Name: Avvio di differenziazione in cellule multipotenti immortalizzate Otic progenitrici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Impara a differenziare cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate (iMOP) in tipi cellulari dell'orecchio interno. Questo metodo in vitro consente di studiare la rigenerazione uditiva e lo sviluppo di cellule ciliate cocleari e neuroni uditivi.

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Il lavoro è stato sostenuto in parte dal Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), dal Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) e dal Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

1. Mantenere auto-rinnovamento nelle celle IMOP <ol><li> Preparare IMOP cultura dei media: DMEM / F12, 1X B27 supplemento, 25 mg / ml carbenecillin e 20 ng / ml bFGF. Fai 50 ml di IMOP coltura utilizzando reagenti sterili. Warm up 49 ml di DMEM / F12 in una conica da 50 ml in un bagno d&#39;acqua a 37 °. <ol><li> Disgelo 50X B27 supplemento e 100 mg / ml carbenecillin aliquote sterilizzate per filtrazione, per 5 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Scongelare 100 mg / ml bFGF aliquota a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml 50X B27, 10 pl di 100 ug / ml bFGF e 12,5 ml di 100 mg / ml in DMEM carbenecillin / F12. </li></ol></li><li> Utilizzare 3 ml di media in un piatto di coltura di tessuti 60 mm per le cellule di coltura IMOP. Aggiungere mezzi freschi a culture ogni altro giorno raddoppiando il volume del supporto. Assicurarsi che la concentrazione di bFGF non scenda sotto i 5 ng / ml. <ol><li> Cultura cellule IMOP a 37 ° C con 5% di CO 2. Le cellule Passage dopo 5 - 7 giorni in coltura elencati nella procedura riportata di seguito. Cultura Trasferire in un 15ml conica utilizzando un puntale 10 ml. </li></ol></li><li> Rendere EDTA 1 mM in HBSS diluendo 0,1 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml di HBSS. Preriscaldare 1 mM EDTA fatto in HBSS in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Celle di raccolta di sedimentazione per gravità o centrifugazione a 200 xg per 5 min. a RT. Per gravità sedimentazione, posizionare la conica 15 ml contenente le culture del C incubatore 37 ° per 5-10 minuti. Dopo tale tempo, osservare le otospheres raccolgono sul fondo del cono 15 ml. NOTA: la forza centrifuga eccessiva può causare danni alle cellule. </li><li> Attentamente aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta senza disturbare il pellet. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di pre-riscaldato 1 mM EDTA HBSS alla cella pellet. Usando una pipetta P1000, delicatamente pipettare su e giù 2 - 3 volte. Posizionare conica a 37 ° C e incubare per &lt;5 min a facilitare la dissociazione in cellule singole. </li><li> Agitare delicatamente la soluzione di cellule per determinare se otospheres sono dissociate. Se no otosfere sedimentare sul fondo del cono, le cellule sono dissociate. Il tempo di incubazione può variare. NOTA: prolungata incubazione con EDTA provoca la morte delle cellule eccessivo. </li><li> Rimuovere le cellule da 37 ° C, aggiungere 2 ml di mezzi per neutralizzare e diluire l&#39;EDTA. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare diluito EDTA utilizzando un 2 ml aspirazione pipetta e aggiungere 5 ml di PBS 1X per lavare le cellule. </li><li> Spin giù le cellule a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare fuori 1X PBS usando una pipetta 2 ml aspirazione. Risospendere le cellule utilizzando una pipetta P1000 in 0,5 ml di IMOP cultura mediatica pipettando gentilmente su e giù 2 - 3 volte. </li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore di particelle microfluidica con le cassette appropriate 28. Un piatto confluenti di cellule IMOP conterrà ~ 6 X10 6 celle. Diluire le cellule 1: 100 in media e aggiungere 75 ul di soluzione di cellule nel cassetto per il conteggio. Piastra 1 x 10 6 cellule in un piatto di 6 cm di IMOP culture dei media (~ 1: 10 diluizione). IMOPs Passage ogni 5 - 7 giorni. NOTA: Le cellule che formano grandi otospheres o si attaccano al fondo del piatto di coltura tissutale saranno differenziare. Le cellule saranno anche morire se le culture sono sopra confluenti. </li></ol> 2. gelo e disgelo Celle IMOP <ol><li> Preparare medio di congelamento scongelamento e sintetico, per equilibrare la soluzione a 4 ° C prima di cellule congelamento. </li><li> Raccogliere le cellule da un cm piatto di cellule IMOP confluenti 6. Utilizzare una pipetta da 10 ml e cellule di trasferimento (~ 6 - 8 x 10 6 celle) in una conica da 15 ml. </li><li> Celle di raccolta di sedimentazione per gravità o centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Se i otospheres sono piccole, le cellule non si depositano per gravità sedimentazione. Opzionale: Contare le cellule utilizzando passo 1.9 per determinare il numero di cellule totali. </li><li> Aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2ml aspirazione pipetta lasciando il pellet sciolto dietro. </li><li> Aggiungere 0,25 ml di media congelamento sintetici di riattivare cells ad una densità di 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 cellule / ml. Pipettare delicatamente le cellule con una pipetta P1000. Trasferire la sospensione cellulare di fiale criogeniche con una pipetta P1000 con 1 ml di filtrati punta. </li><li> Porre le fiale in un contenitore di congelamento senza alcool e posizionare il contenitore di congelamento a -80 ° C per ridurre la temperatura di 1 ° C al minuto fino a quando la temperatura raggiunge i -80 ° C. </li><li> Per la conservazione a lungo termine delle cellule, trasferire i flaconi alla fase vapore di un serbatoio di stoccaggio azoto liquido. Per scongelare le cellule per la cultura, equilibrare fiala criogenico contenente cellule congelate a -80 ° C. </li><li> Terreni di coltura IMOP Pre-caldo in un bagno di 37 ° C Acque. </li><li> Scongelare il flacone congelato rapidamente agitando il fondo della provetta in un bagno di acqua 37 ° C. Aggiungere 1 ml di terreni di coltura pre-riscaldato IMOP alle cellule scongelate una volta che il cristallo glaciale scompare. Trasferire le cellule in un ml conica 15 e aggiungere un ulteriore 4 ml di IMOP cultura mediatica </li><li> Gira la 15 ml conico per 5 min. a 200 xg e aspirare i media spesi. Risospendere le cellule in 2 ml di terreni di coltura e le cellule IMOP piastra in un piatto 6 cm. Incubare culture a 37 ° C con 5% di CO 2 per l&#39;espansione. </li></ol> 3. differenziazione delle cellule IMOP in epiteli sensoriali <ol><li> Preparare 50 ml di IMOP supporti differenziazione epiteli sensoriali: DMEM / F12, 1X B27 supplemento, 25 mcg / ml carbenecillin. Fai 50 ml di IMOP supporti differenziazione epiteli sensoriali. Warm up 49 ml di DMEM / F12 in una conica da 50 ml in un bagno d&#39;acqua a 37 °. Supplemento B27 disgelo 50X e 100 mg / ml carbenecillin aliquote per 5 min. in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Aggiungere 1 ml 50X B27 e 12,5 ml di 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12. </li><li> Per raccogliere, dissociarsi, risospendere e contare le cellule ripetere i passaggi 1,4-1,9 </li><li> Piastra 1 x 10 6 cellule in una capsula di 6 cm in Giorno -3 utilizzando IMOP coltura. Il giorno 0, culture di trasferimento con una pipetta 10 ml in una conica da 15 ml. Raccogliere il otosfere di gravità sedimentazione a quanto dichiarato nella fase 1.6. Aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i otospheres sul fondo del cono. </li><li> Aggiungere delicatamente in 2 ml di mezzi differenziazione sensoriale epiteli. Trasferimento otospheres a un piatto 6 centimetri con un grande foro da 10 ml pipetta. NOTA: tosatura meccanica da duro pipettaggio può dissociarsi cellule dagli otospheres. </li><li> Aggiungere 2 ml di fresco supporti differenziazione epiteliale sensoriale culture ogni altro giorno. Se necessario, le cellule possono essere raccolte mediante sedimentazione gravità e supporti sostituito. </li><li> Raccogliere otospheres al giorno 10 con il trasferimento ad un ml conica 15 e permettendo ai otospheres di sedimentare, come indicato al punto 1.6.Aspirate media spesi utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i otospheres indisturbati. </li><li> Fissare otospheres incubando a 4% formaldeide in PBS 1X per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione di formaldeide, lavare otospheres con tampone di lavaggio (1X PBS contenente 0,1% TritonX-100) prima incubazione in tampone di bloccaggio (1X PBS contenente 10% siero di capra normale e 0,1% Triton X-100) per 1 ora. <ol><li> Sostituire buffer e incubare i campioni in tampone di bloccaggio con l&#39;anticorpo diluito. Incubare a 4 ° C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente 0,1% Triton X-100 soggetti la otosphere dell&#39;immunocolorazione 27. Trasferire otospheres in PBS 1X e luogo otospheres in mezzo di montaggio su un vetrino con una pipetta P1000. Mettere un vetrino sul campione e permettono mezzi di montaggio a secco a 4 ° C. </li></ol></li><li> Acquisire immagini epifluorescenza utilizzando una configurazione microscopio rovesciato dotato di una fotocamera CCD a 16 bit e di un aereo o di un 20X 0,75 NA obiettivo 40X 1.3 immersione in olio. Raccogliere la fluorescenza da diversi canali di colore utilizzando la elencati (di eccitazione e di emissione) le lunghezze d&#39;onda: blu (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rosso (562 ± 20 nm / e 625 20nm ±) e infrarossi (628 ± 20 nm / e 692 ± 20nm). </li></ol> 4. Saggio EdU Costituzione <ol><li> Il giorno -3, piastra 1 x 10 6 cellule IMOP in un piatto di 6 centimetri. Tre giorni dopo il giorno 0, vendemmia, dissociarsi, risospendere e contare le cellule ripetendo i passi 1.4-1.9. </li><li> Piatto 2,5 x 10 5 cellule in mezzi di coltura IMOP e 5 x10 5 cellule in sensoriale mezzi differenziazione epiteli in diversi pozzetti di un piatto 6 bene. </li><li> Determinare la percentuale di cellule in fase S di Edu incorporazione il giorno 3 utilizzando un saggio di incorporazione EdU <ol><li> Aggiungere EdU magazzino direttamente alle culture IMOP per ottenere una concentrazione finale di 1 micron EdU nei mezzi di coltura. </li><li> Incubare EdU nelle culture IMOP per 2 ore e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Harvest, dissociare e raccogliere le cellule ripetere i punti 1.4-1.9. Aggiungere a 4% formaldeide in PBS 1X per 15 min. a RT per riparare le cellule. Celle di raccolta per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di formaldeide e properly smaltire. </li><li> Etichetta nuclei di cellule con la Hoechst e incorporati EdU con verde fluorescente dye-azide secondo il protocollo del produttore. NOTA: Tutti i lavaggi sono fatti con PBS 1X, 3% BSA e lo 0,1% di cellule Tween 20. Lavare con PBS 1X due volte. </li><li> Montare le cellule su un vetrino utilizzando antifade reagenti e posizionare un bicchiere di 1,5 copertura sul campione. Acquisire le immagini fluorescenti di cellule marcate con un epifluorescenza. </li></ol></li></ol> 5. Differenziare neuroni IMOP-Derived <ol><li> Fai 50 ml di media differenziamento neuronale: Neurobasal multimediali, 1X B27 supplemento, 2 mM L-glutammina. Bottiglia disgelo di 50X B27 e 200 mm L-glutammina in 37 ° C bagnomaria per 5 min. Aggiungere 1 ml 50X B27 e 0,5 ml 200 mm L-glutammina a 48,5 ml di mezzi Neurobasal. </li><li> Cappotto coprioggetti mettendo 12 mm rotonde 1,5 vetrini in un piatto sterile, 10 centimetri e aggiungere il 70% EtOH al piatto per sterilizzare e pulire le lamelle. </li><li> Agitare delicatamente la baiarslips per assicurarsi che sono coperti in etanolo. Lasciare la piastra per 10 minuti a RT. Lavare i coprioggetti 3 volte con sterili 1X PBS per lavare l&#39;etanolo residuo. Sciacquare il vetrino una volta con H 2 0 sterili per lavare rimanente PBS 1X. </li><li> Aspirare il H 2 0 utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i coprioggetti asciutto. Esporre i coprioggetti alla luce UV nella cappa coltura tissutale per 15 min. Conservare coprioggetto in un ambiente sterile, se non utilizzato immediatamente. </li><li> Posizionare vetrino uno 12 millimetri rotonda in ogni pozzetto di un piatto 24 bene. Agitare gentilmente piastra per garantire che i coprioggetti sdraiarsi sul fondo del pozzo. </li><li> Scongelare 2 mg / ml di soluzione di lisina poli-D-at RT e diluire a 10 ug / ml concentrazione poli-D-lisina in 1X PBS. Aggiungere 0,25 ml di 10 ug / ml di poli-D-lisina ai pozzetti. Lasciare la piastra nel 37 ° C incubatore per 1 ora. </li><li> Lavare i pozzetti 3 volte con sterili 1X PBS. Thaw / ml di soluzione laminina magazzino 10 mg a temperatura ambiente e portare a 10 mg / ml in PBS 1X. Aggiungere 0,25 ml di 10 mg / ml soluzione di lavoro laminina in un singolo pozzetto di un piatto 24 multi-pozzo. Incubare la piastra a 37 ° C incubatore. Aspirare la soluzione laminina utilizzando un 2 ml aspirazione pipetta. </li><li> Lavare il coprioggetto 3 volte con PBS 1X aggiungendo in 1 ml di PBS 1X con una pipetta P1000 e rimuovendo il 1X PBS aspirando con 2 ml aspiranti pipetta. Lasciare PBS 1X da ultimo lavaggio del bene fino a quando le cellule sono pronte per essere placcato. Avviare la differenziazione neuronale per la raccolta, dissociandosi e il conteggio delle cellule nei passaggi 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 cellule in una capsula di 6 cm in Day -3. </li><li> Il giorno 0, vendemmia, dissociarsi e contare le cellule ripetendo 1,4-1,9. Seed 1 x 10 5-1,5 x 10 5 cellule IMOP in 0,5 ml di pre-riscaldato multimediali differenziamento neuronale per bene in un piatto multi-pozzo 24. Aspirare e aggiungere pre-riscaldato supporti differenziamento neuronale a culture ogni altro giorno. </li><li> Fissare neuroni IMOP derivati ​​a 4% di formaldeide per 15 min. unt RT il giorno di soluzione di formaldeide 7. Rimuovere, lavare i neuroni IMOP derivati ​​con tampone di lavaggio (1X PBS contenente 0,1% TritonX-100) prima di incubazione in tampone di bloccaggio (1X PBS contenente il 10% di siero normale di capra e lo 0,1% Triton X-100) per 1 ora. <ol><li> Sostituire buffer e incubare i campioni in tampone di bloccaggio con l&#39;anticorpo diluito. Incubare a 4 ° C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente 0,1% Triton X-100 cellule soggette a immunocolorazione 27. Lavare il coprioggetti con PBS 1X prima di mettere su un supporto di montaggio. Lasciare i supporti di montaggio a secco a 4 ° C prima di acquisire immagini epifluorescenza come indicato al punto 3.8. </li></ol></li></ol>

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<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Blanchard, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+conversion+of+fibroblasts+into+peripheral+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Monitoraggio Culture IMOP Un protocollo per mantenere auto-rinnovamento e promuovere la differenziazione di una linea cellulare IMOP romanzo è descritto e formati placcatura aggiuntivi sono inclusi (Tabella 1). Diversi passaggi critici che aiutano con l&#39;espansione di routine e la differenziazione delle cellule IMOP sono noti. Simile a colture di cellule staminali pluripotenti, le cellule IMOP teoricamente hanno una durata indefinita. Per garantire che le...

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One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
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Azadeh Jadali

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Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Gli organi dell'orecchio interno, la coclea, l'utricolo, il sacculo e tre canali semicircolari, mediano la capacità di sentire e di stare in equilibrio. All'interno della coclea, le cellule ciliate convertono i suoni in segnali elettrici che vengono trasmessi ai neuroni gangliari a spirale (SGN). Gli SGN attivano potenziali d'azione per propagare i segnali neurali attraverso il circuito uditivo. Le mutazioni genetiche, i farmaci ototossici e l'esposizione a suoni forti contribuiscono alla morte delle cellule ciliate e del SGN che provocano la perdita dell'udito1-4. Una volta perse, queste celle non vengono sostituite. L'uso di iPSC ed ESC per generare cellule ciliate nascenti o SGN è molto promettente per le terapie di sostituzione delle cellule dell'orecchio interno5-8. Una raffica di progressi ha dimostrato che le cellule staminali pluripotenti e i progenitori derivati dall'orecchio interno possono differenziarsi in cellule ciliate e SGN a vari stadi di maturità. Le cellule staminali embrionali di mammifero (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere utilizzate per generare cellule ciliate funzionali e SGN9-11. È stato anche dimostrato che le cellule staminali e le cellule progenitrici derivate dall'orecchio interno dei mammiferi formano cellule ciliate e neuroni con proprietà delle loro controparti cellulari in vivo 12-16. 
L'uso di progenitori otici derivati da iPSC o ESC per sostituire le cellule ciliate perse e gli SGN richiede una differenziazione efficiente. Una differenziazione impropria o la continua proliferazione di progenitori derivati dallo stelo innestato nell'orecchio interno possono esacerbare la funzione dell'orecchio interno e rappresentare un rischio tumorigenico come la formazione di teratomi nell'orecchio interno17. C'è una chiara necessità di sviluppare le condizioni di coltura e comprendere la differenziazione dei progenitori otici. Una strategia nello sviluppo di questi metodi è quella di ricapitolare le decisioni sul destino cellulare prese dai progenitori neurosensoriali durante lo sviluppo dell'orecchio interno. I protocolli che prevengono la proliferazione e dirigono i progenitori otici nelle cellule ciliate o SGN contribuiranno a migliorare la sicurezza e l'efficacia delle terapie sostitutive. 
Durante lo sviluppo, l'orecchio interno inizia con l'ispessimento dell'ectoderma superficiale in una regione ristretta tra i rombomeri 5 e 6 per diventare il placode otico. Quando il placode otico si invagina per formare una coppa otica, un insieme di cellule nella regione anteriore della coppa otica dà origine al dominio neurale-sensoriale-competente (NSD), che contiene i precursori delle cellule ciliate e dei neuroni dell'orecchio interno18. Studi di mappatura del destino su topi, polli e pesci zebra che sviluppano l'orecchio interno suggeriscono popolazioni multiple di progenitori neurosensoriali che danno origine alle cellule ciliate sensoriali, che circondano le cellule di supporto e i neuroni otici19-22. Il fattore di trascrizione del gruppo ad alta mobilità, Sox2, è stato implicato nella specificazione delle cellule sensoriali e utilizzato come marcatore per i progenitori dell'orecchio interno23,24. Le mutazioni ipomorfiche che diminuiscono i livelli di espressione di Sox2 nell'orecchio interno provocano la perdita delle cellule ciliate, delle cellule di supporto e degli SGN nella coclea25,26. 
Per studiare le cellule progenitrici otiche sottoposte a decisioni sul destino cellulare, è stata precedentemente stabilita una linea cellulare di progenitori otici multipotenti immortalizzati (iMOP) con restrizione del destino da progenitori cocleari che esprimono Sox2. Le cellule iMOP sono state originariamente derivate dalla coclea embrionale E12.5-13.5 e infettate con un retrovirus c-Myc27. Le cellule iMOP possono proliferare continuamente come cellule formanti colonie note come otosfere e hanno la capacità di differenziarsi in cellule ciliate, cellule di supporto e SGN27. La comprensione della capacità delle cellule iMOP di differenziarsi in linee otiche distinte consente l'applicazione di questi risultati per generare in modo efficiente cellule ciliate derivate da iPSC o ESC e SGN. Protocolli di differenziazione efficienti apriranno nuove strade per le terapie di sostituzione cellulare delle malattie dell'orecchio interno che sono recalcitranti ai trattamenti convenzionali. Una questione cruciale nella generazione di cellule otiche mediante coltura cellulare in vitro è quella di avere marcatori di differenziazione che aiutino a determinare se le cellule sono in fase di differenziazione. Cdkn1b (p27KIP) è stato ampiamente utilizzato come marcatore precoce per il differenziamento nello sviluppo dell'orecchio interno, tuttavia, l'espressione di Cdkn1b nelle cellule iMOP e il modo in cui è correlato al differenziamento non sono stati affrontati. In questo studio, vengono descritte le attuali condizioni di coltura e il modo in cui l'espressione di Cdkn1b è correlata ad altri marcatori di differenziazione di iMOP.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX Contenitori per il congelamento delle cellule senza alcool</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche (2 ml)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti in vetro spessore 1,5 (rotondo 12 mm)</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27 (50X) Senza siero</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Conservato come aliquote da 1 ml</td></tr><tr><td>di L-glutammina (200 mM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Conservato come aliquote da 5 ml</td></tr><tr><td>Laminin di topo naturale</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Conservato come aliquote da 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze Mezzi di crioconservazione</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>Conservato come 10 mg/ml 100 &; l aliquote Moxi</td></tr><tr><td>Z Mini contatore di celle automatizzato</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta Moxi Z Tipo S</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti murini ricombinanti, basico (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>Risospeso in 0,1% BSA in H20 e conservato come aliquote da 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>Risospeso in 1X PBS e conservato come 10 mg/ml 100 &; l aliquote</td></tr><tr><td>Carbenicillina, sale disodico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>Risospeso in 10 mM Hepes pH 7,4 e conservato come aliquote da 100 mg/ml</td></tr><tr><td>pipetta in brossura da 5 ml in brossura (200/astuccio)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 10 ml in brossura confezionata singolarmente (200/confezione)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti trattata per coltura tissutale Biolite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti trattata Biolite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piatto da 6 cm trattato con coltura tissutale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Millex Siringa Sterile Filtro PVDF Dimensione dei pori: 0,22 &; m</td><td>Thermo Fisher Scientific SLGV033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TipOne puntali per pipette con filtro 0,1 - 10 &mu; l puntale filtrante allungato</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette filtranti TipOne 1 - 20 &mu; l puntale filtrante</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette filtranti TipOne 1 - 200 &mu; l&nbsp; puntale con filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette con filtro TipOne 101 - 1000 &mu; l puntale filtrante</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 ml sterili 20 buste da 25 provette (500 provette)</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml sterili 20 bustine da 25 provette (500 provette)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

avvio di differenziazione in cellule multipotenti immortalizzate otic progenitrici

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

L'uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) o cellule staminali embrionali (ESC) per terapie di sostituzione cellulare è molto promettente. Diverse limitazioni, tra cui basse rese e popolazioni eterogenee di cellule differenziate, ostacolano il progresso delle terapie con cellule staminali. È stata generata una linea cellulare di progenitori otici multipotenti immortalizzati (iMOP) a destino limitato per facilitare la differenziazione efficiente di un gran numero di cellule ciliate funzionali e neuroni gangliari spirali (SGN) per terapie di sostituzione delle cellule dell'orecchio interno. A partire da colture dissociate di singole cellule iMOP, sono stati descritti protocolli che promuovono l'uscita dal ciclo cellulare e la differenziazione mediante prelievo del fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF). Una significativa diminuzione delle cellule proliferanti dopo la sospensione del bFGF è stata confermata utilizzando un saggio di proliferazione cellulare EdU. In concomitanza con una diminuzione della proliferazione, il successo della differenziazione ha portato all'espressione di marcatori molecolari e cambiamenti morfologici. L'immunocolorazione di Cdkn1b (p27KIP) e Cdh1 (E-caderina) nelle otosfere derivate da iMOP è stata utilizzata come indicatore per la differenziazione negli epiteli sensoriali dell'orecchio interno, mentre l'immunocolorazione di Cdkn1b e Tubb3 (β-tubulina neuronale) è stata utilizzata per identificare i neuroni derivati da iMOP. L'uso di cellule iMOP fornisce uno strumento importante per comprendere le decisioni sul destino cellulare prese dai progenitori neurosensoriali dell'orecchio interno e aiuterà a sviluppare protocolli per la generazione di un gran numero di cellule ciliate derivate da iPSC o ESC e SGN. Questi metodi accelereranno gli sforzi per la generazione di cellule otiche per le terapie sostitutive.

bFGF Ritiro Decrementi proliferazione in cellule IMOP Per diminuire la capacità proliferativa delle cellule IMOP e avviare la differenziazione delle cellule IMOP, bFGF è stato ritirato dalle culture. Per confermare che il fattore di crescita ritiro diminuisce la proliferazione, EdU incorporazione è stato impiegato come un saggio di proliferazione. La percentuale di cellule che incorporava EdU da otospheres col...

Vengono descritti gli attuali protocolli per mantenere le cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate (iMOP) e la differenziazione otica. Vengono evidenziate le condizioni di coltura e i marcatori molecolari che indicano la differenziazione in epiteli sensoriali e neuroni gangliari spirali (SGN).

Avvio di differenziazione in cellule multipotenti immortalizzate Otic progenitrici

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di differenziare le cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate in tipi di cellule dell'orecchio interno. Quindi questo metodo può aiutarci ad affrontare domande chiave nella rigenerazione uditiva, come ad esempio come i progenitori otici possono diventare cellule ciliate cocleari o neuroni uditivi. È importante sottolineare che questa tecnica fornisce un sistema cellulare in vitro che può essere utilizzato in parallelo con sistemi modello di mammiferi animali in vivo.A dimostrare la procedura oggi saranno Azadeh Jadali, una borsista post-dottorato nel mio laboratorio, così come Zhichao Song e Alejandra Laureano, due studenti laureati nel laboratorio. Dopo aver preparato il terreno di coltura come descritto nel protocollo di testo, utilizzare tre millilitri di questo liquido per piastrare, da dieci a sesto, il progenitore multipotente immortalizzato, o cellule IMOP, in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri. Incubare le cellule per cinque-sette giorni a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica.A giorni alterni, raddoppia il volume del liquido nella coltura aggiungendo terreno fresco. Per far passare le cellule, trasferirle prima dal piatto di coltura a una provetta conica da 15 millilitri. E poi posiziona il tubo, a 37 gradi Celsius, per cinque-dieci minuti.Durante questo periodo, aspettatevi che le otosfere formanti colonie si raccolgano sul fondo del cono attraverso la sedimentazione per gravità. Successivamente, aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare la tavolozza. Risospendere le otosfere aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione salina bilanciata con EDTA (HBSS) preriscaldata e preriscaldata precedentemente preparata, quindi pipettando su e giù due o tre volte.Per facilitare la dissociazione delle otosfere in singole cellule, posizionare la conica in un incubatore a 37 gradi Celsius. Agitare periodicamente la soluzione e quando non si osservano otosfere come sedimenti sul fondo del tubo, spostarla a temperatura ambiente. Procedere con l'aggiunta di due millilitri di terreno di coltura alle cellule per neutralizzare l'EDTA.E centrifugateli a temperatura ambiente per cinque minuti a 200 g. Quindi aspirare la soluzione di EDTA diluita e lavare le cellule in cinque millilitri di 1x PBS. Dopo aver fatto girare le celle utilizzando le stesse impostazioni, aspirare il PBS 1x.Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura alla conica. E risospendere la tavolozza delle celle. Per il conteggio, diluire le cellule IMOP da una a cento in terreno di coltura.Quindi aggiungere 75 microlitri di questa soluzione in una cassetta posizionata in un contatore di particelle microfluidiche e determinare il numero di cellule. Successivamente, piastrate una volta dieci o le sesta cellule IMOP in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri come descritto in precedenza e ripetete questa procedura di passaggio ogni cinque-sette giorni. Tre giorni dopo la placcatura, utilizzare la sedimentazione per gravità per raccogliere le otosfere come mostrato in precedenza.Procedere all'aspirazione del surnatante. E risospendere delicatamente le cellule in due millilitri di terreno di differenziazione epiteliale sensoriale. Quindi utilizzare una pipetta a pori larghi da dieci millilitri per trasferire le otosfere in un nuovo piatto da 60 millimetri.Differenziare le otosfere per dieci giorni. Aggiunta di due millilitri di terreno di differenziazione fresco alla coltura a giorni alterni. Successivamente, raccogli nuovamente le otosfere attraverso la sedimentazione per gravità.E aspirare il mezzo esaurito. Quindi, fissare le otosfere in paraformaldeide al quattro percento in 1x PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare le cellule in 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton x100.Procedere bloccando le otosfere in 1x PBS integrato con il dieci percento di siero di capra e lo 0,1 percento di Triton x100. Dopo un'ora, sostituire il tampone bloccante con quello contenente l'appropriata diluizione dell'anticorpo Cdkn1b o CDH1. Quindi incubare le cellule in anticorpi primari durante la notte a quattro gradi Celsius.E il giorno successivo continuare l'immunocolorazione utilizzando anticorpi secondari marcati in fluorescenza, falloidina e Hoechst, come descritto altrove. Per prepararsi all'imaging, posizionare il mezzo di montaggio su un vetrino. E poi introdurre le otosfere colorate nel mezzo.Quindi, stendere un vetrino coprioggetti sopra il campione. Dopo aver lasciato asciugare il mezzo di montaggio per una notte a quattro gradi Celsius, posizionare il vetrino sul tavolino di un microscopio invertito dotato di una telecamera CCD a 16 bit. Utilizzando l'obiettivo ad aria 20x 0,75, è possibile acquisire immagini di epifluorescenza raccogliendo dati dai canali blu, verde, rosso e infrarosso.Innanzitutto, pulire i vetrini rotondi di vetro mettendoli in una piastra sterile da 100 millimetri e immergendoli in etanolo al 70%. Agitare delicatamente i vetrini coprioggetti per assicurarsi che siano coperti e lasciare il piatto a temperatura ambiente per dieci minuti. Successivamente, sciacquare i vetrini coprioggetto tre volte in 1x PBS sterile e poi una volta con acqua sterile.Quindi lasciare asciugare i vetrini di copertura esponendoli alla luce UV in una cappa di coltura tissutale per 15 minuti. Per un uso immediato, posizionare un vetrino di copertura sterile in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. E scuotere delicatamente la piastra per assicurarsi che tutti i vetrini coprioggetto siano piatti.Quindi rivestire i vetrini di copertura aggiungendo 0,25 millilitri di 1x PBS contenente 10 microgami per millilitro di poli-D lisina a ciascun pozzetto. Dopo che la piastra è stata incubata per un'ora a 37 gradi Celsius, rimuovere la soluzione di poli-D lisina e lavare i pozzetti tre volte con 1x PBS sterile. Una volta aspirato il liquido dell'ultimo lavaggio, introdurre 0,25 millilitri di 1x PBS contenente 10 microgrammi per millilitro di Laminina, in ciascuno dei 24 pozzetti.Dopo aver incubato la piastra per una notte a 37 gradi Celsius, aspirare la soluzione di Laminina, quindi lavare ogni pozzetto con un millilitro di 1x PBS tre volte, ma lasciare il PBS dell'ultimo lavaggio nei pozzetti fino a quando le cellule non sono pronte per essere piastrate. Per iniziare la differenziazione neuronale, contare le cellule dalle otosfere dissociate come descritto in precedenza. E poi risospenderli in un mezzo di differenziazione neuronale preriscaldato.Procedere seminando tra uno e un punto cinque volte dieci alla quinta cella IMOP in ciascun pozzetto della piastra contenente i vetrini di copertura rivestiti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, con il cinque percento di anidride carbonica. Sostituzione del mezzo di differenziazione neuronale a giorni alterni.Dopo sette giorni, aspirare il terreno e fissare le cellule, che dovrebbero essere attaccate ai vetrini coprioggetti, aggiungendo il quattro percento di formaldeide in ciascun pozzetto. E lasciandoli per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la formaldeide e lavare le cellule una volta in 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton x100.Quindi rimuovere il tampone di lavaggio. E aggiungi un tampone bloccante composto da 1x PBS contenente il dieci percento di siero di capra normale e lo 0,1 percento di Triton x100 a ciascun pozzetto. Lasciare le celle per un'ora a temperatura ambiente.Quindi rimuovere il liquido e sostituirlo con un tampone bloccante contenente l'appropriata diluizione dell'anticorpo Cdkn1b o Tubb3. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, lavare le cellule una volta con 1x PBS contenente l'uno per cento di Triton x100. E poi procedere con l'immunocolorazione come descritto in precedenza.Dopo che la colorazione è stata completata, eseguire un lavaggio finale aggiungendo 1x PBS ai pozzetti. Per prepararli per l'analisi, rimuovere i vetrini di copertura a cui sono attaccate le cellule colorate dalla piastra a 24 pozzetti. E posizionarli su un supporto di montaggio su un vetrino.Dopo aver lasciato asciugare il mezzo di montaggio per una notte a quattro gradi Celsius, acquisire immagini di epifluorescenza come descritto in precedenza. Le otosfere coltivate per dieci giorni in terreno di differenziazione epiteliale dimostrano un aumento dell'espressione di Cdkn1b, un inibitore della chinasi ciclico-dipendente e marcatore per il differenziamento dell'orecchio interno, rispetto alle cellule indifferenziate. Qui la colorazione di Hoechst ha notato nuclei cellulari.Queste cellule mostrano anche cambiamenti morfologici nei filamenti di actina e nelle regioni di adesione cellula-cellula caratteristiche degli epiteli. Indicato dalla comparsa di falloidina e marcatura Cdh1 alle periferie cellulari. Le otosfere possono anche essere dirette a formare neuroni.Questa immagine in campo chiaro mostra che dopo sette giorni nel mezzo di differenziazione neuronale, le cellule IMOP mostrano neuriti. L'immunocolorazione di queste cellule con un marcatore neuronale Tubb3 conferma la loro differenziazione. Ed esprimono anche in modo robusto Cdkn1b.Ciò suggerisce che il doppio segnale Tubb3, Cdkn1b può essere utilizzato come indicatore della differenziazione neuronale nelle cellule IMOP. Anche le cellule differenziate e indifferenziate a fluorescenza di Cdkn1b sono state normalizzate determinando il suo rapporto con il segnale di Hoechst, fornendo risultati quantitativi. Gli istogrammi di questi dati sono mostrati qui.In questi grafici sono presentate le percentuali di cellule IMOP indifferenziate e differenziate al di sopra di una soglia predeterminata di Cdkn1b normalizzato. Entrambe le popolazioni differenziate dimostrano un aumento significativo della percentuale di cellule che esprimono Cdkn1b rispetto ai controlli indifferenziati, confermando la differenziazione suggerita dall'immunofluorescenza. Una volta padroneggiata, la coltura di routine e la differenziazione delle cellule IMOP possono essere eseguite in 30 minuti, se eseguite correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare la differenziazione delle cellule IMOP. Grazie per aver guardato questo video. E buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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