasfezione e dei livelli di espressione tra popolazioni cellulari per analisi comparative.
- Richiede considerazioni adattative nel passaggio a cellule primarie o a sistemi modello alternativi con diverse efficienze di trasfezione.
- È limitato dai rischi di fototossicità e sbiancamento durante acquisizioni prolungate in time-lapse, richiedendo un'ottimizzazione dell'esposizione alla luce e degli intervalli di acquisizione.
