Procedura di registrazione poligrafica per la misurazione del sonno nei topi
25 gennaio 2016
La registrazione dell'elettroencefalogramma (EEG) e dell'elettromiogramma (EMG) nei topi che si comportano liberamente è un passo fondamentale per correlare il comportamento e la fisiologia con il sonno e la veglia. Il protocollo sperimentale qui descritto fornisce un sistema basato su cavo per l'acquisizione di registrazioni EEG ed EMG nei topi.
L'obiettivo generale di questa procedura di registrazione poligrafica è determinare lo stato di vigilanza dei topi e misurare il tempo trascorso in veglia, sonno con movimenti oculari rapidi o sonno con movimenti oculari non rapidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in quasi tutti i campi delle neuroscienze che cercano di correlare il comportamento e la fisiologia con l'attività dei neuroni corticali negli animali che si comportano. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può registrare molti nodi, elettroencefalogramma ed elettromiogramma e può essere combinata con altri impianti cerebrali come fibre ottiche e cannule per infusione.
La dimostrazione visiva di questo metodo è molto importante perché l'impianto dell'elettrodo deve essere eseguito correttamente e la qualità dell'elettrodo è estremamente critica per giudicare gli stati fisici. A dimostrare la procedura sarà Yohko Takata, un postdoc del mio laboratorio. Prima di iniziare, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore a microsfere caldo.
Una volta che il topo è confermato come anestetizzato da un pizzico di dita, radere i peli sulla testa e sul collo. Quindi, fissa la casetta al telaio stereotassico e fissa la testa tra le due barre auricolari. Quindi, applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza.
Procedere con la detersione della pelle rasata con scrub a base di alcool e iodio. Quindi, taglia lungo la linea mediana con un bisturi per esporre il cranio e fissa la pelle di lato usando delle clip per mantenere aperta l'area chirurgica. Utilizzando una fresa in metallo duro con un trapano da 0,8 millimetri, praticare due fori.
Metti un foro sopra l'area corticale frontale. Metti il secondo foro sopra l'area parietale dell'emisfero destro. Quindi, utilizzando un cacciavite da gioielliere, avvitare le viti di registrazione EEG in acciaio inossidabile nei fori.
Inserire le viti con soli due o due giri e mezzo per ottenere il posizionamento epidurale sopra la corteccia. Le viti non devono oscillare una volta inserite. Questo è molto importante.
Ora, fissa il gruppo elettrodo con i perni verso l'alto al cranio. Gli elettrodi devono essere fissati in modo diretto. Utilizzare un batuffolo di cotone per fissare la posizione dell'elettrodo e incollare l'elettrodo con cianoacrilato seguito da cemento dentale.
Quindi, praticare piccoli fori nel trapezio e inserire l'elettrodo EMG in quei fori. Quindi, sutura la pelle con filo di seta di 0,1 millimetri di diametro. Ora, rimuovi il mouse dalla cornice stereotassica e posizionalo su un pad termico.
Somministrare al topo iniezioni intraperitoneali di ampicillina e meloxicam e monitorare il topo fino a quando non riacquista la decubito sternale. Quindi, ospita il topo da solo. Una settimana dopo l'impianto degli elettrodi, trasferire il topo in una gabbia sperimentale in una camera di registrazione insonorizzata.
Fissare il gruppo elettrodo EEG/EMG del mouse a un cavo di registrazione collegato a un collettore rotante. Collegare il cavo del convertitore AD a un amplificatore del filtro di segnale EEG/EMG collegato al collettore rotante. Utilizza un convertitore AD per convertire il segnale in un segnale digitale a 128 hertz e, infine, registra il segnale su un computer.
Abituare il mouse per due o tre giorni nella camera di registrazione. Se la registrazione EEG/EMG include le somministrazioni di farmaci, maneggiare delicatamente il topo ogni giorno come quelli in cui è stata somministrata una somministrazione di farmaco. Successivamente, avviare il software di registrazione EEG/EMG.
Per iniziare, fai clic sulla scheda Informazioni sul file di dati e fai clic sulla casella accanto al nome del file. Inserisci un nome per il file e fai clic su Salva. Quindi, dalla scheda Condizione di registrazione, selezionare tutti i canali EEG/EMG che devono essere registrati.
Inoltre, seleziona la Frequenza di campionamento in questa scheda. Ora, nella scheda Informazioni sul canale, controlla se i canali selezionati vengono visualizzati correttamente. Una volta confermato, avvia la registrazione selezionando prima la scheda Impostazioni timer.
Quindi, fare clic su monitor per visualizzare EEG ed EMG. Se i segnali vengono visualizzati correttamente, impostare l'ora dell'orologio per l'inizio e la fine della registrazione nell'area Timer principale. Quindi, fare clic sul pulsante Monitor per avviare la registrazione.
Ora, registra i segnali in condizioni di base e in diverse condizioni di trattamento per diversi giorni. Al termine dell'esperimento, sopprimere il topo con pentobarbital. Avviare il software per l'analisi EEG/EMG.
Aprire i dati grezzi EEG/EMG, che sono un file KCD. Fare clic sulla scheda Sospensione e impostare l'ora Epoch su 10 secondi. Quindi, selezionare Screening multiplo per assegnare automaticamente un punteggio a tutte le epoche di dieci secondi in tre fasi sulla base delle ampiezze dell'EEG e dell'EMG e in base all'analisi spettrale di potenza dell'EEG.
Quindi, fare clic sulla condizione FFT per la scheda EEG. Lì, imposta i parametri per l'analisi spettrale di potenza. Utilizzare 256 punti di riferimento corrispondenti a ogni due secondi di EEG, utilizzare la funzione della finestra di Hamming e utilizzare una media di cinque spettri per epoca.
Quindi fare clic su Ok.Ora, fare clic su Avvia screening per iniziare lo screening automatico. Quindi, aprire i dati memorizzati, che vengono salvati in un formato di file RAF e controllare i risultati dello screening automatico. Se necessario, correggere i risultati se non soddisfano i criteri standard.
Per apportare una correzione, fare clic e tenere premuto il pulsante sinistro del mouse su un'epoca con punteggio errato e trascinare il cursore sulla stringa di epoche con punteggio errato. Rilasciare il pulsante sinistro del mouse e selezionare lo stato di comportamento corretto nella finestra popup. In condizioni di base, i topi hanno mostrato un chiaro ritmo circadiano sonno-veglia coerente con la loro natura notturna.
Durante il periodo di luce di 12 ore, i topi hanno avuto una media di 6,7 ore di sonno NREM e 0,9 ore di sonno REM. Mentre, durante il loro periodo di buio di 12 ore, la veglia era predominante. Sono state registrate anche altre misurazioni.
Questi includevano la distribuzione dell'epoca del sonno, la loro durata media e le transizioni di stadio per ogni stato di vigilanza. Gli spettri di potenza EEG per il sonno NREM e REM mostrano una forte densità di potenza EEG nell'intervallo di frequenza da 0,5 a quattro hertz per il sonno NREM rispetto a una densità di potenza da sei a 10 hertz per il sonno REM. Per valutare l'impatto della caffeina sul sonno, i topi C57 black 6 sono stati trattati con un veicolo un giorno e con caffeina il giorno successivo.
Le iniezioni intraperitoneali di caffeina sono state somministrate all'inizio del ciclo di luce. Come previsto, la registrazione ha rivelato che la caffeina ha aumentato la quantità di veglia nei topi. Un aumento di tre volte della veglia si è verificato per tre ore dopo l'iniezione.
Una volta padroneggiata, la procedura di impianto dell'elettrodo può essere eseguita in meno di 20 minuti. Il punteggio e la correzione dei dati EEG per un periodo di 24 ore possono essere eseguiti in circa 30 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare la registrazione dell'elettroencefalogramma e dell'elettromiogramma nei topi e come valutare se e per quanto tempo un animale è sveglio o addormentato.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura di registrazione poligrafica per valutare lo stato di vigilanza di topi in libera attività mediante misurazioni di EEG e EMG. Il metodo consente ai ricercatori di correlare comportamento e fisiologia con gli stati del sonno, fornendo informazioni sull'attività dei neuroni corticali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Analisi del comportamento
Sfondo
- Le registrazioni dell'elettroencefalogramma (EEG) e dell'elettromiogramma (EMG) sono essenziali per lo studio del sonno e della veglia.
- La tecnica può essere combinata con altri impianti cerebrali per una raccolta dati completa.
- Un'adeguata impiantazione degli elettrodi è fondamentale per ottenere misurazioni accurate.
- Le dimostrazioni visive migliorano la comprensione della procedura chirurgica.
Scopo dello studio
- Determinare lo stato di veglia nei topi.
- Misurare il tempo trascorso in vari stati di sonno.
- Correlare i dati fisiologici con le osservazioni comportamentali.
Metodi Utilizzati
- Registrazione poligrafica di EEG e EMG nei topi.
- Utilizzo di un sistema basato su cavi per l'acquisizione dei dati.
- Impianto chirurgico di elettrodi in condizioni sterili.
- Dimostrazione visiva della procedura di impianto.
Risultati principali
- Registrazione riuscita di segnali fisiologici multipli.
- Capacità di valutare sonno e veglia in topi liberi di comportarsi spontaneamente.
- L'integrazione con altri apparati sperimentali è realizzabile.
- La qualità del posizionamento degli elettrodi influisce in modo significativo sull'accuratezza dei dati.
Conclusioni
- Questo metodo è fondamentale per comprendere la relazione tra comportamento e fisiologia.
- Fornisce un quadro di riferimento per futuri studi in vari campi delle neuroscienze.
- Una tecnica e un'attrezzatura adeguate sono essenziali per ottenere risultati affidabili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione accurata degli stati di sonno-veglia in modelli preclinici è essenziale per ridurre i rischi associati a candidati farmaci mirati al sistema nervoso centrale, collegando i fenotipi comportamentali all'attività neurale sottostante. Questo metodo di registrazione poligrafica consente un monitoraggio quantitativo e longitudinale degli stati di vigilanza in topi liberamente attivi, supportando la validazione meccanicistica di composti che modulano il sonno. La tecnica garantisce una continuità traslazionale dall'interazione con il bersaglio fino all'output funzionale, fornendo informazioni decisive per le scelte di avanzamento o interruzione nei primi stadi dei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche correlando gli stati del sonno definiti tramite EEG/EMG con manipolazioni farmacologiche o genetiche.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target attraverso misurazioni oggettive e quantificabili degli stati di veglia che riducono l'ambiguità meccanicistica.
- Valore predittivo: Genera dati di dose-risposta e di andamento temporale che aumentano la fiducia nell'interazione con il target e nella modulazione del percorso biologico.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Produce segnali standardizzati di EEG e EMG ad alta fedeltà, adatti per pipeline automatizzate di analisi mediante soglie spettrali e di ampiezza.
- Output quantitativo: Fornisce una classificazione basata su epoche di veglia, sonno NREM e sonno REM, consentendo confronti riproducibili tra gruppi.
- Scalabilità: Compatibile con configurazioni di registrazione cronica, che permettono valutazioni longitudinali in diverse condizioni di trattamento e cicli circadiani.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Modella l'architettura del sonno umano attraverso parametri quantificabili del sonno NREM e REM, supportando studi su disturbi del sonno e condizioni neuropsichiatriche.
- Allineamento del Biomarcatore Traducibile: Le variazioni spettrali della potenza dell'EEG (delta 0.5–4 Hz per il sonno NREM, theta 6–10 Hz per il sonno REM) fungono da biomarcatori quantificabili delle transizioni tra stati di sonno.
- Progressione Valutata per Rischio: I dati sulla distribuzione sonno-veglia informano la caratterizzazione preclinica di sicurezza ed efficacia, in particolare per composti attivi sul sistema nervoso centrale che influenzano l'arousal o la sedazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica delle ipotesi fino all'ottimizzazione del composto promettente, fornendo letture fisiologiche che collegano l'intervento molecolare con l'output comportamentale nello sviluppo di farmaci neuropsichiatrici.
- Biologia della Scoperta: Permette l'interrogazione basata su ipotesi dei circuiti neurali che regolano l'arousal e le transizioni sonno-veglia attraverso manipolazioni specifiche per tipo cellulare combinate con letture fisiologiche.
- Screening: Consente un monitoraggio degli stati di vigilanza pronto all'uso e riproducibile per valutare gli effetti dei composti sulla struttura del sonno durante cicli di 24 ore.
- Analisi: L'analisi spettrale di potenza e la classificazione automatica delle epoche forniscono letture quantitative e confrontabili per valutare i cambiamenti indotti da farmaci nella durata e nella frammentazione del sonno.
- Ricerca Translazionale: Favorisce la continuità verso la validazione preclinica modellando nei fenotipi EEG del sonno umano e nella regolazione circadiana un sistema geneticamente accessibile.
- Riutilizzo Aziendale: Un'infrastruttura chirurgica e di registrazione riutilizzabile supporta studi longitudinali in diversi progetti, riducendo il carico di configurazione per ogni singolo studio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità tra effetti molecolari e risultati funzionali del sonno-veglia.
- Valore operativo: I protocolli standardizzati di impianto degli elettrodi e di acquisizione dei segnali migliorano la riproducibilità tra laboratori e serie sperimentali.
- Valore strategico: Consente un'identificazione precoce di effetti collaterali sul sistema nervoso centrale, migliorando l'efficienza del capitale e riducendo l'abbandono in fasi avanzate a causa di alterazioni del sonno non previste.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei composti in base ai profili di rischio associati al sonno-veglia, allineando le decisioni di sviluppo con le considerazioni relative all'indice terapeutico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia stereotassica, acquisizione di segnali EEG/EMG e analisi spettrale per la classificazione dei stadi del sonno.
- È dipendente da un'infrastruttura stabile per la registrazione, inclusi anelli sdoppiatori, amplificatori e software in grado di effettuare analisi EEG basate sulla FFT e classificazione automatica degli stati.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda il posizionamento degli elettrodi, i parametri di filtraggio e i criteri di scoring, al fine di garantire la comparabilità dei dati.
- Le considerazioni relative all'adattamento includono aggiustamenti per diverse ceppi di topi, età o modelli con comorbilità che potrebbero alterare l'architettura basale del sonno o la qualità del segnale.
- I limiti pratici includono il tempo di recupero post-chirurgico, vincoli comportamentali legati al cavo di collegamento e la necessità di un periodo di abituazione alle camere di registrazione per ridurre al minimo la frammentazione del sonno indotta dallo stress.
