Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare e quantificare il numero di cellule mononucleate del sangue periferico che si sono infiltrate nel microambiente del tumore cerebrale precoce. Questo metodo può aiutare ad affrontare le questioni chiave nel campo dell'immunologia dei tumori cerebrali identificando fattori importanti per il traffico di cellule immunitarie periferiche nel microambiente del tumore cerebrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e sullo stato di attivazione dei leucociti che sono entrati in questo SNC.

Dopo aver posizionato un topo anestetizzato in una cornice stereotassica, praticare un'incisione della linea mediana di due centimetri sul cranio dall'osso frontale all'osso occipitale utilizzando una lama di bisturi. Quindi ritrarre la pelle in corrispondenza dell'incisione utilizzando i divaricatori Collibra. Successivamente, abbassare una siringa da microlitro dotata di un ago calibro 33 direttamente sopra il bma.

Regolare la posizione dell'ago per raggiungere il sito target per l'impianto del tumore. Quindi utilizzare una siringa di tubercolina da un millilitro dotata di un ago calibro 26 per contrassegnare questa posizione escoriando delicatamente il periostio dopo. Praticare un foro nel cranio nel sito di destinazione con la punta da 0,8 millimetri fino a raggiungere la dura madre sottostante durante la perforazione.

Applicare una pressione intermittente seguita da una rapida rimozione della punta del trapano dalla superficie del cranio per evitare calore e forza eccessivi. Quindi, sciacquare la siringa da microlitro con cloruro di sodio allo 0,9% in un microtubo conico in polipropilene da 1,7 millilitri per assicurarsi che l'ago non sia ostruito. Muovere delicatamente più volte il microtubo conico in polipropilene da 0,6 millilitri contenente le cellule tumorali per sospendere completamente le cellule.

Quindi aspirare due microlitri di cellule nella siringa da microlitro e assicurarsi che non vengano introdotte bolle d'aria nella siringa. Erogare un microlitro di cellule su un tampone di preparazione con alcol isopropilico al 70%, lasciando esattamente un microlitro di cellule tumorali nella siringa. Dopodiché, abbassa l'ago fino a toccare la dura madre.

Quindi abbassare l'ago di 3,5 millimetri nel cervello e successivamente ritrarre l'ago di 0,5 millimetri lentamente e senza intoppi. Erogare le cellule premendo lo stantuffo della siringa nel corso di uno o due minuti. Per eseguire la perfusione transcardiaca sul topo profondamente anestetizzato.

Inserire un ago smussato nel ventricolo sinistro del cuore. Utilizzare un piccolo paio di forbici da dissezione per tagliare l'atrio destro per consentire il dissanguamento perfuse, il sistema circolatorio del topo con soluzione tyro per diversi minuti fino a quando il fegato e i polmoni non sono completamente sbiancati per mancanza di sangue. Assicurarsi che nessuna quantità lorda di sangue continui a fuoriuscire dall'atrio destro.

Prima di rimuovere l'ago smussato del mozzo in alluminio calibro 20 dal ventricolo sinistro. Dopo aver rimosso l'ago, sganciare il mouse dal blocco di polistirene espanso estruso e capovolgere il mouse con il lato ventrale rivolto verso il basso. Usando un paio di forbici da dissezione grandi, separa la testa dal resto del corpo.

Quindi tagliare il cuoio capelluto sulla linea mediana usando un piccolo paio di forbici da dissezione che lavorano dall'osso occipitale al muso per esporre il cranio. Successivamente ritrarre la pelle su entrambi i lati del cranio e tenere saldamente il cranio. Usa un paio di URS ossei per sfondare con cautela il cranio a partire dall'osso occipitale e procedi in avanti per esporre completamente le superfici dorsale e laterale del cervello.

La raccolta del cervello di topo dal cranio senza causarvi danni può inizialmente rivelarsi difficile. Coloro che non hanno esperienza con la tecnica potrebbero voler provare più volte prima di eseguire esperimenti adeguati. Una volta rimosse le ossa craniche, girare la testa del topo con il lato ventrale rivolto verso l'alto.

Taglia i nervi cranici alla base del cervello per liberarlo dal cranio. In questa procedura, utilizzando una lama di rasoio pulita a taglio singolo, isolare l'area del cervello contenente il tumore praticando un taglio sagittale al centro del cervello. Per sezionare i due emisferi, capovolgere l'emisfero omolaterale con il lato mediale verso il basso e praticare un taglio coronale al cervelletto e un altro taglio al bulbo olfattivo per isolare il tessuto bersaglio contenente l'impianto tumorale.

Quindi, posizionare il tessuto bersaglio nel macinatore di vetro contenente un millilitro di DPBS. Spingi lo stantuffo fino in fondo e ruotalo sette volte per rompere il tessuto. Dopodiché, sollevare lo stantuffo per consentire al liquido di depositarsi sul fondo del macina fazzoletti.

Ripeti questo passaggio tre volte. Tuttavia, ruotare lo stantuffo solo quattro volte durante le due ripetizioni successive e tre volte durante l'ultima ripetizione. Per evitare di sovraccaricare il tessuto cerebrale.

Successivamente applicare tre volumi da un millilitro di DPBS ghiacciato ai lati dello stantuffo per sciacquare la materia cerebrale residua nel macinatore di tessuti. Quindi sospendiamo la materia cerebrale TRID pipettandola su e giù e la mettiamo in una provetta da centrifuga da 15 millilitri etichettata su ghiaccio. Sciacquare i lati del macinatore con un ulteriore millilitro di DPBS ghiacciato e aggiungere alla stessa provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Tenere in ghiaccio tutte le provette contenenti materia cerebrale TRID fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati. Quindi far girare la materia cerebrale TRID nelle provette da centrifuga da 15 millilitri a 740 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere la materia cerebrale pellettata in un millilitro di una miscela precedentemente preparata di collagenasi e DNA uno enzimi digestivi.

Posizionare le provette da centrifuga da 15 millilitri in un rack per provette e posizionare il rack in un bagno d'acqua CS a celle a 37 gradi per 15 minuti. Quindi agitare delicatamente i campioni due volte durante il periodo di incubazione muovendo le provette per facilitare la disaggregazione dei tessuti. Successivamente, aggiungere sei millilitri di morsa fredda DPBS a ciascun tubo per diluire gli enzimi digestivi.

Trasferiscilo su e giù per risospendere e filtrare il volume totale attraverso filtri sterili a rete di nylon da 70 micron in nuove provette da centrifuga da 15 millilitri etichettate su ghiaccio. Successivamente, far girare la sospensione delle cellule cerebrali verso il basso a 740 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet a singola cellula. Togliete le provette da 15 millilitri dalla centrifuga e mettetele sul ghiaccio.

Quindi aumentare l'impostazione della temperatura sulla centrifuga a circa 21 gradi Celsius in preparazione per il passaggio successivo. Quindi, rimuovere completamente la trappola cellulare e risospendere inizialmente i pellet cellulari in un millilitro di terreno di centrifugazione con densità al 70% utilizzando una micropipetta P 1000. Quindi aggiungere altri quattro millilitri di terreno di centrifugazione con densità al 70% a ciascuna provetta.

Mettere i tappi in modo sicuro e omogeneizzare la sospensione cellulare capovolgendo delicatamente il tubo più volte, dopodiché trasferire le provette da centrifuga da 15 millilitri contenenti cellule cerebrali risospese al 70% di densità. Mezzi di centrifugazione dal ghiaccio a un rack per provette a temperatura ambiente uno alla volta. Sovrapporre con cura due millilitri di soluzione di terreno di centrifugazione con densità al 37% sui cinque millilitri di terreno di centrifugazione con densità al 70% per formare un'interfaccia pulita tra i due strati di terreno di centrifugazione a densità.

Quindi segnare la posizione dell'interfaccia tra i due strati con un pennarello a punta fine in modo che possa essere facilmente identificata dopo la centrifugazione quando la distinzione diventa meno evidente. Centrifugare le provette da centrifuga da 15 millilitri a 740 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente senza interruzioni. Per evitare di interrompere l'interfaccia tra gli strati dei terreni di centrifugazione a densità, raccogliere i pbmc che si sono accumulati all'interfaccia tra i due strati dei terreni di centrifugazione a densità introducendo una micropipetta P 200 nella provetta.

Bypassando accuratamente lo strato lipidico una volta a livello della banda PBMC, estrarre lentamente 200 microlitri dalla superficie dello strato di terreno di centrifugazione con densità del 70% e trasferirlo in una provetta fax in polipropilene rispettivamente etichettata su ghiaccio. Ripetere questo passaggio una volta per ottenere un volume totale di 400 microlitri per campione. La capacità sperimentale di formare un'interfaccia pulita tra i due strati di terreno di centrifugazione a densità è fondamentale per l'isolamento riproducibile delle p BMC.

Si dovrebbe versare lentamente il mezzo di centrifugazione con densità del 37% mentre si inclina la provetta da 20 a 30 gradi sopra il piano del banco. Questa figura mostra la strategia di gating per un tipico esperimento, i gate posizionati su GR uno, CD 11 B, cellule mieloidi positive mostrate nel passaggio cinque e NK 1.1. Le cellule natural killer positive mostrate nella fase sei vengono quindi stratificate in base all'espressione di GZMB rispettivamente nelle fasi cinque prime e sei.

In questa figura, il back-gating di GR 1 CD, 11 cellule mieloidi B positive e NK 1.1 positive su FSCA rispetto a SSCA dimostra la dimensione linfoide più piccola delle cellule natural killer rispetto alla popolazione mieloide di dimensioni relativamente più grandi, fornendo così un'ulteriore conferma dell'identità di queste due sottopopolazioni di pbmc. I dati qui mostrano che l'attecchimento di cellule di glioma GL 26 sital one I nel syngen. Un cervello di topo XC 57 black six J induce rapidamente il reclutamento di CD 45 numeri PBMC positivi mostrati in associazione con ciascun punto dati lungo la curva GL 26 sit GAL uno I rappresenta l'induzione del fold del pbmc infiltrante il tumore sopra il controllo.

È stato dimostrato che i tumori GGL 26 sit NT all'ora specificata dopo l'impianto del tumore o HPI, sulla base del cocktail di anticorpi specifico utilizzato nella dimostrazione GR one CD 11 B e le cellule natural killer NK 1.1 positive entrano specificamente nel microambiente tumorale carente di GAL one entro 48 ore dall'attecchimento del tumore. Tuttavia, il numero totale di glioma che infiltrano le cellule mieloidi supera di gran lunga quello delle cellule natural killer. Una volta padroneggiata, la metodologia viene delineata dalla raccolta del cervello al flusso.

L'analisi citometrica può essere eseguita in circa sei ore da uno sperimentatore. È imperativo che l'intero volume di ciascun campione di PBMC sia analizzato dal citometro a flusso al fine di ottenere un confronto equo del numero totale di esperimenti complementari di pbmc infiltranti il glioma. Tale analisi immunoistochimica può essere eseguita per ottenere dati spaziali sugli infiltrati delle cellule immunitarie e per consentire la misurazione delle dimensioni complessive del tumore e della microanatomia in punti temporali che corrispondono a quelli valutati utilizzando questa procedura.

Questa tecnica può essere applicata allo studio di diversi modelli di tumore cerebrale, compresi quelli generati de novo con l'uso di oncogeni che codificano il DNA plasmatico senza alterazioni significative della procedura complessiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le sospensioni di cellule di glioma per stereotassica e graftman in un cervello di topo, come transi tumore abbondante, topi portatori di cervello e come isolare e fluire citometricamente, analizzare il glioma che si infiltra nelle cellule mononucleate del sangue periferico.