Avvio di differenziazione in cellule multipotenti immortalizzate Otic progenitrici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di differenziare le cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate in tipi di cellule dell'orecchio interno. Quindi questo metodo può aiutarci ad affrontare domande chiave nella rigenerazione uditiva, come ad esempio come i progenitori otici possono diventare cellule ciliate cocleari o neuroni uditivi. È importante sottolineare che questa tecnica fornisce un sistema cellulare in vitro che può essere utilizzato in parallelo con sistemi modello di mammiferi animali in vivo.

A dimostrare la procedura oggi saranno Azadeh Jadali, una borsista post-dottorato nel mio laboratorio, così come Zhichao Song e Alejandra Laureano, due studenti laureati nel laboratorio. Dopo aver preparato il terreno di coltura come descritto nel protocollo di testo, utilizzare tre millilitri di questo liquido per piastrare, da dieci a sesto, il progenitore multipotente immortalizzato, o cellule IMOP, in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri. Incubare le cellule per cinque-sette giorni a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica.

A giorni alterni, raddoppia il volume del liquido nella coltura aggiungendo terreno fresco. Per far passare le cellule, trasferirle prima dal piatto di coltura a una provetta conica da 15 millilitri. E poi posiziona il tubo, a 37 gradi Celsius, per cinque-dieci minuti.

Durante questo periodo, aspettatevi che le otosfere formanti colonie si raccolgano sul fondo del cono attraverso la sedimentazione per gravità. Successivamente, aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare la tavolozza. Risospendere le otosfere aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione salina bilanciata con EDTA (HBSS) preriscaldata e preriscaldata precedentemente preparata, quindi pipettando su e giù due o tre volte.

Per facilitare la dissociazione delle otosfere in singole cellule, posizionare la conica in un incubatore a 37 gradi Celsius. Agitare periodicamente la soluzione e quando non si osservano otosfere come sedimenti sul fondo del tubo, spostarla a temperatura ambiente. Procedere con l'aggiunta di due millilitri di terreno di coltura alle cellule per neutralizzare l'EDTA.

E centrifugateli a temperatura ambiente per cinque minuti a 200 g. Quindi aspirare la soluzione di EDTA diluita e lavare le cellule in cinque millilitri di 1x PBS. Dopo aver fatto girare le celle utilizzando le stesse impostazioni, aspirare il PBS 1x.

Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura alla conica. E risospendere la tavolozza delle celle. Per il conteggio, diluire le cellule IMOP da una a cento in terreno di coltura.

Quindi aggiungere 75 microlitri di questa soluzione in una cassetta posizionata in un contatore di particelle microfluidiche e determinare il numero di cellule. Successivamente, piastrate una volta dieci o le sesta cellule IMOP in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri come descritto in precedenza e ripetete questa procedura di passaggio ogni cinque-sette giorni. Tre giorni dopo la placcatura, utilizzare la sedimentazione per gravità per raccogliere le otosfere come mostrato in precedenza.

Procedere all'aspirazione del surnatante. E risospendere delicatamente le cellule in due millilitri di terreno di differenziazione epiteliale sensoriale. Quindi utilizzare una pipetta a pori larghi da dieci millilitri per trasferire le otosfere in un nuovo piatto da 60 millimetri.

Differenziare le otosfere per dieci giorni. Aggiunta di due millilitri di terreno di differenziazione fresco alla coltura a giorni alterni. Successivamente, raccogli nuovamente le otosfere attraverso la sedimentazione per gravità.

E aspirare il mezzo esaurito. Quindi, fissare le otosfere in paraformaldeide al quattro percento in 1x PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare le cellule in 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton x100.

Procedere bloccando le otosfere in 1x PBS integrato con il dieci percento di siero di capra e lo 0,1 percento di Triton x100. Dopo un'ora, sostituire il tampone bloccante con quello contenente l'appropriata diluizione dell'anticorpo Cdkn1b o CDH1. Quindi incubare le cellule in anticorpi primari durante la notte a quattro gradi Celsius.

E il giorno successivo continuare l'immunocolorazione utilizzando anticorpi secondari marcati in fluorescenza, falloidina e Hoechst, come descritto altrove. Per prepararsi all'imaging, posizionare il mezzo di montaggio su un vetrino. E poi introdurre le otosfere colorate nel mezzo.

Quindi, stendere un vetrino coprioggetti sopra il campione. Dopo aver lasciato asciugare il mezzo di montaggio per una notte a quattro gradi Celsius, posizionare il vetrino sul tavolino di un microscopio invertito dotato di una telecamera CCD a 16 bit. Utilizzando l'obiettivo ad aria 20x 0,75, è possibile acquisire immagini di epifluorescenza raccogliendo dati dai canali blu, verde, rosso e infrarosso.

Innanzitutto, pulire i vetrini rotondi di vetro mettendoli in una piastra sterile da 100 millimetri e immergendoli in etanolo al 70%. Agitare delicatamente i vetrini coprioggetti per assicurarsi che siano coperti e lasciare il piatto a temperatura ambiente per dieci minuti. Successivamente, sciacquare i vetrini coprioggetto tre volte in 1x PBS sterile e poi una volta con acqua sterile.

Quindi lasciare asciugare i vetrini di copertura esponendoli alla luce UV in una cappa di coltura tissutale per 15 minuti. Per un uso immediato, posizionare un vetrino di copertura sterile in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. E scuotere delicatamente la piastra per assicurarsi che tutti i vetrini coprioggetto siano piatti.

Quindi rivestire i vetrini di copertura aggiungendo 0,25 millilitri di 1x PBS contenente 10 microgami per millilitro di poli-D lisina a ciascun pozzetto. Dopo che la piastra è stata incubata per un'ora a 37 gradi Celsius, rimuovere la soluzione di poli-D lisina e lavare i pozzetti tre volte con 1x PBS sterile. Una volta aspirato il liquido dell'ultimo lavaggio, introdurre 0,25 millilitri di 1x PBS contenente 10 microgrammi per millilitro di Laminina, in ciascuno dei 24 pozzetti.

Dopo aver incubato la piastra per una notte a 37 gradi Celsius, aspirare la soluzione di Laminina, quindi lavare ogni pozzetto con un millilitro di 1x PBS tre volte, ma lasciare il PBS dell'ultimo lavaggio nei pozzetti fino a quando le cellule non sono pronte per essere piastrate. Per iniziare la differenziazione neuronale, contare le cellule dalle otosfere dissociate come descritto in precedenza. E poi risospenderli in un mezzo di differenziazione neuronale preriscaldato.

Procedere seminando tra uno e un punto cinque volte dieci alla quinta cella IMOP in ciascun pozzetto della piastra contenente i vetrini di copertura rivestiti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, con il cinque percento di anidride carbonica. Sostituzione del mezzo di differenziazione neuronale a giorni alterni.

Dopo sette giorni, aspirare il terreno e fissare le cellule, che dovrebbero essere attaccate ai vetrini coprioggetti, aggiungendo il quattro percento di formaldeide in ciascun pozzetto. E lasciandoli per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la formaldeide e lavare le cellule una volta in 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton x100.

Quindi rimuovere il tampone di lavaggio. E aggiungi un tampone bloccante composto da 1x PBS contenente il dieci percento di siero di capra normale e lo 0,1 percento di Triton x100 a ciascun pozzetto. Lasciare le celle per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il liquido e sostituirlo con un tampone bloccante contenente l'appropriata diluizione dell'anticorpo Cdkn1b o Tubb3. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, lavare le cellule una volta con 1x PBS contenente l'uno per cento di Triton x100. E poi procedere con l'immunocolorazione come descritto in precedenza.

Dopo che la colorazione è stata completata, eseguire un lavaggio finale aggiungendo 1x PBS ai pozzetti. Per prepararli per l'analisi, rimuovere i vetrini di copertura a cui sono attaccate le cellule colorate dalla piastra a 24 pozzetti. E posizionarli su un supporto di montaggio su un vetrino.

Dopo aver lasciato asciugare il mezzo di montaggio per una notte a quattro gradi Celsius, acquisire immagini di epifluorescenza come descritto in precedenza. Le otosfere coltivate per dieci giorni in terreno di differenziazione epiteliale dimostrano un aumento dell'espressione di Cdkn1b, un inibitore della chinasi ciclico-dipendente e marcatore per il differenziamento dell'orecchio interno, rispetto alle cellule indifferenziate. Qui la colorazione di Hoechst ha notato nuclei cellulari.

Queste cellule mostrano anche cambiamenti morfologici nei filamenti di actina e nelle regioni di adesione cellula-cellula caratteristiche degli epiteli. Indicato dalla comparsa di falloidina e marcatura Cdh1 alle periferie cellulari. Le otosfere possono anche essere dirette a formare neuroni.

Questa immagine in campo chiaro mostra che dopo sette giorni nel mezzo di differenziazione neuronale, le cellule IMOP mostrano neuriti. L'immunocolorazione di queste cellule con un marcatore neuronale Tubb3 conferma la loro differenziazione. Ed esprimono anche in modo robusto Cdkn1b.

Ciò suggerisce che il doppio segnale Tubb3, Cdkn1b può essere utilizzato come indicatore della differenziazione neuronale nelle cellule IMOP. Anche le cellule differenziate e indifferenziate a fluorescenza di Cdkn1b sono state normalizzate determinando il suo rapporto con il segnale di Hoechst, fornendo risultati quantitativi. Gli istogrammi di questi dati sono mostrati qui.

In questi grafici sono presentate le percentuali di cellule IMOP indifferenziate e differenziate al di sopra di una soglia predeterminata di Cdkn1b normalizzato. Entrambe le popolazioni differenziate dimostrano un aumento significativo della percentuale di cellule che esprimono Cdkn1b rispetto ai controlli indifferenziati, confermando la differenziazione suggerita dall'immunofluorescenza. Una volta padroneggiata, la coltura di routine e la differenziazione delle cellule IMOP possono essere eseguite in 30 minuti, se eseguite correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare la differenziazione delle cellule IMOP. Grazie per aver guardato questo video. E buona fortuna con i tuoi esperimenti.