Name: Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri la distribuzione tridimensionale delle fibre serotoninergiche nel midollo spinale del topo con il protocollo CLARITY/CUBIC. Questa tecnica consente l'osservazione in situ superando i limiti dell'istologia tradizionale per studi neuroanatomici.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), da una sovvenzione per un progetto NHMRC (#1086643). Il Prof. George Paxinos è supportato da una sovvenzione NHMRC (#1043626).

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida del Comitato Animal Care and Ethics (ACEC) presso l&#39;Università del New South Wales (il numero ACEC approvato è di 14 / 94A). 1. Preparazione del cavo del mouse trasparente spinale <ol><li> Preparazione di Ice Cold Hydrogel Soluzione <ol><li> Preparazione della soluzione di paraformaldeide al 16% (PFA) <ol><li> Aggiungere 16 g di polvere di paraformaldeide in 70 ml-pre riscaldato acqua distillata (50-55 ° C) e mescolare su un agitatore magnetico riscaldata fino paraformaldeide si scioglie. Nota: Non lasciare che la soluzione per il riscaldamento oltre 55 ° C ed essere consapevoli del fatto che paraformaldeide è tossico. </li><li> Trasferire la soluzione paraformaldeide ad un cilindro e aggiungere acqua distillata fino a 100 ml. Raffreddare la soluzione paraformaldeide utilizzando un C frigorifero a 4 °. </li></ol></li><li> Sciogliere 125 mg VA-044 iniziatore 26,25 ml di acqua distillata e raffreddare la soluzione in un 4° C frigo. </li><li> Raffreddare 5 ml di soluzione di acrilammide (40%), 1,25 ml di soluzione di bis (2%) (ATTENZIONE: Bis e le soluzioni di acrilamide sono tossici, può causare difetti genetici o il cancro), 5 ml di 10X PBS, 12,5 ml al 16% soluzione PFA, e la soluzione di iniziatore VA-044 su ghiaccio. </li><li> Mescolare le soluzioni sopra sul ghiaccio. Nota: il volume totale è di 50 ml. </li></ol></li><li> Perfusione e Raccolta del cavo del mouse spinale <ol><li> Anestetizzare un mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg / kg) e xyzaline (5 mg / kg) diluito in soluzione fisiologica 0,9% normale. Il dosaggio per mouse può essere inferiore a quello dei ratti. </li><li> Su una superficie di plastica adatta in una cappa aspirante, fissare gli arti del mouse lontano dal corpo (nastro adesivo è efficace) una volta che il mouse non risponde a una presa per la sua pelle del piede. </li><li> Tagliare la pelle del mouse sopra il petto e poi il torace osso per esporre il cuore con una forbice. </li><li> Utilizzando una pompa peristaltica, con un ago 25 G collegato a the estremità del tubo, inserire l&#39;ago nel ventricolo sinistro del cuore, snip l&#39;atrio destro per creare un punto di uscita per il sangue e quindi avviare il lavaggio con 40 ml 0,9% soluzione fisiologica una velocità di circa 10 ml / min. </li><li> Al termine, profumato il mouse con 35 ml di ghiaccio soluzione idrogel freddo. Nota: profumato ad una velocità di 10 ml / min per evitare gonfiore del tessuto nervoso. </li><li> Incidere la pelle sul dorso con una lama e quindi rimuovere i muscoli vicino al vertebrati. Dopo il taglio archi vertebrali da un lato e facendoli ruotare verso l&#39;altro lato, prendere il midollo spinale dalla colonna vertebrale, con una multa forbice. </li></ol></li><li> Cancellazione del cavo del mouse spinale <ol><li> Posizionare il midollo spinale in 15 ml di soluzione di idrogel notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere 10 ml della soluzione di idrogel e versare il resto della soluzione con i segmenti del midollo spinale in una provetta 5 ml. Riempire il tubo 5 ml con la soluzione di idrogel fino a quando non è completamente pieno. </li><li> Stretch un piccolo pezzo di parafilm sopra la parte superiore del tubo 5 ml e poi avvolgere parafilm intorno al collo del tubo. Nota: Assicurarsi che i contatti parafilm la soluzione idrogel e non vi siano bolle tra la soluzione idrogel e il parafilm. </li><li> Inserire il tubo 5 ml a 37 &#160; ° C forno durante la notte. Osservare la soluzione idrogel fino a farla diventare un gel. </li><li> Prendere il tubo 5 ml dal forno e rimuovere il gel dal tubo con una chiave (come un shoveled 1 ml puntale). Rimuovere il gel dal tessuto del midollo spinale da attaccare il tessuto grossolano al gel e poi prendere il tessuto grossolano di distanza (il gel si attacca al tessuto e quindi sarà rimosso dal tessuto). </li><li> Dopo aver rimosso il gel dal tessuto del midollo spinale, lavare il midollo spinale 4 volte con PBS 1x (pH 7,4) per 24 ore su un agitatore. </li><li> Preparare la soluzione di compensazione CUBIC sciogliendo 3,85 g di urea e 3,85 g N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-idrossipropil) ethylenediamine a 5.38 ml di acqua distillata. Nota: Un agitatore caldo viene utilizzato. Aggiungere 2,31 g di polietilene glicole mono-p-isooctylphenyl etere / Triton X-100 alla soluzione una volta che è chiaro e si raffredda a temperatura ambiente. Nota: 10 g di questi tre sostanze chimiche sono per un mouse. </li><li> Tagliare il mouse midollo spinale coronale in segmenti lunghi 2-3 mm con una lametta e metterli in 5 ml di soluzione di compensazione CUBIC sopra. Posizionare su un agitatore in forno a 37 &#160; ° C per 3 giorni. </li><li> Tre giorni dopo, cambiare la soluzione di compensazione per una nuova. Nota: la suddetta soluzione viene preparata prima dell&#39;uso. </li><li> Due o tre giorni più tardi, dopo l&#39;aggiornamento della soluzione di compensazione CUBIC, controllare la trasparenza del tessuto contro una carta con carattere 8 lettere. Se è trasparente, le lettere sono visibili attraverso il tessuto eliminato. Rimuovere la soluzione di compensazione e aggiungere 4 ml di PBST (0,1% Triton-X100) per lavare il tessuto 4 volte al giorno (ogni 6 ore). </li></ol></li></ol><ol><li> Incubare i segmenti del midollo spinale nella soluzione di anticorpo primario (anti-serotonina, cresciuto a coniglio, diluito 1: 100 in PBST) per 3 giorni su un agitatore in forno a 37 °. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpi e aggiungere 4 ml di PBST (0,1% Triton-X100) per lavare i segmenti del midollo spinale 4 volte al giorno (ogni 6 ore) in un forno a 37 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione PBST e aggiungere la soluzione di anticorpo secondario (594 coniugato capra anti-IgG di coniglio, diluito 1: 100 in PBST) incubare il tessuto per 3 giorni su un agitatore in forno a 37 °. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e aggiungere 4 ml di PBST per lavare i segmenti del midollo spinale 4 volte al giorno (ogni 6 ore) su un agitatore in forno a 37 °. Il giorno successivo il tessuto è pronto per l&#39;imaging. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Rimuovere la soluzione PBST e aggiungere 4 ml di 85% glicerolo per rendere l&#39;indice di rifrazione del tessuto anche. </li><li&gt; Controllare la chiarezza del tessuto. Una volta chiarito in circa 1 ora, mettere il tessuto su una grande, scivolo vetro sottile che si adatta il telaio del multi-photo fluorescente microscopio tenuta. </li><li> Mettere qualche goccia di 85% glicerolo accanto al tessuto del midollo spinale e applicare il coprioggetto con un bicchiere coprioggetto 22 x 50 mm 2. Nota: L&#39;orientamento del midollo spinale decide come l&#39;immagine assomiglia. </li><li> Mettere il vetrino sul telaio del microscopio a fluorescenza multi-photon tenuta e spostare il tessuto nel percorso della luce. </li><li> Scegliere l&#39;elio neon linea laser 594 nm e regolare l&#39;intensità del laser al livello ottimale controllando la luminosità del segnale positivo nell&#39;immagine live. </li><li> Selezionare l&#39;area di scansione del tessuto del midollo spinale con l&#39;obiettivo 20X (in acqua, NA 0,7) e preparare per creare un z-stack, e la profondità di ogni passo impostato a 3 micron. </li><li> Acquisire il tessuto dalla parte superiore alla parte inferiore del z-stack sotto la obiet 20Xtiva e quindi obiettivo 63X (in olio, NA 1.4) (dimensione del passo è stato di 1 micron), rispettivamente. Ricostruire i video 3D utilizzando un software 3D 28. </li></ol>

<ol><li>Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+raphe+magnus+modulation+of+response+of+rat+dorsal+horn+neurons+to+unmyelinated+fiber+inputs%3A+partial+involvement+of+serotonergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways.</a> J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).</li>
<li>Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+brain+to+the+spinal+cord+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Projections from the brain to the spinal cord in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).</li>
<li>Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphe+magnus+stimulation-induced+anti-nociception+in+the+cat+is+associated+with+release+of+amino+acids+as+well+as+serotonin+in+the+lumbar+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn.</a> Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).</li>
<li>Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+serotonin+metabolism+within+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+during+nucleus+raphe+magnus+stimulation%2C+as+revealed+by+in+vivo+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection.</a> Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).</li>
<li>Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+serotonin+release+in+the+rat%27s+lumbar+spinal+cord+following+electrical+stimulation+of+the+nucleus+raphe+magnus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus.</a> Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).</li>
<li>Bullitt, E., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+course+of+descending+serotoninergic+pathways+innervating+the+rodent+dorsal+horn+and+lamina+X%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X.</a> J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).</li>
<li>Jones, S. L., Light, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+patterns+of+serotoninergic+medullary+raphespinal+fibers+in+the+rat+lumbar+spinal+cord%3A+an+anterograde+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study.</a> J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).</li>
<li>Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+innervation+of+the+dorsal+horn+of+rat+spinal+cord%3A+light+and+electron+microscopic+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study.</a> J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).</li>
<li>Morrison, S. F., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+branching+patterns+and+funicular+trajectories+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons.</a> J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).</li>
<li>Barman, S. M., Gebber, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axons+of+raphespinal+sympathoinhibitory+neurons+branch+in+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord.</a> Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).</li>
<li>Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raphespinal+projections+in+the+North+American+opossum%3A+evidence+for+connectional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity.</a> J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).</li>
<li>Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+serotonergic+projections+to+the+lumbar+spinal+cord+in+the+monkey+using+a+combined+retrograde+transport+and+immunocytochemical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique.</a> Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).</li>
<li>Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+somatotopic+organization+of+nuclei+projecting+via+the+dorsolateral+funiculus+in+rats%3A+a+retrograde+tracing+study+using+HRP+slow-release+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels.</a> Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ertürk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> NeuroImage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+Alzheimer+brain+with+CLARITY%3A+senile+plaques%2C+neurofibrillary+tangles+and+axons+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 781(2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsiriX%3A+an+open-source+software+for+navigating+in+multidimensional+DICOM+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Digit+Imaging%22%5BJournal%5D)">OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images.</a> J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo descritto mostra come le fibre immagine serotoninergici nel topo midollo spinale con la chiarezza combinato e tecniche di cubi. Si introduce un processo di compensazione più veloce rispetto al protocollo di compensazione passiva sviluppato da Cheung et al. 14 e Tomer et al. 15 e permette il tessuto del midollo spinale per essere ben supportato dal idrogel durante compensazione. Un passo importante durante la fissazione del mouse midollo s...

Le proiezioni sopraspinali sono responsabili della modulazione di diversi comportamenti come la percezione del dolore. Una delle proiezioni che trasportano informazioni nocicettive contiene fibre serotoninergiche, che originano dal rafe rombencefalico e dai nuclei reticolari adiacenti1,2. Studi fisiologici e farmacologici hanno dimostrato un aumento del rilascio di serotonina nel corno dorsale del midollo spinale dopo stimolazione elettrica dei nuclei del rafe nel rombencefalo3-5. Nel ratto e nell'opossum, le fibre serotoninergiche del rafespino hanno terminali densi, non solo nel corno dorsale6-8, ma anche nella zona intermedia7,9,10, nel corno ventrale7,11 e persino nella lamina 1012,13. Non ci sono studi simili sul topo. Il presente studio mirava a mappare il pattern di terminazione delle fibre serotoninergiche derivanti dai nuclei del rafe rombencefalico e dai loro nuclei reticolari adiacenti nel midollo spinale del topo utilizzando il metodo CLARITY14 recentemente pubblicato e la sua modifica - CUBIC15. 
La fluorescenza convenzionale o l'immunoistochimica della perossidasi del midollo spinale mostra chiaramente la distribuzione delle fibre serotoninergiche nella sostanza grigia del midollo spinale in sezioni trasversali spesse 30-40 μm. Tuttavia, questo approccio non mostra la continuità dei tratti di fibre serotoninergiche nella sostanza bianca e dei loro collaterali nella sostanza grigia. Sebbene la ricostruzione 3D delle sezioni istologiche abbia fatto progredire la nostra conoscenza dei tratti di fibre, rimane una sfida per istologi e anatomisti seguire un singolo tratto a causa di piccole distorsioni nel tessuto causate dal taglio. Per aggirare questo ostacolo, un certo numero di ricercatori ha sviluppato vari protocolli per rendere trasparente l'intera struttura del tessuto e raccogliere un'immagine del tessuto inalterato in un unico file video17-21. Finora, la tecnica di idrogel tissutale (CLARITY), rigida a scambio lipidico, ibridata con acrilammide, compatibile con imaging/immunocolorazione (CLARITY), sviluppata dal gruppo14,15 di Deisseroth, così come CUBIC, sviluppata da Susaki et al16 sono le più riuscite. Dalla pubblicazione dei protocolli, molti ricercatori hanno iniziato a utilizzare queste tecniche per studiare vari aspetti dei tessuti biologici, tra cui, non solo il cervello22-25, ma anche il cuore, i reni, l'intestino e i polmoni26,27. 
Fissando il midollo spinale del topo con la soluzione di idrogel (CLARITY) e purificando con i reagenti CUBIC (che è un metodo molto più veloce di quello descritto dal protocollo CLARITY originale14,15), un blocco di tessuto del midollo spinale di 2-3 mm di lunghezza è stato eliminato entro due settimane e la colorazione in immunofluorescenza per la serotonina è stata completata in otto giorni. Con una semplice combinazione di agenti chimici, l'immunoistochimica convenzionale può essere utilizzata per creare un'immagine dei singoli tratti di fibre in un file video 3D in circa un mese.

<table><tbody><tr><td>Fotoiniziatore VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>soluzione di acrilammide al 40%</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>soluzione al 2% Bis Bio</td><td>Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>urea</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanolo,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>anticorpo della serotonina</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>capra anti coniglio IgG (H + L) anticorpo secondario, Alexa Fluor&reg; 594 coniugato</td><td>Life Technologies</td><td>. A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotone</td> https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 <td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

imaging fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse uso del chiarezza / tecnica cubic

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

fibre lunghe che scendono verso il midollo spinale sono essenziali per la locomozione, percezione del dolore, e altri comportamenti. Il modello terminazione in fibra nel midollo spinale della maggior parte di questi sistemi in fibra non sono state esaminate a fondo in qualsiasi specie. fibre serotoninergici, che proiettano al midollo spinale, sono stati studiati nei ratti e opossum su sezioni istologiche e il loro significato funzionale è stata dedotta in base al loro modello di terminazione in fibra nel midollo spinale. Con lo sviluppo della chiarezza e tecniche cubica, è possibile studiare questo sistema di fibre e la sua distribuzione nel midollo spinale, che rischia di rivelare caratteristiche precedentemente sconosciuti di percorsi supraspinal serotoninergici. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;imaging delle fibre serotoninergici nel topo midollo spinale utilizzando la nitidezza, associato e le tecniche cubi. Il metodo prevede la perfusione di un mouse con una soluzione idrogel e chiarificazione del tessuto con una combinzione di compensazione reagenti. tessuto del midollo spinale è stato eliminato in poco meno di due settimane, e la conseguente colorazione immunofluorescenza contro la serotonina è stata completata in meno di dieci giorni. Con un microscopio a fluorescenza multi-fotone, il tessuto è stato digitalizzato e l&#39;immagine 3D è stata ricostruita utilizzando il software OsiriX.

Questa sezione mostra i risultati di anticorpi serotonina colorazione nel topo trasparente midollo spinale utilizzando una combinazione di chiarezza e protocolli cubi. Abbiamo dimostrato che le fibre serotoninergici sono presenti in tutti lamine del midollo spinale con una predominanza nella porzione ventrale del corno ventrale (Figura 1, vedi anche Video 1). Il tessuto di controllo non ha avuto fibre positive (risultato non è stato mostrato). Nel corno ...

Le proiezioni sopraspinali sono importanti per la percezione del dolore e altri comportamenti, e le fibre serotoninergiche sono uno di questi sistemi di fibre. Il presente studio si è concentrato sull'applicazione del protocollo combinato CLARITY/CUBIC al midollo spinale del topo al fine di studiare la terminazione di queste fibre serotoninergiche.

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

L'obiettivo generale di questo esperimento CLARITY/CUBIC è rivelare le caratteristiche tridimensionali delle fibre serotoninergiche nel midollo spinale del topo, che non sono osservabili mediante istologia tradizionale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroanatomia, ad esempio in che modo le fibre serotoninergiche sono distribuite lungo il midollo spinale? I principali vantaggi di questa tecnica consistono nella possibilità di osservare le fibre serotoninergiche in situ, insieme all'identificazione di vettori non visibili con l'istologia tradizionale.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione del sistema nervoso centrale, può essere applicato anche ad altri sistemi, come il sistema cardiovascolare. Abbiamo inizialmente cercato di utilizzare questo metodo quando abbiamo raggiunto i limiti di un metodo di tracciamento tradizionale per analizzare le fibre serotoninergiche nel midollo spinale del topo. Iniziare fissando gli arti di un topo anestetizzato su un supporto plastico per dissezione all'interno di una cappa aspirante.Verificare l'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi e utilizzare u

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Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire...

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

Fonte: Pekarek, B. T., et. al., Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing. (2021)In questo video, dimostriamo la preparazione, l'imaging e l'analisi di un cervello di topo ripulito per esaminare gli arbori dendritici, la morfologia della colonna vertebrale e la distribuzione neuronale utilizzando la microscopia confocale e le tecniche di ricostruzione 3D.

Imaging al microscopio confocale di pergole dendritiche intatte e morfologia della colonna vertebrale in un cervello di topo pulito

Per ottenere immagini ad alta risoluzione di cellule marcate in fluorescenza all'interno di tessuti di grandi dimensioni, idealmente, i campioni biologici dovrebbero essere ripresi senza sezionamento. 3DISCO è una semplice procedura di pulizia dei tessuti basata sull'incubazione sequenziale con solventi organici. Dopo l'eliminazione, gli organi diventano trasparenti consentendo una scansione laser end-to-end del campione.

Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale In Vivo Imaging del cavo del mouse spinale

Un nuovo ex vivo preparazione per l'imaging del midollo spinale di topo. Questo protocollo consente a due fotoni imaging interazioni cellulari vivi tutto il midollo spinale.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Le tecniche di pulizia ottica stanno rivoluzionando il modo in cui i tessuti vengono visualizzati. In questo rapporto descriviamo le modifiche del protocollo originale Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Acrylamide-hybridized Imaging compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) che produce risultati più coerenti e meno costosi.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

Il protocollo fornisce un metodo dettagliato di imaging neuronale nella fetta di cervello utilizzando un metodo di compensazione dei tessuti, ScaleSF. Il protocollo include la preparazione del tessuto cerebrale, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione di fette ripulite e l'imaging al microscopio a scansione laser confocale di strutture neuronali da mesoscopiche a livelli microscopici.

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

Tecniche mini-invasive e un semplice dispositivo di laboratorio migliorano la riproducibilità del modello di lesione midollare riducendo il danno operatorio agli animali da esperimento e consentendo il mantenimento della morfologia anatomica. Il metodo è utile perché i risultati affidabili e la procedura riproducibile facilitano le indagini sui meccanismi di riparazione della malattia.

Stabilire un modello di lesione del midollo spinale per contusione murina basato su una tecnica minimamente invasiva

Scopri la distribuzione tridimensionale delle fibre serotoninergiche nel midollo spinale del topo con il protocollo CLARITY/CUBIC. Questa tecnica consente l'osservazione in situ superando i limiti dell'istologia tradizionale per studi neuroanatomici.

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

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