Name: Procedura di registrazione poligrafica per la misurazione del sonno nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Impara la registrazione poligrafica EEG/EMG per studiare i cicli sonno-veglia nei topi liberamente comportanti. Questa tecnica consente di correlare attività corticale e stati fisiologici in modo affidabile.

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Ringraziamo il Dr. Larry D. Frye per l'aiuto editoriale con questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research 24300129 (a M.L.), 25890005 (a Y.O.) e 26640025 (a Y.T.), dalla National Agriculture and Food Research Organization (a Y.U.), dalla World Premier International Research Center Initiative (WPI) dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (a Y.O., Y.T., Y.U. e M.L.) e il Nestlé Nutrition Council, Giappone (a M.L.).

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Experiment Animal Istituzionale presso l&#39;Università di Tsukuba. 1. Preparazione di elettrodi e cavi per EEG / EMG Recordings <ol><li> Preparare EEG / EMG elettrodo di registrazione in base alla seguente procedura. Nota: L&#39;elettrodo è monouso e può essere utilizzato solo per 1 animale. Pianificare attentamente la configurazione di cablaggio per tutti i connettori. Posizionare segni sui connettori per l&#39;orientamento corretto. <ol><li> Saldare ogni pin di un colpo di testa a 4 pin per un filo di acciaio inossidabile di 2 cm. In breve, tenere un capo del filo al pin, inserire un saldatore caldo sul giunto wire-pin, e sciogliere qualche saldatura per garantire che sufficiente saldatura senza intoppi nel giunto. Fare attenzione a non applicare troppo calore al perno; altrimenti, la plastica attorno ai perni si scioglierà. </li><li> Saldare l&#39;estremità libera di ciascuna delle 2 fili collegati ai pin alla testadi una vite in acciaio inox 1,0 mm di diametro. In breve, tenere l&#39;estremità libera del filo per il filo sotto la testa della vite, posizionare un saldatore caldo sul giunto wire-vite e sciogliere qualche saldatura per garantire che sufficiente saldatura senza intoppi nel giunto. I 2 fili con le viti servono come elettrodi di registrazione EEG, mentre i 2 fili senza viti fungono da elettrodi di registrazione EMG. </li><li> Utilizzare forbici per togliere 1 mm dell&#39;isolamento all&#39;estremità degli elettrodi EMG per aumentare la qualità del segnale EMG. </li><li> Coprire completamente tutti i perni saldati con adesivo epossidico, utilizzando un sottile bastone di legno o stuzzicadenti per ridurre il rumore elettrico durante le registrazioni di EEG / EMG. </li></ol></li><li> Preparare un cavo per collegare l&#39;elettrodo con l&#39;anello di contatto come descritto di seguito. Questo cavo può essere riutilizzato. <ol><li> Saldare ogni pin di un connettore FFC / FPC a 4 pin con un filo di un cavo piatto da 30 cm. In breve, tenere l&#39;estremità spelata del cavo al pin, inserire un saldatore caldosul giunto wire-pin, e sciogliere qualche saldatura per garantire che solo abbastanza solder intoppi nel giunto. Nota: scegliere la lunghezza del cavo piatto che è appropriato per l&#39;altezza della gabbia animale sperimentale utilizzato per le registrazioni di EEG / EMG. </li><li> Saldare crimpare socket per una punta dei fili sull&#39;altra estremità del cavo piatto. In breve, tenere una presa crimpatura all&#39;estremità libera spellata del cavo, inserire un saldatore sul giunto fili socket, e si fondono qualche saldatura per garantire che quel tanto che basta a saldare senza intoppi nel giunto. </li><li> Inserire ogni aggraffatura presa in una posizione 4 crimpare abitazioni. </li><li> Completamente coprire il socket con adesivo epossidico aggraffatura utilizzando un sottile bastone di legno o stuzzicadenti. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;impianto di elettrodi in the Head Mouse (durata:. Circa 20 min) <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in un cordone di sterilizzatore a caldo prima della chirurgia. Anestetizzare un topo maschio (10 - 20 settimane, 20 - 30 g)con un&#39;iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50 mg / kg). Dopo aver verificato che il mouse è profondamente anestetizzati pizzicando un dito del piede, radersi i capelli sulla testa e sul collo con un rasoio. </li><li> Muovi il mouse per il telaio stereotassico, e fissare la testa tra i 2 bar dell&#39;orecchio. Applicare vaselina sugli occhi per prevenire la secchezza. Pulire la pelle rasata con l&#39;alcol e tagliarlo lungo la linea mediana con un bisturi per esporre il cranio. Agganciare la pelle a mantenere l&#39;area chirurgica a cielo aperto. </li><li> Utilizzando una fresa (dimensioni trapano: 0,8 mm di diametro), trapano 2 fori nel cranio, uno sopra l&#39;area corticale frontale (1 mm anteriore al bregma, 1.5 mm lateralmente alla linea mediana) e l&#39;altro sopra la zona parietale ( 1 millimetro anteriore al lambda 1,5 mm lateralmente alla linea mediana) dell&#39;emisfero destro, secondo coordinate stereotassiche di Paxinos e Franklin. 23 </li><li> Utilizzando cacciavite una gioielleria, in acciaio inox posto viti di registrazione EEG nei fori e fare 2 - 2,5 giri per ogni schew per posizionamento epidurale sulla corteccia. Nota: Non inserire le viti troppo profonde per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale. Verificare che le viti siano ben fissati sul cranio. Ciò è importante avere segnali EEG stabile durante un lungo periodo di registrazioni multiple (tipicamente, più di 1 mese). Viti Wiggly producono artefatti EEG e possono venire fuori prima della fine del programma sperimentale. </li><li> Fissare il gruppo elettrodi (vedi Sezione 1.1, perni rivolti verso l&#39;alto) con colla istantanea al cranio e coprire con del cemento dentale. Fai bilateralmente piccoli fori con una pinza nei trapezio (collo) i muscoli e inserire i cavi di acciaio inossidabile che fungono da elettrodi EMG nei fori. Suturare la pelle con un filo di seta (diametro 0,1 mm) per evitare l&#39;esposizione del muscolo. </li><li> Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico. Somministrare ampicillina (100 mg / kg) e meloxicam (1 mg / kg) per via intraperitoneale al mouse per evitare l&#39;infezione batterica e per ridurre il dolore post-operatorio, rispettivamente. Keep il mouse su un blocco di calore e controllare fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa il mouse individuale durante il recupero per evitare la rimozione di elettrodi da altri animali, e amministrare meloxicam (1 mg / kg) per via intraperitoneale il primo giorno dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 3. Registrazione e acquisizione EEG / EMG dati <ol><li> Dopo un periodo di recupero di 1 settimana, casa ciascun topo individualmente in una gabbia sperimentale posto in una camera di registrazione insonorizzata. Mantenere una temperatura ambiente di 23 ± 1 ° C e automaticamente cicli di 12 ore di luce / 12 ore scuro controllare (luci accese alle 08:00, intensità di illuminazione ~ 100 lux). </li><li> Collegare il gruppo elettrodi EEG / EMG sulla testa del mouse di un cavo di registrazione. Assicurarsi che il cavo di registrazione è collegato ad un collettore (che è progettato in modo che i movimenti del mouse non sono limitati dalla torsione del cavo) e un amplificatore di segnale EEG / EMG. Filtro EEG / segnali EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizzare ad una frequenza di campionamento di 128 Hz da un convertitore analogico-digitale (A / D) e, infine, la registrazione su un computer con software di registrazione EEG / EMG (&#39;Materiali&#39; Tavolo, 4 ° ingresso dal basso). </li><li> Abituare il mouse per 2 - 3 giorni nella camera di registrazione. Se la registrazione EEG / EMG include amministrazioni droga intraperitoneali, gestire delicatamente il mouse su ogni giorno assuefazione al momento della somministrazione del farmaco. </li><li> Successivamente, avviare il software EEG / EMG registrazione (&#39;Materiali&#39; Tabella, 4 ° ingresso dal basso). <ol><li> Selezionare la scheda &#39;file di dati informazioni&#39; e fare clic sulla casella accanto al nome del file. Immettere un nome file e fare clic su &#39;Salva&#39;. </li><li> Selezionare la scheda &#39;condizioni di registrazione&#39; e selezionare tutti i canali EEG / EMG, che verranno registrate. </li><li> Selezionare la frequenza di campionamento (128 Hz) nella scheda &#39;condizione di registrazione&#39;. </li><li> Controllare se i canali selezionati vengono visualizzati correttamente in thscheda e &#39;Canale informazioni&#39;. </li><li> Selezionare la scheda &#39;impostazione del timer&#39; e cliccare su &#39;Monitor&#39; per visualizzare EEG e EMG. </li><li> Controllare se i segnali EEG / EMG vengono visualizzati correttamente. </li><li> Selezionare la scheda &#39;impostazione del timer&#39; e impostare l&#39;ora per l&#39;inizio e la fine della registrazione nell&#39;area &#39;Timer principale&#39;. </li><li> Fare clic su &#39;Monitor&#39; nella scheda &#39;impostazione del timer&#39; per avviare la registrazione. </li></ol></li><li> Registra segnali EEG / EMG sotto della linea di base (es., Il comportamento del sonno / veglia di un mouse liberamente comportarsi) e diverse condizioni di trattamento (ad es., Somministrazione di caffeina o trattamento simulato) per diversi giorni. Euthanize il mouse con una iniezione intraperitoneale di pentobarbital (200 mg / kg) dopo l&#39;ultimo giorno sperimentale. </li></ol> 4. Punteggio di Behavioral Stato Sulla base di EEG / EMG dati <ol><li> Avviare il software per l&#39;analisi EEG / EMG (&#39;Materiali&#39; Tavolo, 4 ° ingresso dal basso). Aprire i dati grezzi EEG / EMG (file .kcd) prodotte sotto il punto 3. Fare clic sulla scheda &#39;Sleep&#39; e selezionare il tempo di Epoch. Selezionare 10 sec. </li><li> Fare clic sulla scheda &#39;Sleep&#39; e selezionare &#39;Multi-screening&#39; di segnare automaticamente tutte le epoche di 10 sec in 3 fasi (ad es., NREM e il sonno REM, e veglia), sulla base delle ampiezze di EEG e EMG e l&#39;analisi spettrale di potenza dell&#39;EEG. 3 </li><li> Fare clic su &#39;condizioni FFT per EEG&#39;. </li><li> Impostare i parametri per l&#39;analisi spettrale di potenza [256 punti di riferimento (corrispondente a 2 secondi della EEG), funzione finestra Hanning, e la media di 5 per ogni epoca spettri]. 3 Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Fare clic su &#39;Start&#39; di screening per iniziare la proiezione automatica. Aprire i dati ottenuti (file .raf). </li><li> Controllare i risultati dello screening automatico e, se necessario, correggere manualmente in base ai criteri standard (vedere Risultati rappresentativi Figura 1B, e Tabella 1 </sTrong&gt;). 2, 3 In breve, cliccare e tenere premuto il tasto sinistro del mouse su un&#39;epoca in modo non corretto ha segnato e trascinare il cursore attraverso la stringa di epoche erroneamente segnato. Rilasciare il tasto sinistro del mouse e selezionare il corretto stato comportamentale nella finestra pop-up. Nota: Di tanto in tanto, epoche presso la transizione tra due stati vigili sono difficili da segnare in modo inequivocabile a uno Stato. In tali casi, l&#39;epoca risposta deve essere allo stato apparente e gli stessi criteri dovrebbe essere applicata a epoche simili in tutto l&#39;esperimento di garantire la riproducibilità dei dati. </li></ol>

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</ol>

Gli autori Yujiro Tauguchi e Sayaka Kohtoh sono dipendenti di Kissei Comtech Co., Ltd che sviluppa il software SleepSign per l'acquisizione e il punteggio automatico dei dati EEG/EMG utilizzati in questo articolo.

Questo protocollo descrive un set-up per le registrazioni di EEG / EMG che permette di valutare sonno e veglia sotto a basso rumore, condizioni di costo-efficaci e ad alto rendimento. A causa delle piccole dimensioni del gruppo testa elettrodi EEG / EMG, questo sistema può essere combinato con altri impianti per esperimenti intra-cerebrali, compresi optogenetics (fibra impiantazione ottico) o, in combinazione con simultanea cannula impiantazione, microinfusion di farmaci nel mouse cervello. 31 Inoltre, il des...

I progressi tecnici hanno spesso precipitato salti quantici nella comprensione dei processi neurobiologici. Ad esempio, la scoperta di Hans Berger nel 1929 che potenziali elettrici rilevati dal cuoio capelluto umano hanno assunto la forma di onde sinusoidali, la cui frequenza è direttamente correlato al livello di veglia del soggetto, ha portato a rapidi progressi nella comprensione del sonno-veglia regolazione, sia negli animali e nell&#39;uomo simili. 1 A tutt&#39;oggi l&#39;electroencephlogram (EEG), in combinazione con il elettromiogramma (EMG), cioè., attività elettrica prodotta dai muscoli scheletrici, rappresenta i dati &quot;backbone&quot; di quasi ogni sperimentale e clinica valutazione che cerca di correlare il comportamento e fisiologia con l&#39;attività di neuroni corticali comportarsi animali, compresi gli esseri umani. Nella maggior parte dei laboratori di ricerca di base sonno queste registrazioni EEG sono eseguite utilizzando un sistema basato su cavo (Figura 1) in cui d acquisitoata è sottoposto off-line per modello e lo spettro di analisi [ad es., l&#39;applicazione di una trasformata di Fourier (FFT) algoritmo] per determinare lo stato di vigilanza del soggetto in fase di registrazione. 2, 3 sonno è costituito da movimenti rapidi degli occhi (REM) e non-REM (NREM) del sonno. Sonno REM è caratterizzato da un rapido a bassa tensione EEG, il movimento degli occhi a caso, e atonia muscolare, uno stato in cui i muscoli sono effettivamente paralizzati. Sonno REM è noto anche come sonno paradossale, perché l&#39;attività cerebrale assomiglia a quello di veglia, mentre il corpo è in gran parte scollegato dal cervello e sembra essere in sonno profondo. Al contrario, i neuroni motori vengono stimolati durante il sonno NREM, ma non c&#39;è il movimento degli occhi. NREM sonno umano può essere suddiviso in 4 fasi, per cui la fase 4 è chiamata sonno profondo o sonno ad onde lente ed è identificato da grandi onde cerebrali lente con l&#39;attività delta tra 0,5-4 Hz EEG. D&#39;altra parte, una suddivisione tra fasi di sonno non-REM in piccoli animali, come topi unnd topi, non è stato stabilito, soprattutto perché non hanno lunghi periodi di sonno consolidati come visto negli esseri umani. Nel corso degli anni, e sulla base dell&#39;interpretazione EEG, diversi modelli di regolazione sonno-veglia, sia di circuito ea base umorale-, sono stati proposti. Il neurale e base cellulare della necessità di dormire o, in alternativa, &quot;drive sonno&quot;, rimane irrisolto, ma è stato concettualizzato come una pressione omeostatica che costruisce durante il periodo di veglia ed è dissipata dal sonno. Una teoria è che i fattori endogeni somnogenic accumulano durante la veglia e che la loro graduale accumulo è il fondamento del sonno pressione omeostatica. Mentre la prima ipotesi formale che il sonno è regolato da fattori umorali è stato accreditato al lavoro di Rosenbaum pubblicato nel 1892 4, è stato Ishimori 5, 6 e Pieron 7 che in modo indipendente, e più di 100 anni fa, ha dimostrato l&#39;esistenza di sostanze chimiche favorisce il sonno. Entrambi i ricercatori hanno proposto, e anzi hanno dimostrato, che le sostanze Hypnogenic o &#39;hypnotoxins &quot;erano presenti nel liquido cerebrospinale (CSF) di cani privati ​​del sonno. 8 Nel corso dell&#39;ultimo secolo diverse altre sostanze Hypnogenic presunti implicati nel processo omeostatico sonno sono stati identificati (per la revisione, vedi rif. 9), tra cui prostaglandine (PG) D 2, 10 citochine, 11 adenosina, 12 anandamide, 13 e il peptide urotensina II. 14 Il lavoro sperimentale per Economo 15, 16, Moruzzi e Magoun 17, e altri nei risultati prodotti primi e la metà del 20 ° secolo che ha ispirato le teorie basate su circuiti di sonno e veglia e, in una certa misura, messo in ombra la teoria umorale allora prevalente di dormire. Ad oggi, diversi &quot;modelli circuitali&quot; sono stati proposti, reciprocamente informati dai dati di varia qualità e quantità (per la revisione, vedi rif. 18). Un modello, Ad esempio, propone che sonno lento è generato attraverso l&#39;inibizione adenosina-mediata del rilascio di acetilcolina dai neuroni colinergici del proencefalo basale, un&#39;area prevalentemente costituiti al nucleo dell&#39;arto orizzontale della banda diagonale di Broca e inominata substantia. 19 Un altro modello popolare di regolazione del sonno / veglia descrive un meccanismo interruttore flip-flop sulla base delle interazioni reciprocamente inibitorie tra neuroni soporifera nella zona preottica ventrolaterale e neuroni-veglia indurre nel tronco ipotalamo e cerebrale. 18, 20, 21 Inoltre, per la commutazione in e fuori di sonno REM, una simile interazione reciprocamente inibitorio è stato proposto per aree del tronco cerebrale, che è la grigia ventrale periacqueduttale, laterale pontine tegmento, e il nucleo sublaterodorsal. 22 Collettivamente, questi modelli hanno dimostrato prezioso euristiche e conferiti importanti quadri interpretativi per gli studi di ricerca sul sonno; tuttavia, un voit più completa comprensione dei meccanismi molecolari e circuiti che regolano il ciclo sonno-veglia richiederà una più completa conoscenza dei suoi componenti. Il sistema di registrazione poligrafica descritto di seguito dovrebbe aiutare in questo obiettivo.

<table><tbody><tr><td>Connettore a 4 pin</td><td>Hirose</td><td>A3B-4PA-2DSA(71)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Meiji Seika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Convertitore analogico/digitale</td><td>Contec</td><td>AD16-16U(PCIEV)</td><td></td></tr><tr><td>Caffeina</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina in metallo duro</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td></td></tr><tr><td>Alloggiamento a crimpare</td><td>Hirose</td><td>DF11-4DS-2C</td><td></td></tr><tr><td>Presa a crimpare</td><td>Hirose</td><td>DF11-30SC</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale (Toughron Rebase)</td><td>Miki Chemical Product</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adesivo epossidico</td><td>Konishi</td><td>#16351</td><td></td></tr><tr><td>Connettore FFC/FPC</td><td>Honda Tsushin Kogyo</td><td>FFC-10BMEP1(B)</td><td></td></tr><tr><td>Cavo piatto</td><td>Hitachi Cable</td><td>20528-ST LF</td><td></td></tr><tr><td>Colla istantanea (Aron Alpha A)</td><td>Toagosei</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore di segnale</td><td>Biotex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione del sonno</td><td>APL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software SleepSign</td><td>Kissei Comtec</td><td>N/A</td><td>per registrazione/analisi</td></tr> <tr><td>EEG/EMGCollettore rotante</td><td>Biotex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vite in acciaio inox</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&phi; 1.0 e tempi; 2.0</td></tr><tr><td>Filo di acciaio inossidabile</td><td>Filo Cooner</td><td>AS633</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura di registrazione poligrafica per la misurazione del sonno nei topi

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

La registrazione dell'elettroencefalogramma epidurale (EEG) e dell'elettromiogramma (EMG) in piccoli animali, come topi e ratti, è stata fondamentale per studiare l'omeodinamica e i circuiti della regolazione sonno-veglia. In molti laboratori, un sistema di registrazione del sonno basato su cavi viene utilizzato per monitorare l'EEG e l'EMG in topi che si comportano liberamente in combinazione con un software per computer per il punteggio automatico degli stati di vigilanza sulla base dell'analisi dello spettro di potenza dei dati EEG. Una descrizione di questo sistema è dettagliata qui. Le viti in acciaio vengono impiantate sull'area corticale frontale e sull'area parietale di 1 emisfero per il monitoraggio dei segnali EEG. Inoltre, l'attività EMG è monitorata dal posizionamento bilaterale di fili in entrambi i muscoli del collo. Movimenti oculari non rapidi (Non-REM; Il sonno NREM) è caratterizzato da onde cerebrali grandi e lente con attività delta inferiore a 4 Hz nell'EEG, mentre un passaggio da un'attività delta a bassa frequenza a un rapido EEG a bassa tensione nell'intervallo theta tra 6 e 10 Hz può essere osservato nella transizione dal sonno NREM al sonno REM. Al contrario, la veglia è identificata da onde cerebrali a bassa o moderata tensione nel tracciato EEG e da un'attività EMG significativa.

Figura 1B mostra come esempio un mouse EEG nei diversi stati di vigilanza. Come indicato nella tabella 1, sono classificati come epoche sonno REM se l&#39;EEG mostra grandi, onde cerebrali lente con un ritmo delta è inferiore a 4 Hz e l&#39;EMG ha solo un segnale debole o assente. Epoche sono classificati come sonno REM se l&#39;EEG mostra onde cerebrali bassa tensione rapide nell&#39;intervallo theta tra 6 e 10 Hz e l&#39;EMG mostra bas...

La registrazione dell'elettroencefalogramma (EEG) e dell'elettromiogramma (EMG) nei topi che si comportano liberamente è un passo fondamentale per correlare il comportamento e la fisiologia con il sonno e la veglia. Il protocollo sperimentale qui descritto fornisce un sistema basato su cavo per l'acquisizione di registrazioni EEG ed EMG nei topi.

Procedura di registrazione poligrafica per la misurazione del sonno nei topi

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

L'obiettivo generale di questa procedura di registrazione poligrafica è determinare lo stato di vigilanza dei topi e misurare il tempo trascorso in veglia, sonno con movimenti oculari rapidi o sonno con movimenti oculari non rapidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in quasi tutti i campi delle neuroscienze che cercano di correlare il comportamento e la fisiologia con l'attività dei neuroni corticali negli animali che si comportano. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può registrare molti nodi, elettroencefalogramma ed elettromiogramma e può essere combinata con altri impianti cerebrali come fibre ottiche e cannule per infusione.La dimostrazione visiva di questo metodo è molto importante perché l'impianto dell'elettrodo deve essere eseguito correttamente e la qualità dell'elettrodo è estremamente critica per giudicare gli stati fisici. A dimostrare la procedura sarà Yohko Takata, un postdoc del mio laboratorio. Prima di iniziare, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore a microsfere caldo.Una volta che il topo è confermato come anestetizzato da un pizzico di dita, radere i peli sulla testa e sul collo. Quindi, fissa la casetta al telaio stereotassico e fissa la testa tra le due barre auricolari. Quindi, applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza.Procedere con la detersione della pelle rasata con scrub a base di alcool e iodio. Quindi, taglia lungo la linea mediana con un bisturi per esporre il cranio e fissa la pelle di lato usando delle clip per mantenere aperta l'area chirurgica. Utilizzando una fresa in metallo duro con un trapano da 0,8 millimetri, praticare due fori.Metti un foro sopra l'area corticale frontale. Metti il secondo foro sopra l'area parietale dell'emisfero destro. Quindi, utilizzando un cacciavite da gioielliere, avvitare le viti di registrazione EEG in acciaio inossidabile nei fori.Inserire le viti con soli due o due giri e mezzo per ottenere il posizionamento epidurale sopra la corteccia. Le viti non devono oscillare una volta inserite. Questo è molto importante.Ora, fissa il gruppo elettrodo con i perni verso l'alto al cranio. Gli elettrodi devono essere fissati in modo diretto. Utilizzare un batuffolo di cotone per fissare la posizione dell'elettrodo e incollare l'elettrodo con cianoacrilato seguito da cemento dentale.Quindi, praticare piccoli fori nel trapezio e inserire l'elettrodo EMG in quei fori. Quindi, sutura la pelle con filo di seta di 0,1 millimetri di diametro. Ora, rimuovi il mouse dalla cornice stereotassica e posizionalo su un pad termico.Somministrare al topo iniezioni intraperitoneali di ampicillina e meloxicam e monitorare il topo fino a quando non riacquista la decubito sternale. Quindi, ospita il topo da solo. Una settimana dopo l'impianto degli elettrodi, trasferire il topo in una gabbia sperimentale in una camera di registrazione insonorizzata.Fissare il gruppo elettrodo EEG/EMG del mouse a un cavo di registrazione collegato a un collettore rotante. Collegare il cavo del convertitore AD a un amplificatore del filtro di segnale EEG/EMG collegato al collettore rotante. Utilizza un convertitore AD per convertire il segnale in un segnale digitale a 128 hertz e, infine, registra il segnale su un computer.Abituare il mouse per due o tre giorni nella camera di registrazione. Se la registrazione EEG/EMG include le somministrazioni di farmaci, maneggiare delicatamente il topo ogni giorno come quelli in cui è stata somministrata una somministrazione di farmaco. Successivamente, avviare il software di registrazione EEG/EMG.Per iniziare, fai clic sulla scheda Informazioni sul file di dati e fai clic sulla casella accanto al nome del file. Inserisci un nome per il file e fai clic su Salva. Quindi, dalla scheda Condizione di registrazione, selezionare tutti i canali EEG/EMG che devono essere registrati.Inoltre, seleziona la Frequenza di campionamento in questa scheda. Ora, nella scheda Informazioni sul canale, controlla se i canali selezionati vengono visualizzati correttamente. Una volta confermato, avvia la registrazione selezionando prima la scheda Impostazioni timer.Quindi, fare clic su monitor per visualizzare EEG ed EMG. Se i segnali vengono visualizzati correttamente, impostare l'ora dell'orologio per l'inizio e la fine della registrazione nell'area Timer principale. Quindi, fare clic sul pulsante Monitor per avviare la registrazione.Ora, registra i segnali in condizioni di base e in diverse condizioni di trattamento per diversi giorni. Al termine dell'esperimento, sopprimere il topo con pentobarbital. Avviare il software per l'analisi EEG/EMG.Aprire i dati grezzi EEG/EMG, che sono un file KCD. Fare clic sulla scheda Sospensione e impostare l'ora Epoch su 10 secondi. Quindi, selezionare Screening multiplo per assegnare automaticamente un punteggio a tutte le epoche di dieci secondi in tre fasi sulla base delle ampiezze dell'EEG e dell'EMG e in base all'analisi spettrale di potenza dell'EEG.Quindi, fare clic sulla condizione FFT per la scheda EEG. Lì, imposta i parametri per l'analisi spettrale di potenza. Utilizzare 256 punti di riferimento corrispondenti a ogni due secondi di EEG, utilizzare la funzione della finestra di Hamming e utilizzare una media di cinque spettri per epoca.Quindi fare clic su Ok.Ora, fare clic su Avvia screening per iniziare lo screening automatico. Quindi, aprire i dati memorizzati, che vengono salvati in un formato di file RAF e controllare i risultati dello screening automatico. Se necessario, correggere i risultati se non soddisfano i criteri standard.Per apportare una correzione, fare clic e tenere premuto il pulsante sinistro del mouse su un'epoca con punteggio errato e trascinare il cursore sulla stringa di epoche con punteggio errato. Rilasciare il pulsante sinistro del mouse e selezionare lo stato di comportamento corretto nella finestra popup. In condizioni di base, i topi hanno mostrato un chiaro ritmo circadiano sonno-veglia coerente con la loro natura notturna.Durante il periodo di luce di 12 ore, i topi hanno avuto una media di 6,7 ore di sonno NREM e 0,9 ore di sonno REM. Mentre, durante il loro periodo di buio di 12 ore, la veglia era predominante. Sono state registrate anche altre misurazioni.Questi includevano la distribuzione dell'epoca del sonno, la loro durata media e le transizioni di stadio per ogni stato di vigilanza. Gli spettri di potenza EEG per il sonno NREM e REM mostrano una forte densità di potenza EEG nell'intervallo di frequenza da 0,5 a quattro hertz per il sonno NREM rispetto a una densità di potenza da sei a 10 hertz per il sonno REM. Per valutare l'impatto della caffeina sul sonno, i topi C57 black 6 sono stati trattati con un veicolo un giorno e con caffeina il giorno successivo.Le iniezioni intraperitoneali di caffeina sono state somministrate all'inizio del ciclo di luce. Come previsto, la registrazione ha rivelato che la caffeina ha aumentato la quantità di veglia nei topi. Un aumento di tre volte della veglia si è verificato per tre ore dopo l'iniezione.Una volta padroneggiata, la procedura di impianto dell'elettrodo può essere eseguita in meno di 20 minuti. Il punteggio e la correzione dei dati EEG per un periodo di 24 ore possono essere eseguiti in circa 30 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare la registrazione dell'elettroencefalogramma e dell'elettromiogramma nei topi e come valutare se e per quanto tempo un animale è sveglio o addormentato.

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Fonte: Kodani, S., et.al. Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali coinvolti nella transizione dal sonno alla veglia nei topi. La procedura prevede l'impianto chirurgico di una fibra ottica ed elettrodi nel cervello e nei muscoli per consentire la stimolazione luminosa e la registrazione elettrofisiologica. Fornendo luce per attivare i...

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali per la transizione dal sonno alla veglia nei topi

Questo video mostra un protocollo per l'impianto di un elettroencefalogramma (EEG) e di un elettromiogramma (EMG) in un topo anestetizzato. Il processo prevede il fissaggio del topo su un telaio stereotassico, l'esecuzione di un'incisione della linea mediana nel cranio, la perforazione di fori per gli elettrodi e il fissaggio dell'unità elettrodo per la registrazione del segnale. Dopo il recupero, il comportamento sonno-veglia del topo viene analizzato utilizzando i segnali registrati.

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