Name: Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Impara l'isolamento e l'analisi citofluorimetrica di cellule mononucleari del sangue periferico infiltranti il glioma nel microambiente tumorale cerebrale. Questo metodo fornisce dati quantitativi temporali sul numero e sullo stato di attivazione dei leucociti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (NIH / NINDS) concede R01-NS074387, R01-R21 NS057711 e-NS091555 a MGC; NIH / NINDS concede R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21 NS082311 e-NS084275 a PRL; sovvenzioni da Happy Hearts Leah, Università del Michigan Comprehensive Cancer Center assegnato a MGC e PRL; il Dipartimento di Neurochirurgia, Università del Michigan School of Medicine; l&#39;Istituto del Michigan per clinica e ricerca di salute, sostenuto da NIH concedere 2UL1-TR000433; l&#39;Università del Michigan Cancer Biology borsa di formazione sostenuto da NIH / NCI (National Cancer Institute) concessione T32-CA009676; l&#39;Università del Michigan di formazione clinica e di base Neuroscienze sostenuto da NIH / NINDS concedere T32-NS007222; e l&#39;Università del Michigan Medical Training Program Scientist sostenuto da NIH / NIGMS (Istituto Nazionale di Medicina Generale Scienze) concedere T32-GM007863. Gli autori unre grato per la leadership accademica e il sostegno ricevuto dalla dottoressa Karin Muraszko e il Dipartimento di Neurochirurgia; a M. Dahlgren, D. TomFord, e S. napoletano per eccellente supporto amministrativo; a M. Dzaman per l&#39;eccellente assistenza tecnica; e di Phil F. Jenkins per il generoso sostegno per l&#39;acquisto di un microscopio elettronico a scansione Zeiss 3D. Riconosciamo anche il laboratorio Kuchroo alla Harvard Medical School da cui è stata redatta una versione modificata della strategia mediatica-mediata centrifugazione densità per isolamento delle cellule mononucleari del cervello.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo robusto e riproducibile per l&#39;isolamento e analisi citofluorimetrica delle PBMC che hanno infiltrato inizi del mouse tumore cerebrale microambiente. Sospensioni cellulari glioma sono generati ad una concentrazione specificato dal sperimentalista che sono stereotactically innestato nello striato del cervello di topo. I topi sono poi eutanasia in momenti predeterminati previsti dal disegno sperimentale e il loro cervello sono raccolta e trattata per isolare PBMC-glioma infiltrante ...

Gliomi sono una classe di tumori cerebrali neuroepiteliali derivanti da glia trasformato nel sistema nervoso centrale (CNS). Di tutti i gliomi, Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) di grado IV glioma, o glioblastoma (GBM), è la più comune e letale 1. GBM è altamente refrattario alla cura standard di corrente, che consiste nella resezione del tumore, per quanto possibile seguito da radioterapia più chemioterapia concomitante e adiuvante con temozolomide 2. Questi tumori mortali portare una prognosi infausta di soli 15-18 mesi di sopravvivenza dal momento della diagnosi iniziale con solo il 5% dei pazienti sopravvissuti alla malattia dopo 5 anni 3. La presenza della barriera emato-encefalica (BBB), la mancanza di cellule presentanti l&#39;antigene professionali (APC), e l&#39;esistenza precedentemente non identificato di bona fide strutture linfatiche all&#39;interno del cervello 4 hanno portato alla nozione di GBM immuni privilegiato. Tuttavia, numerosi studi ora show che questi tumori cerebrali infatti generano il reclutamento di cellule immunitarie periferiche che sono prevalentemente di origine mieloide che includono monociti, macrofagi e cellule mieloidi soppressore di derivazione (MDSCs) 5. GBM influenza anche l&#39;attività di microglia cerebrale residente a diventare pro-oncogeno 6,7. Cellule linfoidi come le cellule T CD8 + 8 e CD56 delle cellule + natural killer 9 sono presenti anche all&#39;interno del microambiente tumorale, ma in molte meno numeri, un dato di fatto pensa sia dovuto alla funzione immunosoppressiva istigato da fattori di glioma di derivazione sul tumore associato macrofagi ( TAM) 10. Cellule T CD4 + sono presenti anche nel GBM, ma gran parte di questa popolazione esprime anche CD25 e FoxP3, creatori di immunosoppressiva T regolatorie (T reg) celle 11. Lo stato immunosoppressivo complessivo di GBM culmina nella promozione di evasione immunologica e la progressione del tumore 12. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Una migliore comprensione dei meccanismi di GBM immunosoppressione è fondamentale per lo sviluppo di efficaci strategie di immunoterapia progettati per stimolare il sistema immunitario contro il tumore. Negli ultimi 15 anni il nostro laboratorio ha lavorato per superare i meccanismi del cervello tumore immunosuppresson al fine di sviluppare efficaci nuovi immunotherapeutics anti-GBM 13-19. Il culmine di questo lavoro è ora portato ad uno studio clinico disegnato per valutare un citotossico combinato e terapeutico immuno-stimolante per i pazienti con nuova diagnosi di GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992). Il nostro lavoro più recente indica che CNS-1 le cellule GBM del mouse GL26 e ratto bloccano anti-tumorale di cellule NK sorveglianza immunitaria producendo grandi quantità di β-galattoside-lectina legante galectina-1 (gal-1) 20. Questo è stato dimostrato di sopprimere l&#39;espressione di gal-1 nelle cellule di glioma utilizzando shRNA mediata knockdown gene. In vitro speriments hanno dimostrato che le cellule di glioma gal-1-carente proliferavano normalmente nella cultura, ma hanno subito il rifiuto rapido subito dopo attecchimento intracranica in singenico C57BL / 6J o RAG1 - / - mice, stabilendo così l&#39;indipendenza della T o B- celle su questa forma di rifiuto del tumore. Immunodeplezione cellule NK con l&#39;anti-asialo GM 1 anti-siero o anticorpi monoclonali NK1.1 portato alla completa ristrutturazione di intracranica crescita glioma gal-1-carente, stabilendo il ruolo delle cellule NK in gal-1-carente rifiuto glioma. Mostriamo ora che immunodeplezione di cellule mieloidi Gr-1 + / CD11b + è sufficiente a prevenire gal-1-carente rifiuto glioma nonostante la presenza di cellule NK, rivelando così un ruolo ausiliario indispensabile per le cellule mieloidi in favoreggiamento di gal NK-mediata lisi tumorale -1-deficienti (dati non pubblicati). Questo risultato inatteso ci ha portato a sviluppare un protocollo completo per l&#39;isolamento e l&#39;analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) cheinfiltrarsi nel microambiente tumorale al cervello poco dopo attecchimento intracranica in modo da poter meglio caratterizzare gli eventi infiltrazione immunitario quel predicato gal-1-carente rifiuto glioma. Il metodo è dimostrata qui utilizzando cellule di glioma del mouse GL26 che la proteina fluorescente mCitrine costitutivamente espressa, chiamata GL26-Cit, che consentono la visualizzazione diretta delle cellule tumorali al microscopio a fluorescenza 21. Queste cellule sono stereotactically innestate nel cervello di singenici C57BL / 6J e sono autorizzati a crescere per 24, 48 o 72 ore prima del mouse eutanasia. PBMC-gliomi infiltranti vengono poi isolate e immunolabeled utilizzando anticorpi anti -CD45, -gr-1, -CD11b e -NK1.1 anticorpi di superficie cellulare unitamente immunomarcatura intracellulare per granzima B (GzmB). Questa combinazione specifica di anticorpi permette l&#39;identificazione di Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi infiltranti il tumore e NK1.1 +, le cellule NK, tipi di cellule che abbiamo been implicato in gal-1-carente rifiuto tumore. Il profilo infiltrazione immunitario del gal-1-carente GL26-Cit glioma, denominato qui come GL26-Cit-gal1i, viene quindi paragonato a quello di gliomi che esprimono livelli normali di gal-1 denominato GL26-Cit-NT che contengono un non- il targeting di controllo shRNA tornante. Il protocollo inizia con una descrizione su come la cultura delle cellule GL26-Cit glioma in vitro, che è seguita da una spiegazione su come innestare ortotopicamente queste cellule nello striato di singenici C57BL / 6J. Si procede quindi a enumerare i passi necessari per l&#39;isolamento e immunomarcatura di PBMC-gliomi infiltranti per l&#39;analisi di citometria di flusso. Il protocollo si conclude con la spiegazione di analisi dei dati e standard di rappresentazione grafica. La dimostrazione rivela che entrambi Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi e cellule NK1.1 + NK preferenzialmente accumulano all&#39;interno del microambiente tumorale al cervello gal-1-carente entro 48hr di impianto del tumore, un risultato che aiuta a spiegare perché questi tumori rapidamente sottoposti a completa lisi tumorale circa 1 settimana post-tumore attecchimento 20. Il metodo è facilmente adattabile a diversi modelli sperimentali in vivo in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Un singolo sperimentatore può eseguire il protocollo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Il metodo può anche essere combinato con esperimenti volti a caratterizzare il profilo di PBMC circolante nei topi affetti da tumore in confronto con quelli che infiltrano il cervello in modo da identificare fenotipi immunosoppressione specificamente indotti dal microambiente tumorale. L&#39;applicazione di questa e simili metodi dovrebbe facilitare una migliore comprensione dei fattori coinvolti nel traffico di cellule immunitarie periferiche nel microambiente tumorale al cervello.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modifica di Eagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td>con 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina, 25 mM HEPES e rosso fenolo.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfati&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>senza cloruro di calcio o cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml Penicillina; 10.000 &mu; g/ml di streptomicina</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 solfato&nbsp;</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>da Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase alternativa alla tripsina non mammifera.</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td><td>in DPBS con EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Emocitometro a contrasto di fase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0,1 mm di profondità</td></tr><tr><td>Colorazione blu di tripano</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione sterile di NaCl allo 0,9%, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>Fiale da 10 ml</td></tr><tr><td>Microprovette coniche in polipropilene da 0,6 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di atipamezolo cloridrato</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC: 52483-6298</td><td>5 mg/ml soluzione</td></tr><tr><td>Iniezione di ketamina cloridrato</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC: 0409-2051</td><td>Soluzione da 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Iniezione di dexmedetomidina cloridrato Zoetis</td><td></td><td>NDC: 54771-2805</td><td>Soluzione da 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Iniezione di xilazina cloridrato</td><td>Lloyd</td><td>NDC: 61311-481</td><td>Soluzione da 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Iniezione di carprofene</td><td>Pfizer</td><td>NDC: 61106-8501</td><td>50 mg/ml soluzione</td></tr><tr><td>Buprenorfina cloridrato iniezione</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC: 12496-0757</td><td>0,3 mg/ml fiale</td></tr><tr><td>1 ml siringhe di tubercolina&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12; (0,45 mm x 13 mm) aghi per siringa&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Tosatrici chirurgiche</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di providone-iodio</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC: 52380-1905</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico sterile in vaselina&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC: 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione di alcol isopropilico al 70%</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Garza sterile</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>non tessuto, 4" x 4", 4 strati&nbsp;</td></tr><tr><td>Microtubi conici in polipropilene da 1,7 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico per topi</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Lampada chirurgica</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II Variable Spotlight</td></tr><tr><td>Pinza da dissezione curva</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatori Colibri&nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Trapano avvitatore di precisione a batteria</td><td>Dremel</td><td>1100-01</td><td>Modello a stilo; 7,2 Volt agli ioni di litio con</td></tr><tr><td>docking station Taglierina</td><td>per incisione Dremel</td><td>105</td><td>1/32" o 0,8 mm di diametro</td></tr><tr><td>siringa da microlitro</td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Siringhe da microlitro Hamilton serie 700; 5 &mu; l volume</td></tr><tr><td>Aghi per siringa da microlitro</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, mozzo piccolo RN NDL, 1,5 pollici, punto 3, 6/PK</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 suture in nylon monofilamento nero&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>Ancoretta magnetica</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7,9 mm di diametro x 50 mm di lunghezza (5/16" di diametro x 2" di lunghezza)</td></tr><tr><td>1 L bottiglia di vetro con tappo a vite</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Tipo 1, vetro borosilicato di classe A</td></tr><tr><td>Eparina sodica&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>Soluzione da 1.000 U/ml</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II unità console</td></tr><tr><td>carbogen compresso (95% O2 / 5% CO2)</td><td>disponibile presso il fornitore locale</td><td>N/A</td><td>Tipo A, cilindro grande&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 &frac12; " aghi smussati con mozzo in alluminio</td><td>Kendall</td><td>8881202363</td><td>0,9 mm x 38,1 mm</td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio in poliuretano</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>Capacità: 0,152 once (4,5 L)</td></tr><tr><td>Collagenasi (tipo I-S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>da Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS002007</td><td>>2.000 unità Kunitz per mg di peso secco</td></tr><tr><td>Piatti di pesatura esagonali antistatici in polistirene</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>20157-3</td><td>D.I. superiore 115 mm, D.I. base 85 mm, volume 203 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lamette da barba a taglio singolo in acciaio inossidabile&nbsp;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs ossei</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione grandi</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione piccole</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinza con estremità smussata</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml di vetro Dounce macinatore di tessuti</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Density Centrifugation Media&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>monouso; sterili</td></tr><tr><td>70 &; m filtri cellulari sterili in rete di nylon&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-coniugato ratto anti-topo CD45 (clone: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>topo coniugato APC-consorted anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)</td><td>eBiosciences&nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>GR-1 anti-topo di ratto coniugato PE (clone: RB6-8C5)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto coniugato PerCP/Cy5.5 CD11b (clone: M1/70)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-ratto coniugato IgG2b, &kappa; (clone: RTK4530) controllo isotipico&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>topo coniugato con APC IgG2a, &kappa; (clone: eBM2a) controllo isotipico&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b di ratto coniugato con PE, &kappa; (clone: eB149/10H5) controllo isotipico&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5-coniugato IgG2b di ratto, &kappa; (clone: RTK4530) controllo dell'isotipo</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>515403</td><td></td></tr><tr><td>Topo coniugato blu del Pacifico IgG1, &kappa; (Clone: MOPC-21) controllo isotipico&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>15 ml provette da centrifuga in polipropilene</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>fondo conico&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in polipropilene da 50 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm provette FACS in polipropilene a fondo tondo.</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Special Order Research Prodotto citometro a flusso/selezionatore cellulare</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica 650033 Classe II</td><td>The Baker Company</td><td>SG603</td><td>modello: SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

isolamento e analisi citofluorimetrica di-glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari cellule

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che natural killer (NK), le cellule sono in grado di sradicare ortotopicamente impiantato GL26 topo e nel ratto CNS-1 gliomi maligni subito dopo attecchimento intracranica se le cellule tumorali sono resi carenti nella loro espressione della lectina galectina β-galactoside vincolante -1 (gal-1). Lavori più recenti mostra ora che una popolazione di + / CD11b + cellule mieloidi Gr-1 è fondamentale in tal senso. Per comprendere meglio i meccanismi con cui NK e le cellule mieloidi cooperano per conferire gal-1-deficienti rifiuto tumore abbiamo sviluppato un protocollo completo per l&#39;isolamento e l&#39;analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico-gliomi infiltranti (PBMC). Il metodo è dimostrato qui confrontando PBMC infiltrazione nel microambiente tumorale di gal-1-esprimendo GL26 gliomi con quelli resi gal-1-carente via shRNA atterramento. Il protocollo inizia con una descrizione di come la cultura e la preparazione GL26 cells per inoculazione nella C57BL / 6J cervello singenico del mouse. E poi spiega i passi necessari per l&#39;isolamento e l&#39;analisi dei flussi di citometria-glioma infiltrarsi PBMC dei primi del microambiente tumorale al cervello. Il metodo è adattabile ad una serie di disegni in vivo sperimentali in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Il metodo è sensibile e altamente riproducibile, come PBMC-gliomi infiltranti possono essere isolati da tumori intracranici appena 24 ore attecchimento post-tumore con conta di cellule simili osservati dal punto abbinato tumori tempo durante esperimenti indipendenti. Un singolo sperimentatore può eseguire il metodo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Modelli alternativi di glioma e / o anticorpi di rilevamento specifici per cellulari possono essere utilizzati anche a discrezione degli sperimentatori &#39;per valutare l&#39;infiltrazione di diversi altri immuntipi di cellule e di interesse, senza la necessità di modifica del procedimento generale.

La seguente strategia di gating viene utilizzato per un tipico esperimento: FSC-A e SSC-A → SSC-H e SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. conteggio → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs conteggio. Gates posto su Gr-1 le cellule mieloidi + / CD11b + e cellule NK1.1 + NK vengono poi stratificati sulla base di espressione GzmB (Figura 5A). Backgating quelle cellule identificate come cellule NK1.1 + NK e Gr-1 + / CD11b + cellule mieloidi in nostri esperim...

Presentato ecco un metodo semplice per l&#39;isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l&#39;attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare e quantificare il numero di cellule mononucleate del sangue periferico che si sono infiltrate nel microambiente del tumore cerebrale precoce. Questo metodo può aiutare ad affrontare le questioni chiave nel campo dell'immunologia dei tumori cerebrali identificando fattori importanti per il traffico di cellule immunitarie periferiche nel microambiente del tumore cerebrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e sullo stato di attivazione dei leucociti che sono entrati in questo SNC.Dopo aver posizionato un topo anestetizzato in una cornice stereotassica, praticare un'incisione della linea mediana di due centimetri sul cranio dall'osso frontale all'osso occipitale utilizzando una lama di bisturi. Quindi ritrarre la pelle in corrispondenza dell'incisione utilizzando i divaricatori Collibra. Successivamente, abbassare una siringa da microlitro dotata di un ago calibro 33 direttamente sopra il bma.Regolare la posizione dell'ago per raggiungere il sito target per l'impianto del tumore. Quindi utilizzare una siringa di tubercolina da un millilitro dotata

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Immunologia e Infezioni

L'articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per le analisi di citometria a flusso.

Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll

Questo protocollo video dimostra l'applicazione del colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) per l'identificazione e la separazione di differenti sottopopolazioni di cellule di glioblastoma umano basati sulla frequenza di divisione cellulare.

Identificazione e isolamento di Slow-divisione delle cellule nel glioblastoma umano per mezzo di Carboxy fluoresceina succinimidile Ester (CFSE)

Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.

Isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore da un cervello murino

L'infiammazione gioca un ruolo centrale nella patogenesi dell'ictus ischemico. Prove crescenti suggeriscono che agisce come un'arma a doppio taglio che esacerba le lesioni cerebrali precoci, ma contribuisce anche alla riparazione successiva. Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule immunitarie dal cervello ischemico e la loro successiva fenotipizzazione citofluorimetrica.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Questo protocollo è stato sviluppato per identificare quantitativamente i componenti del microambiente del tumore nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando immunohistochemistry cromogene e ImageJ.

Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente

Un protocollo di screening efficiente è presentato per l'identificazione di piccole molecole che promuovono astroglial differenziazione in cellule staminali di glioblastoma (artigiano). Il dosaggio è basato su un reporter di differenziazione di cellule staminali per cui l'espressione della GFP avanzata (eGFP) è guidato da promotore umano di GFAP.

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

Presentiamo un metodo per replicare il microambiente tumorale del glioma nella parte anteriore invasiva che incorpora il flusso di liquido interstiziale. Questo modello è un idrogel di acido ialuronico I in un inserto di coltura tissutale in cui è possibile applicare una testa di pressione del fluido. L'invasione può essere quantificata e le cellule possono essere isolate o lisate.

Un modello fotopolimerizzabile di acido ialuronico-collagene del microambiente di glioma invasivo con flusso interstiziale

L'identificazione delle microglia (MG) e dei macrofagi infiltranti periferici (Mø) nel midollo spinale danneggiato è difficile. In questo protocollo, la citometria a flusso (FCM) è stata utilizzata per identificare rispettivamente M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø e M2-like Mø. Questa tecnologia può essere applicata anche ad altre malattie del sistema nervoso centrale per comprendere il ruolo di MG e Mø.

Identificazione della microglia e dei macrofagi infiltranti periferici nel midollo spinale danneggiato mediante citometria a flusso

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la funzione delle cellule immunitarie dopo ictus ischemico utilizzando l'analisi citofluorimetrica in un modello di mini-ictus. Questo metodo consente un esame dettagliato delle interazioni neuroimmunitarie e può essere adattato per lo studio di altre malattie neurodegenerative, migliorando la nostra comprensione delle risposte immunitarie nella patologia dell'ictus.

Isolamento e valutazione citofluorimetrica delle interazioni neuroimmunitarie in un modello murino di mini-ictus

Impara l'isolamento e l'analisi citofluorimetrica di cellule mononucleari del sangue periferico infiltranti il glioma nel microambiente tumorale cerebrale. Questo metodo fornisce dati quantitativi temporali sul numero e sullo stato di attivazione dei leucociti.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

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