Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule immunitarie dal cervello ischemico del topo per la loro quantificazione e caratterizzazione fenotipica mediante citometria a flusso multiparametrica. L'analisi dell'infiammazione post-ischemica nel cervello mediante citometria a flusso multicolore fornisce una profonda comprensione dei processi immunologici implicati nella progressione della lesione, nella riparazione e nell'esito complessivo dell'ictus. Il vantaggio principale di questa procedura è la rapida centrifugazione in gradiente di densità in un'unica fase, che consente l'isolamento di un numero elevato di cellule immunitarie vitali dal cervello ischemico del topo.

L'applicazione di questa tecnica mira all'identificazione e alla convalida di nuove strategie di trattamento immunomodulatorio che possono essere applicate in una finestra temporale più ampia dell'ictus. Inizia immergendo un'estremità di un tubo della pompa di perfusione peristaltica in HBSS ghiacciato privo di calcio e magnesio. Fissa un ago smussato calibro 23 all'altra estremità del tubo.

E accendere la pompa per riempire completamente il tubo con HBSS. Quindi, posiziona un topo soppresso dorsalmente su una tavola di dissezione incorporata in un vassoio di plastica e appunta le zampe anteriori e posteriori, allungate il più possibile, con aghi calibro 20. Usando un paio di pinze dritte, una per due per afferrare la pelle addominale, praticare un'incisione laterale attraverso il tegumento e la parete addominale con forbici affilate dell'iride per esporre il fegato.

Quindi solleva lo sterno e usa la lama smussata di un paio di forbici dell'iride affilate e smussate per incidere il diaframma. Continuare a tagliare la gabbia toracica laterale su entrambi i lati in direzione caudocranica, facendo attenzione a non ferire il polmone, il cuore e le arterie toraciche e utilizzare una pinza smussata per adattarsi al lembo cutaneo. Fissare il lembo alla tavola di dissezione e separare accuratamente il cuore dal tessuto connettivo.

Tenendo il cuore con una pinza smussata, quindi inserire la punta dell'ago calibro 23 all'estremità del tubo di perfusione nell'apice del ventricolo sinistro, facendo attenzione a non ferire il setto intraventricolare. Utilizzando le forbici affilate per iris, incidere l'atrio destro e avviare immediatamente la pompa, facendo attenzione ad evitare la formazione di bolle all'interno del pompaggio. Quando il fegato diventa di un colore caffè chiaro, usa le forbici chirurgiche dritte per decapitare il topo appena dietro il cranio.

Quindi usa le forbici dell'iride per praticare un'incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto. Quando il cranio è visibile, posiziona una punta di forbici affilate dell'iride nel forame magno e fai un'incisione laterale nell'osso. Ripetere l'incisione sull'altro lato.

Quindi usa le forbici affilate dell'iride per tagliare con cura dalla stessa cavità lungo la linea mediana, verso il naso. Usando una pinza fine, staccare delicatamente le ossa craniche da ciascun emisfero cerebrale. Quindi solleva il cervello con una spatola e usa le forbici affilate dell'iride per sezionare con cura le fibre dei nervi cranici che lo fissano al cranio.

Mettere il cervello in una provetta da 15 millilitri, contenente 10 millilitri di HBSS con calcio e magnesio su ghiaccio. Per dissociare il tessuto cerebrale in una singola sospensione cellulare, in primo luogo, utilizzare una lama di rasoio pulita per rimuovere con cura il tronco encefalico e il cervelletto. Quindi usa un'altra lama di rasoio pulita per emi-sezionare il cervello, tagliando ogni emisfero lungo il piano coronale in tre pezzi di dimensioni più o meno uguali.

Usando l'estremità dello stantuffo di una siringa da cinque millilitri, schiacciare i pezzi di tessuto cerebrale attraverso un colino cellulare da 100 micron, risciacquando continuamente il colino con HBSS ghiacciato con calcio e magnesio. Quindi posizionare i fazzoletti omogeneizzati sul ghiaccio. Quando tutti i campioni sono stati elaborati, centrifugare le sospensioni cellulari e scartare con cura i surnatanti.

Risospendere i pellet in un millilitro di tampone di digestione. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da due millilitri e incubare le cellule con una lenta rotazione continua a 37 gradi Celsius. Dopo un'ora, setacciare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 70 micron e sciacquare accuratamente il filtro con tre millilitri di tampone di lavaggio contenente DNasi.

Quindi lavare il colino con 15 millilitri di tampone di lavaggio privo di DNasi, centrifugare le cellule ed eliminare il surnatante. Per rimuovere i detriti cellulari e la mielina, risospendere le cellule in cinque millilitri di terreno a temperatura ambiente, gradiente di densità del 25% e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri. Miscelare accuratamente le cellule in gradiente con pipettaggio delicato ripetuto.

Quindi centrifugare la soluzione cellulare. Al termine della separazione, aspirare con cura il rivestimento mielinico e il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere le cellule in 10 millilitri di tampone di lavaggio privo di DNasi. Trasferire le celle in una provetta da 15 millilitri e farle girare di nuovo, rimettendo in sospensione il pellet in 100 microlitri di tampone di lavaggio a freddo.

Quindi conta il numero di cellule vitali per esclusione del blu di tripano e conservale a quattro gradi Celsius. Prima di iniziare l'immunocolorazione, incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 10 minuti con il reagente anti-blocco del recettore Fc CD26/CD32 murino per prevenire qualsiasi legame aspecifico. Quindi aggiungere gli anticorpi primari di interesse coniugati con fluorofori a quattro gradi Celsius per 20 minuti al buio.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in due millilitri di tampone per citometria a flusso. Gira verso il basso. Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone per citometria a flusso e conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino all'analisi citofluorimetrica.

Per quantificare il numero assoluto di cellule immunitarie infiltranti mediante conteggio delle microsfere, pipettare esattamente 40 microlitri di citometria a flusso e 10 microlitri di sospensione cellulare in una provetta di conteggio contenente un numero noto di microsfere fluorescenti. Successivamente, incubare la cellula e la sospensione del microscotto con l'anticorpo CD45 marcato con FITC a quattro gradi Celsius per 20 minuti al buio, seguito dal riempimento inverso della provetta di conteggio con 200 microlitri di tampone per citometria a flusso. Quindi eseguire immediatamente il campione sul citometro a flusso, registrando la microsfera e gli eventi cellulari CD45-positivi.

24 ore dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media, i leucociti infiltranti il cervello possono essere identificati dalla loro alta espressione di CD45. All'interno della popolazione con CD45, i neutrofili polimorfonucleati sono identificati dalla loro espressione di LY-6G, mentre i linfociti T mostrano un fenotipo di superficie cellulare CD3-positivo ad alto CD45. Le restanti cellule CD45-high possono essere ulteriormente distinte dalla loro espressione di CD19 e CD11b.

Mentre la frazione CD11b-positiva può essere sottoclassificata in monociti infiammatori Ly-6C-alti e una popolazione Ly-6C-bassa che comprende le popolazioni di monociti, macrofagi e cellule dendritiche. Nella fase acuta dell'ictus, i neutrofili Ly-6G-positivi entrano rapidamente nel cervello dopo l'occlusione del vaso. Al contrario, le frequenze delle cellule T CD3-positive nell'emisfero ischemico diminuiscono rispetto ai cervelli chirurgici fittizi e all'emisfero controlaterale.

All'interno della popolazione CD11b-positiva, l'ischemia cerebrale sposta l'equilibrio verso una forte preponderanza di monociti infiammatori ad alto contenuto di Ly-6C. Inoltre, la conta totale dei leucociti nell'emisfero infartuato è significativamente aumentata rispetto all'emisfero controlaterale e ai cervelli chirurgici fittizi, 24 ore dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule immunitarie dal cervello ischemico mediante frammentazione meccanica, digestione enzimatica e centrifugazione a gradiente di densità e come caratterizzare queste cellule mediante citometria a flusso.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la resa totale delle cellule dipende in modo critico dalla completa dissociazione del tessuto cerebrale. Inoltre, è necessaria una sufficiente perfusione transcardica per prevenire la contaminazione dei leucociti infiltranti il cervello con cellule immunitarie circolanti non infiammatorie.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi di espressione genica o l'analisi del profilo delle citochine, per ottenere ulteriori informazioni sulla rilevanza funzionale di un ascesso immunitario distinto nel contesto dell'ictus ischemico.